Name: Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 학습하세요 성인 제브라피시 망막 조각을 준비하여 살아있는 형광 바이오센서 이미징을 수행하는 방법을. 이 기술은 망막 세포 내 칼슘 이온 역할을 연구하는 데 필수적인 시공간 정보를 제공합니다.

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우리 감사 랄 프 넬슨과 다니엘 Possin 안정적인 유전자 변형 zebrafish 라인의 세대를 위해이 프로토콜, 그리고에 바 Ma, 애슐리 조지 게 일 스탠 튼을 개발 하면서 생각 지도. 일 밀리, 밀리, 화장실을 NIH 네이 5T32EY007031에 NSF GRFP 2013158531 고 재 혁 고 S.B. EY026020에 의해 지원 되었다

모든 동물 실험 워싱턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.
1. 동물 및 장비 준비
참고: 망막 안료 상피 (RPE) 조직의 그 염색 망막 기능을 어둡게 하 고 때 ex vivoimaging confocal 조직을 손상 수 망막의 외부를 둘러싼 어두운 시트입니다. 어둠 속에서 zebrafish의 RPE 망막;에서 제거 됩니다. 어두운 자국과 이미징 하기 전에 망막에서 RPE의 미래 제거를 촉진 하기 위하여 물고기를 적응.
<ol><li>물고기 산란 탱크 물고기 물으로 채워진 전송 다음 어두운 직물 산란 탱크 포장 또는 어두운 캐비닛에.<ol>
<li>다크 zebrafish 망막에서 완전 한 분리는 RPE에의 가까이 있도록 안락사 전에 적어도 1 시간에 대 한 적응. 30 분 어둠 적응은 그것의 대뇌 사이 삽입 된 남아 있을 수 있습니다 하지만 대부분 RPE 제거 충분 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>녹아 ~ 석유의 15 mL 뜨거운 접시에 50 mL 비 커에서 젤리와 다음 3 mL 슬립 팁 주사기로 액체의 3 mL을 그립니다. 주사기를 반전 테스트 튜브 랙에 놓고 석유 젤리 냉각 허용 합니다.</li>
	<li>일반 7 cm X 2.5 cm 현미경 슬라이드에 다시 사용할 수 있는 조각화 챔버를 확인 합니다.<ol>
<li>투명 매니큐어, 슬라이드의 센터에서 3 cm X 2.5 cm의 사각형을 만드는 페인트 좁은 라인을 사용 하 여 건조, 그것을 허용 하 고 라인에 매니큐어의 또 다른 레이어를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미징 동안 분할 영역을 커버 슬립에 이미징 사다리를 준비 합니다. 슬라이스는 사다리의 "가로 대"를 형성 합니다.<ol>
<li>정적 이미징 또는 최소한의 솔루션 흐름 주입 실험, 석유 젤리 사다리 18 m m 사각 유리 커버 슬립에 석유 젤리의 2 개의 넓은 평면 병렬 스트립의 구성 된 확인 합니다. 주사기를 사용 하 여 평평 하 게 두 ~ 냉각된 석유 젤리 커버 슬립에 떨어져 0.5 cm의 1 cm 긴 얼룩.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 기계 준비.<ol>
<li>에탄올과 더블 가장자리 면도기 블레이드 깨끗 하 고 건조 공기를 허용. 그것은 분기에가 위, 먼저 세로로 잘라 반으로 다음 각 블레이드 건너.</li>
		<li>조각화 챔버 조직 슬라이서의 무대에서 무대에서 가로로 가운데 놓고 긴 가장자리 정렬에 대 한 영구 표시와 함께 표시 합니다.</li>
		<li>조직 기계 팔에 블레이드 섹션을 로드, 블레이드 거짓말 평평 하 고 가운데는 슬라이드에는 매니큐어를 건드리지 않고 확인 다음 부드럽게 블레이드 기구를 강화 합니다. 낮은 ¼ 노브를 조정 하 여 블레이드 팔 차례, 이미징 챔버의 테스트 센터에 필터 종이의 스크랩 잘라 다음 장소. 종이 되지 극복 된다 완전히, 블레이드를 다시 탑재.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 cm 배양 접시에서 냉각된 석유 젤리의 하나의 작은 점 배치는 주사기를 사용 하 여 ~ 1.5 c m는 센터의 오른쪽에. 향하도록 하는 석유 젤리와 집게를 사용 하 여 이미징 사다리를 누릅니다. 또 다른 작은 석유 젤리 도트 만들기 ~ 이미징 챔버의 입구 가장자리에서 1 cm.</li>
	<li>석유 젤리 주사기 20 g 바늘으로 적합 하 고 그것을 벗기다. 주사기에 바늘 누른 조각화 챔버의 중앙에 세로로 두 1 cm 긴 얇은 병렬 스트립 석유 젤리의를 만들기 위해 그것을 사용 합니다. 지구 공간 ~ 1 c m 간격.</li>
	<li>중심을 포장 하 여 재사용 가능한 와이어 눈 루프 도구를 만들기는 ~ 4 cm 세그먼트의 한 쌍의 주위 30 g 텅스텐 와이어 집게 한 번 단단히 폐쇄. 때까지 zebrafish 눈 보다 약간 더 크게 일반적으로 와이어는 집게를 위아래로 슬라이딩 하 여 루프의 직경 조절 ~ 2-3 m m. 트위스트 와이어 끝 그리고 실험실 테이프를 사용 하 여 6 cm 나무 막대기의 끝에 그들을 보호.</li>
