Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

이 절차의 전반적인 목표는 형광 단백질 또는 바이오센서의 실시간 이미징이 필요한 실험을 위해 새로운 제브라피시 망막 조각을 준비하는 것입니다. 이 방법은 망막 내의 특정 세포 유형 및 세포 구획에서 칼슘 이온의 생리학적 및 대사적 역할과 같은 시력 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 조직의 주요 대사 산물 및 신호 분자에 대한 공간적 및 시간적 정보를 제공한다는 것입니다.

제브라피시에서 망막 색소 상피(RPE)를 제거할 수 있도록 조직 조각을 만들기 전에 한 시간 동안 물고기를 어둡게 적응시킵니다. 슬라이싱 챔버의 경우 슬라이드에 매니큐어 라인을 칠합니다. 투명한 매니큐어를 사용하여 좁은 선을 칠하여 직사각형을 만듭니다.

건조되면 광택제를 한 번 다시 칠하십시오. 챔버가 정적 이미징 또는 최소한의 용액 흐름으로 주입 실험에 사용되는 경우 주사기를 사용하여 길이 1cm, 0.5cm 간격의 커버슬립에 평행한 두 개의 바셀린 스트립을 도포합니다. 이제 블레이드를 준비합니다.

먼저 양날 면도기에 에탄올을 바르고 자연 건조시킵니다. 그런 다음 가위를 사용하여 약 1cm 조각으로 자릅니다. 다음으로, 슬라이싱 챔버를 조직 슬라이서의 스테이지에 놓고 스테이지의 수평 중앙에 놓고 긴 가장자리에 정렬을 위한 영구 마커로 표시합니다.

그런 다음 슬라이서 암에 칼날 조각을 로드합니다. 가장자리가 슬라이드 중앙을 넘고 슬라이드 표면과 평행을 이루지만 매니큐어에 닿지 않도록 블레이드를 고정합니다. 그런 다음 1/4 회전을 사용하여 블레이드 암을 내립니다.

이제 여과지를 잘라 보십시오. 필요한 경우 블레이드를 다시 장착합니다. 계속 진행하려면 주사기를 사용하여 중간 지점에서 약 1.5cm 떨어진 10cm 접시에 작은 젤리 점 하나를 넣습니다.

그런 다음 집게를 사용하여 커버슬립의 마른 면을 젤리에 밀어 넣습니다. 다음으로, 이미징 챔버의 입구 가장자리에서 약 1cm 떨어진 곳에 또 다른 작은 젤리 점을 놓습니다. 이제 20 게이지 바늘을 사용하여 약 1cm 떨어진 슬라이싱 챔버의 중심을 따라 세로로 1cm 길이의 얇은 평행 스트립 2개를 만듭니다.

그런 다음 제브라피시를 접시에 옮기고 참수 없이 물고기를 자궁경부로 탈구시킵니다. 이제 와이어 루프를 사용하여 한쪽 눈 주위의 결합 조직을 느슨하게 한 다음 눈을 부드럽게 앞으로 당깁니다. 다음으로 마이크로 가위를 사용하여 눈 아래의 백색 시신경을 조심스럽게 자르되 눈 뒤쪽은 자르지 마십시오.

계속 진행하려면 얼음 위에 차가운 Ringer's 용액이 담긴 접시로 눈을 옮기십시오. 그런 다음 다른 쪽 눈을 채취합니다. 모든 RPE가 제거될 때까지 빨간색 표시등에서 계속 작업합니다.

다음으로, 페트리 접시의 유리 슬라이드에 있는 차가운 Ringer 용액 한 방울에 한쪽 눈을 옮깁니다. 그런 다음 접시를 저전력 해부 현미경 아래에 놓고 적색광 아래에서 안구컵을 해부합니다. 먼저 가는 집게로 각막을 뚫습니다.

그런 다음 집게와 가위를 사용하여 투명하고 부서지기 쉬운 각막과 은빛 공막 조각을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 렌즈와 대부분의 공막을 제거하여 아이컵을 분리합니다. 최소한의 취급으로 망막을 제거하지 않고 아이컵에 붙어 있는 지방 조각과 공막을 제거합니다.

망막이 RPE에서 분리되면 섬세한 망막이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오. 이제 열린 면이 아래로 향하도록 아이컵을 재배치하고 새 칼날로 3등분 또는 4등분합니다. 너무 구부러져 평평하게 펴지지 않는 아이컵 조각은 버리십시오.

이러한 조각은 종종 너무 작아서 어떤 경우에도 유용하지 않습니다. 망막 단면을 장착하려면 여과지 조각에 Ringer의 용액을 적시고 평평한 집게를 사용하여 아이컵 조각 옆에 놓습니다. 그런 다음 여과지와 티슈를 차가운 Ringer의 용액에 담그십시오.

다음으로, 겸자를 사용하여 RPE와 광수용체를 위로 향하게 하여 여과지 위에 망막 조각을 놓습니다. 아이컵 조각의 가장자리를 가는 집게로 부드럽게 다루어 여과지 중앙에서 한 줄로 방향을 잡습니다. 이제 집게를 사용하여 망막이 부착된 여과지를 들어 올리고 마른 종이 타월 위에 올려 망막을 평평하게 만듭니다.

