제브라피시 배아(zebrafish embryos)에서 일차 망막 신경절 세포 배양 생성

배아 배지에서 초기 발달 단계 제브라피쉬 배아로 시작합니다.

배아를 둘러싼 보호막인 융모막을 제거하고 배아를 배지가 들어 있는 신선한 배양판으로 옮깁니다.

배아의 꼬리 부분을 제거한 다음 머리를 분리하고 머리에서 눈을 부드럽게 분리합니다.

눈에는 망막 신경절 세포를 수용하는 얇은 조직층인 망막이 있습니다.

제브라피쉬 세포 배양 배지가 들어 있는 튜브로 눈을 옮깁니다.

눈을 기계적으로 해리시켜 망막 신경절 세포를 방출하고 단일 세포 현탁액을 형성합니다.

제브라피쉬 배양 배지가 들어 있는 배양 플레이트에 커버슬립을 가져 가십시오.

커버슬립은 합성 고분자와 접착 단백질로 코팅되어 있습니다.

세포를 커버슬립의 중앙으로 옮기고 배양합니다.

망막 신경절 세포는 코팅된 표면에 부착되며, 더 나아가 이 세포는 축삭이라고 하는 긴 돌출부를 발달시킵니다.

인큐베이터에서 제브라피쉬 배아를 꺼내 70% 에탄올이 함유된 35mm 조직 배양 접시에 배아를 5-10초 동안 담가 멸균합니다. 이송 피펫을 사용하여 배아를 멸균 E2 배지가 들어 있는 E2 배지 #1 접시로 옮겨 과도한 에탄올을 씻어냅니다. 그런 다음 배아를 E2 Media #2 접시로 옮기고 날카로운 집게로 융모막을 제거합니다. 마지막으로 배아를 E2 배지 #3 접시로 옮겨 해부를 수행합니다.

한 쌍의 미세한 집게를 사용하여 집게 중 하나로 배아를 난황 앞쪽에 배치하고 고정하고 다른 집게로 난황낭 뒤쪽의 꼬리를 제거합니다. 집게로 목을 잡고 머리를 벗겨 뇌와 눈을 E2 매체에 노출시킵니다. 가는 집게 끝을 사용하여 두 번째 집게로 두개골 조직을 누르면서 머리에서 눈을 부드럽게 굴립니다. ZFCM+가 포함된 이전에 준비된 튜브 중 하나로 네 개의 눈을 옮깁니다.

P20 피펫으로 약 45회 위아래로 부드럽게 분쇄하여 세포를 해리시킵니다. 해리된 세포가 있는 ZFCM+를 커버슬립의 중앙으로 옮깁니다. 진동을 흡수하기 위해 폴리스티렌 폼 랙 위의 벤치탑에서 섭씨 22도의 배양물을 유지합니다. 이미징 당일 현미경으로 세포를 확인하여 RGC 축삭의 성장을 확인합니다.