	<li>벨의 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>보충 재고 솔루션 (표 1) X 50을 해 동 하 고 실험;의 아침 신선한 HEPES-버퍼링, 비 조 벨의 솔루션 (표 2)에 추가 원뿔 원심 분리기 관 또는 무 균 병에 벨의 솔루션의 모든 10 mL에 보충 재고 솔루션의 200 µ L를 희석. 정적 이미징 실험을 위해 적어도 30 mL 실험 당 벨의 솔루션의 준비. 벨의 솔루션 관류 실험에 필요한 양의 흐름 속도 총 실험 시간에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>확인 보충된 솔루션의 pH 7.4 디지털 pH 프로브 또는 pH 종이 사용 하 여이 고 조정 따라와 희석 NaOH 또는 HCl.</li>
		<li>얼음에 보충된 벨의 솔루션 표준 의료 산소 탱크와 호스를 장착 하는 레 귤 레이 터를 사용 하 여 적어도 5 분 동안 100% 산소 가스와 버블링 하 여 산소 또는 선택적 가스 bubbler 매니폴드 관류에 대 한 사용. 얼음 봉인된 원뿔 원심 분리기 관 또는 해 부 현미경; 근처 살 균 유리병에 산소 벨의 솔루션을 저장 이 솔루션을 사용 하 여 이미징, 해 부에 대 한 염료 또는 약리 에이전트 희석.</li>
		<li>다른 솔루션은+같은 실험에 사용 되는 경우-무료 벨소리의 솔루션 (표 3), 반복 단계 1.9.1.-1.9.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>해 부 현미경, 근처 다른 도구, 마이크로-가 위, 집게, 접시를 수집 하 고 물고기 물 얼음 목욕 zebrafish 안락사에 대 한 준비.</li>
</ol>2. 망막 조각 ( 그림 1참조)를 준비
<ol><li>터치 응답 손실 됩니다 때까지 빨간 주변광 (만들 수 있는 RPE 스틱 더 긴밀 하 게 망막에) 빛 적응을 최소화 하기 위해 아래 작업 얼음 목욕에 침수에 의해 제 브라를 안락사, 일반적으로 1-2 분 페 트리 접시에 생선을 전송 하는 메스를 사용 하 여 cervically 탈 구 하지만 하지 물고기를 목을 벨.</li>
	<li>한쪽 눈 주위 결합 조직 완화 와이어 루프를 사용 하 고 한 손으로 루프와 부드럽게 눈 앞으로 당겨. 다른 한편으로는에서 마이크로-가 위를 사용 하 여 눈, 눈의 뒤쪽을 절단 하지 않도록 주의 복용 아래 흰색 시 신경 절단.</li>
	<li>눈 얼음, 차가운 벨의 솔루션의 페 트리 접시에 집게를 사용 하 여 전송 하 고 두 번째 눈에 대 한 반복 합니다. RPE 망막에서 제거 될 때까지 붉은 빛 또는 어둠 속에서 눈 유지.</li>
	<li>차가운 벨의 솔루션 페 트리 접시에 일반 유리 슬라이드에 한 방울에 낮은 전력 해 부 현미경 eyecups 해 부.<ol>
<li>각 막 미세 집게와 피어스 다음 지우기, 부드럽게 제거 취 성 막과 집게와가 위는 빛 sclera. 제거 하 고 렌즈와는 공 막의 대부분을 삭제 ( 그림 1A참조), 최소한 고립 된 아이피를 처리.</li>
		<li>지방, sclera, 그리고 검은 RPE의 작은 비트의 조각에서 아이피에 연결 된 남아 있을 수 있습니다 고 나중 망막에서 제거. 망막 분리 단계 2.4.1에서에서 RPE에서, 만약 하지 섬세 한 고립 된 망막 손상에 여분의 주의 사용 하 여 같은 단계 진행.</li>
		<li>(최대 RPE) 아래로 아이피 오픈 사이드 슬라이드에 놓고 3 분 또는 분기 한 모션에 신선한 단일에 지 면도날으로 잘라 ( 그림 1B를 참조). 높은 곡선 조직의 조각을 삭제 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>필터 종이에 평면 마운트 망막<ol>
<li>벨의 솔루션 필터 종이 습식 및 슬라이드 아이피 조각 옆에 배치. 그것을 puncturing 피하기 위해 플랫 집게 그대로 젖은 필터 종이 처리할 때 사용 합니다. 필터 종이 및 조직 추운 벨의 솔루션을 추가 합니다.</li>
		<li>RPE와 위로 향하도록, 즉 위로 향하도록 하는 눈의 뒤를 가진 대뇌 각 아이피 조각 아래 필터 종이 또한 신중 하 게 각 손에 집게를 사용 하 여, 있습니다. 필터 종이의 중앙에 따라 한 줄에 아이피 조각 위치 ( 그림 1C참조). 모서리 또는 코너 근처만 잘 집게와 아이피 조각을 부드럽게 처리 합니다.</li>
		<li>3 건조 종이 타월에 젖은 필터 종이 필터 종이에 고착 하는 망막을 하려면 배치 하향, 수 분을 심지 하지만 그나마 s 조직 되 고 건조 하 게. 필터 종이에 평평 거짓말 아이피 조각 때까지 반복 합니다. 망막, 평평 하 게 하는 데 도움이 필터 종이의 밑면에 부드러운 흡입을 적용 하지만이 단계는 필수적입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RPE의 검은 시트 아이피 조각에 남아 있으면 미세 집게를 사용 하 여 부드럽게 껍질을 멀리 하나에서 시작 하는 조직 방울 벨의 솔루션에에서 앉아있는 동안 ( 그림 1D참조) 코너. 한다 망막 필터 종이, 반복 2.5.3에 wicking 단계 리프트. 망막은 표백된 시각적인 안료 인 핑크 나타날 수 있습니다.</li>