약 3초 동안 종이 타월로 액체를 흡수하는 힘으로 망막을 평평하게 만듭니다. 이런 식으로 모든 망막 조각을 처리하고 건조하지 않도록 하십시오. 이제 Ringer의 용액을 한 방울 떨어뜨리고 가는 집게를 사용하여 조직에 남아 있는 검은색 RPE 시트를 벗겨냅니다.

부드럽게 껍질을 벗기고 망막이 종이에서 들어 올려지면 이전과 같이 더 많은 용액을 심지로 흡수하면 다시 평평해질 것입니다. 이제 망막 조각이 있는 종이를 슬라이드로 옮기고 종이를 직사각형으로 자르고 조직 행의 양쪽에 약 0.5cm를 남겨둡니다. 그런 다음 여과지를 준비된 슬라이싱 챔버로 옮깁니다.

집게를 사용하여 긴 여과지 가장자리를 얇은 바셀린 라인에 밀어 넣은 다음 차가운 Ringer's 용액 3-4방울에 망막을 담그십시오. 먼저 제제를 조직 슬라이서 스테이지로 옮깁니다. 표시된 선을 따라 긴 가장자리를 배치하고 실험실 테이프로 챔버 끝을 스테이지에 고정합니다.

그런 다음 한쪽 끝에서 시작하여 슬라이싱 암을 단단하고 부드러운 압력으로 망막과 여과지를 자릅니다. 첫 번째 슬라이스가 완전히 절단되었는지 확인한 다음 마이크로미터를 사용하여 약 400미크론 두께의 슬라이스를 자릅니다. 다음으로, 슬라이스된 섹션이 있는 챔버를 이미징 사다리 역할을 할 준비된 커버슬립이 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다.

접시에 차가운 Ringer's solution을 가득 채우고 해부 현미경의 무대에 놓습니다. 이제 저배율에서 집게를 사용하여 스트립을 고정하고 아래에 있는 페트리 접시를 밀어 이미징 사다리로 이동합니다. 슬라이스를 90도 회전하고 여과지 가장자리를 젤리에 묻습니다.

망막을 물에 잠기게 하고 망막과 직접 접촉하지 않는 것이 중요합니다. 다음으로, 망막 층이 명확하게 보이도록 사다리에서 슬라이스를 재배치합니다. 사다리의 양쪽 끝에 있는 절편의 경우 망막이 다른 절편을 향해 안쪽을 향하도록 하여 주입 또는 흐름 중 움직임을 최소화합니다.

종이에 잘 붙지 않는 조각은 버리십시오. 이제 조직을 염색하십시오. 한편, 이미징 챔버와 주입 장치를 준비합니다.

먼저 기포가 남지 않을 때까지 Ringer의 용액으로 튜브를 세척합니다. 그런 다음 튜브를 이미징 챔버 주입구에 부착하고 스톱 콕을 닫습니다. 그런 다음 주사기에 주입 용액을 다시 채우고 튜브에 다시 부착합니다.

이제 겸자를 사용하여 준비된 이미징 래더를 이미징 챔버로 옮깁니다. 입구 가장자리 근처의 젤리 점으로 누르고 챔버를 Ringer의 용액으로 채워 슬라이스를 덮습니다. 그런 다음 이미징을 진행합니다.

설명된 기술을 사용하여 완벽하게 횡단된 슬라이스를 모든 망막층을 통해 이미지화할 수 있습니다. 약간 회전하면 바깥쪽 세그먼트의 번들이 표시됩니다. PI 염색을 사용하면 분석에서 죽은 세포를 제거할 수 있습니다.

건강한 PI 음성 광수용체는 정형화된 편광된 길쭉한 형태를 가지고 있습니다. 산소가 공급된 Ringer's에 있을 때 최대 4시간 동안 이미지화할 수 있습니다. 한 가지 이미징 전략은 핵에 대한 원뿔 광수용체 소포체의 역학을 시각화하는 것입니다.

GFP와 원뿔 ER을 발현하는 조직을 사용하면서 핵 염료로 대조염색합니다. GFP 융합 액틴을 발현하는 조직으로 액틴 세포골격을 보기 위해 유사한 전략을 사용할 수 있습니다. 타임 랩스 이미징을 사용하여 원뿔 광수용체의 세포질 칼슘 변동과 같은 세포 역학을 관찰할 수 있습니다.

예를 들어, 이미징 챔버에서 나트륨을 등장음파로 고갈시키는 동안 GCaMP는 증가하는 세포질 칼슘 농도를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 원뿔 외부 분절, 세포체 및 시냅스로부터의 형광 반응을 정량화함으로써, 약리학적 조작 등을 하는 동안 세포 내 칼슘 역학을 측정할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 RPE가 제거되기 전에 빨간색 표시등을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

자르기 전에 아이컵을 조심스럽게 평평하게 펴고 슬라이스를 항상 물에 담그십시오. 일단 숙달되면 조직 해부, 슬라이스 및 이미징 준비를 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포 구획의 특정 세포 유형에서 신진대사 및 생리학을 연구하기 위해 제브라피시의 망막 절편을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.