	<li>망막 해 부와 평면 추운 벨의 솔루션에 첫 번째 플랫 탑재 망막을 유지 필요한 경우 2.4-2.6 두 번째 눈에 대 한 단계를 설치를 반복 합니다. 조각화 절차 간소화, 하 두 망막의 한 필터 종이에 삽입할 수 있습니다. RPE 제거 되었습니다 일단 프로토콜 수 실시 일반 방 조명 아래 실험 어둠을 필요로 하지 않는 한.</li>
	<li>슬라이드에 필터 종이 놓고 떠나 단일에 지 면도날, 사각형으로 잘라 ~ 망막의 라인의 양쪽에 필터 종이 0.5 c m. 필터 종이 준비 조각화 약 실에, 집게를 사용 하 여 얇은 석유 젤리 라인으로 긴 필터 종이 가장자리를 밀어 이동한 3-4 방울 찬 벨소리 솔루션에서에서 망막을 담가 합니다. 참고: 일부 염료, 닥터지 염료 등 최고의에 로드 됩니다 평면 마운트 부 러 뜨 리 하기 전에이 단계에서. 이러한 로드, 조직, 멀리 사악 고 조각화 챔버에 씻어. 예를 들어, C12 558/568 BODIPY 달아 망막 하지 얼룩 세포 막 및 포토 리셉터 외부 세그먼트 ( 그림 4A참조)에 로드 될 때 ~ 5 µ g/mL 실내 온도 (일반적으로 23-27 ° C)에서 15 분 뒤에 초과 벨의 해결책에서 세척 .</li>
	<li>조직 슬라이서 단계로 조각화 챔버를 전송, 표시 된 선 따라 긴 가장자리에 위치 하 고 보안 챔버 실험실 테이프와 함께 무대에 끝납니다. 망막 및 조각화 팔에, 부드러운 압력을 사용 하 여 필터 종이 잘라 한쪽 끝에서 시작. 첫 번째 조각 잘 렸 지 완벽 하 게, 확인 다음을 사용 하 여는 마이크로미터 잘라 ~ 400 µ m 조각.</li>
	<li>이미징 사다리를 조립 한다.<ol>
<li>자리 단계는 영상에 인접 한 1.7에서 페 트리 접시에 썰어 망막 섹션 조각화 챔버 사다리 ( 그림 1E참조). 그 내용을 잠수함 추운 벨의 솔루션 접시를 채우십시오.</li>
		<li>집게를 사용 하 고 조각 빠져들 유지, 부드럽게 전송 필터 종이 망막의 스트립 사다리 오른쪽 왼쪽에서 페 트리 접시를 밀어. 직접 망막을 건드리지 않도록 주의. 조각 회전 90 ° 고 필터 종이 가장자리 석유 젤리에 매장.</li>
		<li>정밀 하 게 위치 망막 조각 사다리에 집게와 망막 레이어 해 부 현미경 아래에서 명확 하 게 볼 수 있습니다 ( 그림 1G참조). 사다리의 각 끝에 조각, 사출 또는 흐름 동안 조직의 움직임을 최소화 하기 위해 다른 조각으로 조직 안으로 직면 확인 합니다. 잘 되지 않은 어떤 망막 분할 영역 삭제 필터 종이 준수 ( 그림 2A참조).</li>
	</ol></li>
	<li>원하는 경우이 단계에서 망막 조각으로 염료를 로드 하 고 영상 전에 초과 벨의 솔루션에 씻어. 참고: Propidium 요오드 화물 (PI) 및 Hoechst 33342 튼튼하게 얼룩 죽 및 모든 세포의 핵 각각 ( 그림 2B참조), 실 온에서 20 분 동안 5 µ g/mL에서 망막 조각으로 알을 품을 때. Tetramethylrhodamine (TMRM)에 축적 되어 적극적으로 호흡 미토 콘 드리 아의 1 알을 품을 때 망막에 걸쳐 실 온에서 30 분 동안 nM.</li>
	<li>슬라이스는 착 색 하는 동안 이미징 챔버 및 사출 장치를 준비 합니다. 주사기를 사용 하 여 벨의 솔루션 튜브 및 거품 제거, 이미징 챔버 입구 배관의 오픈 엔드 연결할 플러시하고 닫는 자 지. 주사기와 주입, reagent(s) 그것을 채울 다음 튜브를 다시 연결.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 이미징 챔버의 입구 가장자리 근처 석유 젤리의 도트에는 coverslip 누르면 이미징 챔버에 망막 조각과 coverslip 전송 ( 그림 1 H참조). 분할 영역을 커버 하 벨의 솔루션과 이미징 챔버를 채우십시오.</li>
</ol>3. 이미징 망막 조각
<ol><li>똑바로 confocal 현미경 렌즈를 담그고 20 또는 40 X 물 장착의 단계에 연결 된 주입 기구와 이미징 채워진된 챔버를 놓습니다. 보안 단계 클립 이미징 챔버.</li>
	<li>찍기 렌즈, 사다리에 낮은 고 희미 한 트랜스 조명 빛 아래 사다리의 한쪽 끝에 조각에 집중 한다. 각 조각 가로 방향, 포토 리셉터 외부 세그먼트 및 필터 종이에 안전한 접착의 존재를 검사 합니다.</li>
	<li>시간 경과 영상에 대 한 최고의 선택 하 고 시간 경과 이미지 수집을 위한 현미경 소프트웨어를 구성 합니다. 표 4 는 다양 한 형광 마커 및 염료에 대 한 일반적인 이미지 설정을 설명합니다. 참고: 이미지 수집의 속도 현미경, 형광 marker(s), 공부 되 고 생물 학적 과정에 따라 달라 집니다. 예를 들어, GCaMP3와 붉은 염료 대뇌에서 칼슘 역학 이미징에 대 한 800 x 800 픽셀 해상도, 2 µs/픽셀 스캔 속도, 및 10-s 프레임 속도 사용 합니다.<ol>
<li>사용 가능한 경우 슬라이스 (포토 리셉터 외부 세그먼트, 셀 시체, 핵) 시간 경과 하는 동안 잠재적인 재교육 지원에 물리적 랜드마크를 추적 하는 소프트웨어를 사용 합니다. 또한 조각에 걸쳐 실시간으로 형광을 모니터링 하는 소프트웨어를 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미징 시작 하 고 초기 형광을 모니터링 합니다. 조각에 걸쳐 형광 (일반적으로 2-5 분) 안에 안정화, 실험으로 진행. 주입, 주사기 자 지, 다음 천천히 우울 열고 혼합 지원을 두 번 플런저에 다시 그립니다. 참고: 예를 들어, protonophore 이미징 챔버에 1 µ M의 최종 농도 도달 하는 CCCP의 집중된 솔루션을 주입 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 폐지. 이는 강력한 캘리포니아2 + GCaMP에 의해 보고 된 포토 리셉터 cytosol에서 버스트 다음 TMRM에 의해 보고 된 미토 콘 드리 아 막 잠재력에 있는 꾸준한 감소를 유도 합니다.</li>
	<li>밀접 하 게, 실험 기간 동안 드리프트에 대 한 슬라이스를 모니터링 하 고 소프트웨어를 사용 하 여 실제 건축물에 따라 마이크로 조정. 일반적으로 주입 하는 동안 Z-방향으로 드리프트 또는 관류는 < 5 µ m.</li>
</ol>4. 관류 실험 솔루션 변경 또는 지속적으로 흘러 어디 동안 망막 조각 이미징
참고: 망막 이미징 관류 실험 동안 조각 솔루션은 변경 또는 지속적으로 흘러 정적 이미징 또는 주입 실험, 다음 수정에 대 한 설치와 비슷합니다.
<ol><li>석유 젤리 사다리 단계 1.4에서에서 설명한, 대신 sturdier 왁 스 사다리를 사용 하 여 망막 조각 솔루션 흐름 동안 꾸준히 개최.<ol>
<li>Unflavored 치과 왁 스의 2 개의 작은 병렬 실린더 장소 ~ 0.5 c m는 coverslip에 떨어져. 평평한 표면에 엄지 손가락을 사용 하 여 누릅니다 각 실린더는 coverslip의 병렬 가장자리 쪽으로. 둘 다 점수 #1 coverslip 가로로 병합 된 실린더 다음 주걱으로 왁 스 스트립 사이 석유 젤리의 얇은 층을 얼룩 ( 그림 1E, 오른쪽 참조).</li>
		<li>2.10.2 단계에서 이미징 사다리를 어셈블할 때 좋은 집게 (그림 1G)을 사용 하 여 왁 스 점수에 슬라이스 필터 종이 가장자리를 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단계 2.12에서에서 관류에 대 한 설정, preoxygenated 솔루션, 주사기 저수지를 작성 하거나 선택적 가스 매니폴드를 사용 하 여 산소 각 저수지에 솔루션을 합니다. 플러시 벨의 솔루션, 모든 튜브 확인 모든 라인 흐름을 열었을 때 큰 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>단계 2.13에서에서 이미징 챔버를 작성 하기 전에 주사기 사용 하 여 흐름 중 옆으로 미끄러지기에서 그것을 방지 하기 위해 coverslip의 각 노출된 모서리에 놓고 석유 젤리의 다른 점.</li>
	<li>이미징 챔버 가득 현미경 스테이지에 장착 된 경우는 흡 인기 켜고 흡 인기 튜브를 연결. 벨의 솔루션의 흐름을 테스트 하 고는 micropositioner를 사용 하 여 적은 양의 액체 챔버 오버플로 전에 그려지도록는 유출 챔버를 통해 흡 인기 튜브를 놓다 (일반적으로 ~ 2 mL/min 흐름 속도 대 한 솔루션 표면 위에 1 mm). 3.4 단계에서 분할 영역을 선택 하는 동안 흐르는 벨의 솔루션을 계속.</li>
	<li>단계 3.4 관류에서에서 실험을 수행 하는 두 번째 솔루션을 여는 동안 첫 번째 솔루션의 자 지를 폐쇄 하 여 솔루션의 흐름을 전환 합니다.<ol>
<li>예를 들어, 두 개의 주사기 저수지 벨의 솔루션 또는 Na+로 가득 사용 extracellular 나+ 이미징 상공에서 고갈-무료 솔루션 (표 3). 기준선 설정 없음+로 전환 후에 벨의 솔루션 흐름-무료 솔루션. 이 결과 큰 cytosolic 캘리포니아2 + 포토 리셉터 외부 세그먼트 증가 셀 시체 ( 그림 4참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>중력 먹인 관류 시스템 이미징 동안 흐름 속도 상수 이므로 각 저수지에서 솔루션의 수준을 모니터링 합니다. 저수지에서 산소 솔루션 필요에 따라 위쪽 또는 지속적인 산소 가스 매니폴드와 버블링을 유지.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

신선한 zebrafish 망막 조각의 비보 전 영상 포토 리셉터 생물학20,,2122, 공부에 대 한 다양 한 도구를 것을 입증 했다 그리고 고유에서 완전히 성숙, 단일 셀의 분석 수 있습니다. 차별화 된 망막입니다. 연습으로, 망막의 동일한 부분에서 직렬 조각을 사용 하 여 단일 물고기에서 조직으로 여러 실험을 실시 가능 하다. 과제 및 전기 생리학 연구14수 륙 양용 망막 조각의 준비에 관한 제안, 이미징 실험에 대 한 중요 한 고려 사항이 있다.
대뇌, 대 한 세포 생존 능력 일반적으로와 상관 한다 세포 형태학, 그래서는 RPE 제거 된 후에 특히 최소한으로, 섬세 한 망막을 처리 하는 것이 중요 하다. 슬 라이 싱, 후 미세 집게를 사용 하 여 신중...

제 브라 (Danio rerio) 의료 및 기본적인 과학 연구1, 작은 크기, 빠른 개발 및 척추 기관 시스템 때문에 널리 사용 되는. Transgenesis에 대 한 설립된 방법과 결합 zebrafish 애벌레의 자연적인 투명도 살아있는 동물에서 세포 프로세스의 상세한 시각화를 사용할 수 있습니다. 다양 한 유전자 인코딩된 형광 바이오 센서는 감지 캘리포니아2 + 2, 과산화 수소3, apoptotic 활성화4 ATP5특정 zebrafish 셀에 표적이 되었습니다.
Vivo에서 화상 진 찰 zebrafish 애벌레의 신경 과학, 두뇌 회로6 의 매핑 등의 분야에서 혁신을 주도하 고 있다 및 중앙 신경 조직에 대 한 약물 개발 무질서7. Zebrafish는 비전 연구에 적합 그들의 망막 기능 구조 및 더 높은 척추 동물의 신경 종류 그리고 강력한 시각적 동작8,9표시 때문에. 여러 종류의 망막 유년 인간의 질병에 유사한 성공적으로 모델링 되 고 제 브라10,11, 망막2, 내 변질 개별 대뇌의 라이브 영상 등에서 공부 12.
애벌레 zebrafish 이미징 비보에 유용한 도구 동안, 그것은 더 많은 도전으로 물고기 성장 하 고 착 색, 개발 몇 가지 약리 치료 전체 동물을 침투 수 없습니다 된다. 또한, 특정 세포 프로세스 개발 및 나이, 성인 동물에 이해 기능과 질병의 진행에 대 한 중요 한 나중 시간 포인트를 만들고 변경 합니다. Immunoblot, quantitiative PCR, O2 소비, 및 metabolomic 분석 같은 방법을 전체적으로 망막의 생물학에 대 한 중요 한 단서를 제공할 수 있습니다 하지만 그것은 개별 종류의 세포에 의해 영향을 받는 기부를 분별 하기 어려운 생화학 질병입니다. 이러한 문제를 무시 비보 전 고립 된 망막 조직을 이미징 하 고 평면 이미징 하는 동안 탑재 된 망막 월급 외부 망막13의 보기, 깊은 내부 망막 기능 가려진. 가로 망막 조각, 그에 제시 모든 레이어 및 셀의 명확한 보기를 활성화 하려면 고정 immunohistochemical 분석 하지만 정상적인 기능 및 질병에 관련 된 동적 프로세스의 단일 스냅숏을 제공.
여기, 우리 이미징 성인 제 브라에서 비보 전 가로 망막 분할 영역을 생성 하기 위한 방법을 제시. 그것은 비슷한 electrophysiological 및 형태학 연구14,15, ex vivo 공초점 레이저를 사용 하 여 이미징 시간 경과 대 한 중요 한 수정에 대 한 수 륙 양용 그리고 zebrafish 망막 슬라이스를 준비 하기 위한 방법 현미경 검사 법입니다. 바이오 센서 또는 분할 영역에 염료의 형광 응답 약리 에이전트 관류를 사용 하 여 제공 하면서 confocal 현미경으로 실시간으로 모니터링 된다. 메서드가 대뇌 이미징 개발 되었습니다, 그것은 적절 한 형광 마커 뮐러 셀, 양극 세포, 수평 세포, amacrine 세포, 또는 망막 신경 절 세포를 시각화에 대 한 사용 가능한 수 있습니다. 또한, 조각 보고서 세포 생존 능력, 기공을 전송, 미토 콘 드 리아 기능, 또는 산화 환 원 상태에 형광 세포 투과성 염료로 로드할 수 있습니다. 이 다재 다능 한 준비는 망막, 캘리포니아2 + 역학, 대사 상태, 신호 변환 등을 통해 다양 한 subcellular 프로세스의 시각화 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>제브라피시</td><td>워싱턴 대학교 사우스 레이크 유니온 아쿠아틱스 시설</td><td></td><td>재고는 안정적인 유전자 변형 라인으로 사내에서 유지</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>19-090-843</td><td>바셀린 주사기</td></tr><tr><td>3-mL 슬립 팁 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-436</td><td>바셀린 주사기</td></tr><tr><td>20g 3.8cm 슬립 팁 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5B</td><td>바셀린 주사기</td></tr><tr><td>일반 7cm X 2.5cm 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>아이컵 해부, 슬라이싱 챔버</td></tr><tr><td>Seche Vite 투명 매니큐어</td><td>아마존</td><td>B00150LT40</td><td>슬라이싱 챔버</td></tr><tr><td>18mm X 18mm #1 유리 커버 슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>이미징 사다리</td></tr><tr><td>무향 치과 왁</td>스 <td>아마존</td><td></td><td>이미징 사다리</td></tr><tr><td>양면 면도날</td><td>Stoelting</td><td>51427</td><td></td></tr><tr><td>디지털 마이크로 미터와 조직 슬라이싱 조직 슬라이</td>싱 <td>51415</td><td>Stoelting</td> 51415 <td>조직 슬라이싱</td></tr><tr><td>필터 페이퍼 - 흰색 격자 혼합 셀룰로오스, 13mm 직경, 0.45 &마이크로;B01K8WNL5A m 기공 크기</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWG01300</td><td>망막 장착용 여과지</td></tr><tr><td>10cm 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>물고기 안락사, 해부, 이미징 사다리 어셈블리</td></tr><tr><td>15cm 일반 팁 나무 어플리케이터 스틱</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-112</td><td>와이어 아이 루프 도구</td></tr><tr><td>30g (직경 0.25mm) 텅스텐 와이어</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td> 와이어 아이 루프 도구</td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>시그마 Aldrich</td><td>G8270</td><td>보충제 원료</td></tr><tr><td>용액 성분 L-젖산 나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L7022</td><td>보충제 원료</td></tr><tr><td>용액 성분 피루브산</td><td>나트륨 시그마 Aldrich</td><td>P2256</td><td>보충제 원료</td></tr><tr><td>용액 L-글루타민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>G3126</td><td>보충제 원료 용액 성분</td></tr><tr><td>&nbsp; L-글루타티온, 감소된</td><td>시그마 알드리치</td><td>G4251</td><td>보충제 원료</td></tr> 용액 <tr><td>L-아스코르브산</td><td>시그마 알드리치</td><td>A5960</td><td>보충제 원료</td></tr><tr><td>용액 NaCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7653</td><td>링거 용액 성분</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>P9333</td><td>링거 용액 성분</td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>Ringer 솔루션의 구성 요소</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td>Ringer 솔루션의 구성 요소</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0250</td><td>Ringer 솔루션</td></tr><tr><td>구성 요소 HEPES</td><td>Sigma </td><td>Ringer 용액의</td>Aldrich <td>H3375</td> 구성 요소</tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>Na+-free Ringer 용액의</td><td>BP152</td> 구성 요소</tr><tr><td>6 N HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-063</td><td>Na+-free Ringer 용액</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Na+-free Ringer's solution의 구성 요소</td></tr><tr><td>50 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Denville Scientific</td><td>C1062-P</td><td>Ringer's solution용 용기</td></tr><tr><td>Vannas 가위 - 8 cm, 각진 5 mm 블레이드</td><td>World Precision Instruments</td><td>501790</td><td>아이컵 해부용 마이크로 가위</td></tr><tr><td>스위스 핀셋 - #5, 11 cm, 직선, 0.06 X 0.07 mm 팁</td><td>World Precision Instruments</td><td>504510</td><td>아이컵 해부 및 슬라이스 조작을 위한 미세 집게</td></tr><tr><td>단일 가장자리 면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>아이컵 해부 및 트리밍 여과지</td></tr><tr><td>EMD Millipore 필터 집게</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>XX6200006P 젖은 여과지 처리용 편평한 집게</td></tr><tr><td>C12 558/568 BODIPY</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3835</td><td>염색 살아있는 세포 핵; 5 &micro를 배양하십시오. 실온에서 15분 동안 g/mL</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물(PI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>은 죽은 세포 핵을 염색합니다.5 &micro를 배양합니다. 실온에서 20분 동안 g/mL</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific</td><td>62249</td><td>염색 살아있는 세포 핵;5 &micro 배양; 실온에서 20분 동안 g/mL</td></tr><tr><td>테트라메틸로다민, 메틸 에스테르(TMRM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T668</td><td>염색 기능성, 음전하를 띤 미토콘드리아; 실온 조직 관류 챔버에서 30분 동안 1nM 배양</td></tr><tr><td></td><td>Cell MicroControls</td><td>BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td><td>주입 또는 관류용 이미징 챔버</td></tr><tr><td>2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose(NBDG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>N13195</td><td>형광 포도당 아날로그, 안락사 30분 전에 제브라피쉬에게 경구 투여</td></tr>, <tr><td>Olympus 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td>, <td>단일 세포 해상도에서 슬라이스의 형광을 시각화하기 위한</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td> 컨포칼 현미경</tr>, <tr><td>카르보닐 시안화물, 3-클로로페닐히드라존(CCCP)</td><td>, Sigma, Aldrich</td><td>C2759</td><td>미토콘드리아 호흡을 제거하는 실험용 시약; 슬라이스를 1 &micro의 최종 농도로 처리합니다. M</td></tr><tr><td>소형 흡인기 포지셔너</td> 관<td>류 관류</td>매니폴드용 <td>Cell MicroControls</td><td>FL-1</td></tr><tr><td>, 가스 버블러 매니폴드, 플로우 밸브, 60cc 주사기 홀더</td><td>Warner Instruments</td><td>다양한</td><td>관류용</td></tr></tbody></table>

ex vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

망막은 비전의 첫 번째 단계를 통합 하는 복잡 한 조직. 망막 세포의 기능 장애는 많은 눈부신 질병의 품질 증명 그리고 미래 치료 세포는 정상적으로 작동 하는 어떻게 다른 망막에 대 한 기본적인 이해에 경첩. 특정 종류의 기여는 망막 세포 주위에 점감 된다 때문에 생 화 확 적인 방법으로 정보를 얻고 어려운 입증 되었습니다. 라이브 망막 이미징 subcellular 수준, 유전자 인코딩된 형광 바이오 센서의 증가 덕분에 수많은 생물 학적 과정의 보기를 제공할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 지금까지 tadpoles 그리고 zebrafish 애벌레, 고립 된 망막의 바깥쪽 망막 레이어 또는 살아있는 동물에서 망막의 낮은 해상도 이미징 있었습니다. 여기 우리 confocal 현미경 검사 법을 통해 라이브 영상에 대 한 성인 제 브라에서 라이브 비보 전 망막 슬라이스를 생성 하기 위한 방법을 제시. 이 준비는 대부분 세포 유형 confocal 이미징 실험 살포를 사용 하 여 수행 볼 수와 모든 망막 레이어 가로 분할 영역 생성 합니다. 유전자 변형 zebrafish 표현 형광 단백질 또는 특정 망막 세포 유형 또는 세포 바이오 센서는 그대로 망막에서 단일 셀 정보를 추출 하는 데 사용 됩니다. 또한, 망막 조각 방법의 다양성에 추가 하는 형광 표시기 염료로 로드할 수 있습니다. 이 프로토콜 이미징 캘리포니아2 + 제 브라 콘 대뇌, 내 개발 되었습니다 하지만 적절 한 표시와 함께 그것은 수 적응 측정 캘리포니아2 + 또는 뮐러 셀, 바이 폴라 및 수평 세포, microglia, amacrine 세포, 또는 망막에서 대사 산물 신경 절 세포입니다. 이 메서드는 셀 형식을 공부에 적합 하지 않습니다 그래서 망막 안료 상피 조각에서 제거 됩니다. 연습, 여러 실험에 대 한 하나의 동물에서 직렬 슬라이스를 생성 가능 하다. 이 적응 기술에 대 한 망막 세포 생물학, 캘리포니아2 +, 에너지 항상성 많은 질문에 응답 하기 위한 강력한 도구를 제공 합니다.

안정적인 위치 및 조각 가로 방향을 주입 또는 약리 에이전트의 관류와 성공적인 이미징에 열쇠입니다. 신중 하 게 검토 하 고 모든 망막 레이어는 표시 (그림 2A, 슬라이스 ii) 확인 하는 데 필요한 confocal 영상 전에 분할 영역 위치. 조각 회전 (그림 2A, 슬라이스 iii)를 약간 앞으로 하 고 외부 세그먼트의 번들 표시 됩니다 작은 조정 초점으로 원하는 망막 레이어를가지고 포 셉으로 만들어질 수 있다. 분할 영역 필터 종이에 제대로 준수 (그림 2A, 나 슬라이스) RPE 유지 또는 (그림 2A, 4 슬라이스) 시간 경과 영상에 대 한 사용할 수 없습니다.
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

망막 조직을 이미징 전통적인 생 화 확 적인 방법에서 수집 될 수 없는 단일 셀 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜 confocal 영상에 대 한 제 브라에서 망막 조각의 준비를 설명합니다. 형광 유전자 센서를 인코딩 또는 표시기 염료 별개 망막 세포 유형에 수많은 생물 학적 과정의 시각화를 허용.

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

이 절차의 전반적인 목표는 형광 단백질 또는 바이오센서의 실시간 이미징이 필요한 실험을 위해 새로운 제브라피시 망막 조각을 준비하는 것입니다. 이 방법은 망막 내의 특정 세포 유형 및 세포 구획에서 칼슘 이온의 생리학적 및 대사적 역할과 같은 시력 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 조직의 주요 대사 산물 및 신호 분자에 대한 공간적 및 시간적 정보를 제공한다는 것입니다.제브라피시에서 망막 색소 상피(RPE)를 제거할 수 있도록 조직 조각을 만들기 전에 한 시간 동안 물고기를 어둡게 적응시킵니다. 슬라이싱 챔버의 경우 슬라이드에 매니큐어 라인을 칠합니다. 투명한 매니큐어를 사용하여 좁은 선을 칠하여 직사각형을 만듭니다.건조되면 광택제를 한 번 다시 칠하십시오. 챔버가 정적 이미징 또는 최소한의 용액 흐름으로 주입 실험에 사용되는 경우 주사기를 사용하여 길이 1cm, 0.5cm 간격의 커버슬립에 평행한 두 개의 바셀린 스트립을 도포합니다. 이제 블레이드를 준비합니다.먼저 양날 면도기에 에탄올을 바르고 자연 건조시킵니다. 그런 다음 가위를 사용하여 약 1cm 조각으로 자릅니다. 다음으로, 슬라이싱 챔버를 조직 슬라이서의 스테이지에 놓고 스테이지의 수평 중앙에 놓고 긴 가장자리에 정렬을 위한 영구 마커로 표시합니다.그런 다음 슬라이서 암에 칼날 조각을 로드합니다. 가장자리가 슬라이드 중앙을 넘고 슬라이드 표면과 평행을 이루지만 매니큐어에 닿지 않도록 블레이드를 고정합니다. 그런 다음 1/4 회전을 사용하여 블레이드 암을 내립니다.이제 여과지를 잘라 보십시오. 필요한 경우 블레이드를 다시 장착합니다. 계속 진행하려면 주사기를 사용하여 중간 지점에서 약 1.5cm 떨어진 10cm 접시에 작은 젤리 점 하나를 넣습니다.그런 다음 집게를 사용하여 커버슬립의 마른 면을 젤리에 밀어 넣습니다. 다음으로, 이미징 챔버의 입구 가장자리에서 약 1cm 떨어진 곳에 또 다른 작은 젤리 점을 놓습니다. 이제 20 게이지 바늘을 사용하여 약 1cm 떨어진 슬라이싱 챔버의 중심을 따라 세로로 1cm 길이의 얇은 평행 스트립 2개를 만듭니다.그런 다음 제브라피시를 접시에 옮기고 참수 없이 물고기를 자궁경부로 탈구시킵니다. 이제 와이어 루프를 사용하여 한쪽 눈 주위의 결합 조직을 느슨하게 한 다음 눈을 부드럽게 앞으로 당깁니다. 다음으로 마이크로 가위를 사용하여 눈 아래의 백색 시신경을

preparing-fresh-retinal-slices-from-adult-zebrafish-for-ex-vivo

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 망막 안료 상피 하나에서 세 일 postfertilization의 배아에게 부착과 않고 zebrafish의 망막 microdissect하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데...

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

이 비디오는 제브라피시 배아에서 일차 망막 신경절 세포를 배양하는 방법을 보여줍니다. 초기 단계의 배아는 눈을 분리하기 위해 해부를 거치고, 그 후 기계적으로 해리되어 망막 신경절 세포의 현탁액으로 만들어집니다. 이 세포 현탁액은 축삭돌기 발달을 촉진하기 위해 접착 단백질로 코팅된 커버슬립에서 배양됩니다.

제브라피시 배아(zebrafish embryos)에서 일차 망막 신경절 세포 배양 생성

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

우리는 성체 제브라피쉬에서 망막 신경절 세포(RGC)를 역행하는 효율적인 방법을 소개합니다.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

복수의 가벼운 손상 프로토콜은 손상 광수를 설명하고 결과적으로 성인 zebrafish에있는 망막 재생 반응을 유도하고 있습니다. 이 프로토콜은 안료 동물에서 사용할 수있는 개선 된 방법을 설명하고 그로드하고 전체 망막에 걸쳐 콘 광수의 대부분을 손상.

성인 Zebrafish의 망막 재생 연구에있는 사용을위한 비발 한 가벼운 손상 패러다임

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

이 정서의 결과 얻기 위해 단백질 subcellular 지역화 zebrafish 망막에 상관 빛 슈퍼 해상도 현미경 및 전자 현미경 이미지를 검색 하 여 필요한 단계를 설명 합니다.

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

여기, 우리는 방법 프로토콜 neoangiogenesis 및 구조적인 변화에 연결 된 장기 혈관 병 리의 설정에서 빠른 읽기로 쉽게 성인 tg(fli:EGFP) zebrafish 망막 맥 관 구조 분석 수 있는 논의.

물고기는 눈을 통해 당뇨병을 공부: 기정, 시각화, 및 성인 tg(fli:EGFP) Zebrafish 망막 맥 관 구조 분석

이 프로토콜은 신경계 발달 중H2 O2의생리적 신호 역할을 평가하기 위한 배양 된 제브라피시 뉴런 및 애벌레에서 유전으로 인코딩 된 과산화수소 (H2O2)-바이오센서의 사용을 설명합니다. 그것은 다른 세포 유형에 적용 하 고 일반적인 개발에 반응성 산소 종 (ROS)를 공부 하는 실험 치료와 함께 수정 될 수 있습니다.

신경 발달 도중 ROS 살아있는 세포 화상 진찰

이 기사는 망막 입력이 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기위한 첫 번째 단계로 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 눈을 외과 적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 또한이 기사는 애벌레 마취, 고정 및 뇌 해부에 대한 정보를 제공하고 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 제공합니다.

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

학습하세요 성인 제브라피시 망막 조각을 준비하여 살아있는 형광 바이오센서 이미징을 수행하는 방법을. 이 기술은 망막 세포 내 칼슘 이온 역할을 연구하는 데 필수적인 시공간 정보를 제공합니다.

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

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