다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

이 분리 절차의 전반적인 목표는 손상된 제브라피시의 망막 이식 배양에서 동역학 핵 이동을 겪고 있는 증식 세포의 살아있는 세포 이미징을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 어떤 메커니즘이 동역학적 핵 이동을 유도하는지 또는 신장 전구 세포 동역학 핵 이동의 뮐러 신경교세포(Muller glia)가 유사하게 조절되는지 여부와 같은 망막 재생의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 재생 중 interkinetic 핵 이동을 겪는 증식 세포의 동적 거동을 모니터링 할 수 있다는 것인데, 이를 통해 세포주기 단계 특정 메커니즘을 조사할 수 있습니다.

이 방법은 동역학적 핵 이동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 미세아교세포 거동 또는 죽어가는 뉴런의 뮐러 신경교세포작용(Muller glia phagocytosis) 조사와 같은 다른 망막 연구 분야에도 적용할 수 있습니다. 제브라피시를 마른 종이 타월에 옮겨 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 구부러진 집게로 눈 중 하나를 제거하고 FluoroDish에 옮깁니다.

실체 현미경 아래에서 눈 뒤쪽의 시신경이 보이도록 동공이 FluoroDish의 커버슬립을 향하도록 눈의 방향을 잡습니다. 그런 다음 가능한 한 눈 뒤쪽에 가까운 시신경을 제거합니다. 또한 눈 바깥쪽의 결합 조직을 제거합니다.

한 쌍의 집게로 눈의 코와 측두부 사이를 잡고 하나의 가위날로 얇은 판을 뚫고 눈의 코와 측두를 모두 잘라 시신경을 절개합니다. 다음으로, 망막의 등쪽과 복부를 분리하십시오. 한 쌍의 집게로 등쪽 망막에서 공막을 제거하고 두 번째 집게로 망막에 연결된 수정체를 잡습니다.

그런 다음 망막을 손상시키지 않고 수정체와 유리체를 제거합니다. 그런 다음, 신경절 세포층이 FluoroDish의 커버슬립을 향하도록 망막을 평평하게 만듭니다. 그 후, 10 마이크로 리터의 1 % 낮은 융점 아가로 망막을 둘러쌉니다.

망막이 액체 아가로스에 의해 들리지 않도록 하십시오. 약간만 올라와도 조직을 통해 초점을 맞추는 능력에 영향을 미칠 수 있으므로 망막이 들리지 않도록 하십시오. 들어 올리는 것이 관찰되면 피펫을 사용하여 아가로스를 제거하십시오. 아가로스가 커버슬립에서 조직을 들어 올리지 않는 것이 중요한데, 이는 고품질 이미지를 얻을 수 있는 능력을 감소시키기 때문입니다.

전체 FluoroDish를 덮기 위해 1%의 낮은 융점 아가로스를 추가하기 전에 이 절차를 여러 번 반복합니다. 아가로스가 응고되면 1.5ml의 배양 배지를 조직에 첨가합니다. 이미지 획득 소프트웨어에서 A1 MP GUI TI 패드, A1 컴팩트 GUI 및 ND 획득 창을 엽니다.

다중 광자 이미징의 경우 A1 컴팩트 GUI 창에서 IRNDD 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 설정 필드에서 첫 번째 이색성 미러에 대해 IRDM을 선택하고 GFP 형광을 얻기 위해 대역 통과 필터가 525에서 50으로 설정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 A1 MP GUI 창에서 IR 레이저를 켭니다.

레이저가 준비되는 데 몇 분 정도 걸립니다. 그런 다음 파장을 910나노미터로 설정하여 GFP 형광을 여기시키고 자동 정렬 버튼을 클릭하여 레이저를 정렬합니다. 다광자 현미경 스테이지에 망막 배양물을 배치한 후 광 증배관의 과다 노출을 방지하기 위해 셔터를 열기 전에 실내 및 장비 조명이 꺼져 있는지 확인하십시오.

노이즈 수준을 줄이려면 어두운 환경에 현미경을 장착하십시오. 스캔 영역 창에서 설정되고 A1 컴팩트 GUI 창에서 선택한 픽셀당 4.8마이크로초의 픽셀 체류 시간으로 설정된 2의 확대/축소로 300 x 300 픽셀의 시야 이미지를 획득합니다. A1 MP GUI 창에서 획득 영역을 변경하고 A1 컴팩트 GUI 창에서 게인을 변경하여 레이저 출력을 대략적으로 설정합니다.

이제, 신경절 세포층에 초점을 맞추고 ND 획득 창 내의 z 하위 창에서 z 스택의 상단 초점면을 설정합니다. 외부 핵층의 수준을 통해 초점면을 이동시키는데, 이는 내부 핵층의 세포에 비해 둥글고 확대된 희미하게 표지된 GFAP 및 GFP 양성 세포의 존재를 특징으로 합니다. 이 평면을 z 스택의 맨 아래로 설정합니다.

다음으로, z 단계 크기를 0.7에서 1마이크로미터 사이로 설정합니다. z 강도 보정을 설정하려면 z 강도 보정 창을 열고 ND에서 선택하여 z 스택 범위를 설정합니다. 그런 다음 z intensity correction 창에서 하단 초점면을 클릭하고 레이저 강도와 게인을 설정합니다.

그런 다음 z intensity correction window(z intensity correction 창)에서 z 값 옆에 있는 화살표를 클릭하여 선택한 초점면에 대한 z intensity correction(z 강도 보정) 창의 device settings(장치 설정) 아래에 표시되는 설정을 확인합니다. 중간 및 상단 평면에 대해 이 과정을 반복하여 레이저 출력과 게인을 높입니다. A1 MP GUI 창에서 획득 영역을 설정하고 이미징 시작 시 15보다 큰 획득 영역과 126보다 높은 게인을 선택하지 않도록 하여 사진 표백 및 노이즈 수준 증가를 방지합니다.

그런 다음 z intensity correction 창에서 relative intensity correction을 선택합니다. ND 획득 창의 시계열 하위 창에서 기간을 8시간으로 설정하고 간격을 지연 없음으로 설정합니다. 그런 다음 ND 수집 창의 z 스택 하위 창에서 z 보정 실행을 클릭하여 3D 시계열을 획득합니다.

이 절차에서는 분열하는 GFAP와 GFP 양성 핵을 포함하는 영역을 자릅니다. 분열하는 핵이 기저 INL과 관련하여 이동한 거리를 나중에 측정하기 위한 기준점을 설정하기 위해 INM을 거치지 않는 핵을 하나 이상 포함하는 잘린 영역을 선택합니다. 3D 재구성을 준비하는 데 도움이 됩니다.

show slices view 함수를 사용하여 직교 투영을 생성합니다. 그런 다음 모드를 slice에서 maximum intensity projection으로 변경합니다. 그런 다음 직교 최대 투영의 XY 뷰를 끕니다.

이동 및 분열 핵이 가장 잘 보이는 방향에 따라 XZ 또는 YZ 뷰도 끕니다. 마우스 오른쪽 버튼으로 나머지 이미지를 클릭하고 이보기에서 새 문서 만들기 기능을 사용하여 XZ 또는 YZ 이미지 시리즈를 추출합니다. 필요한 경우 이미지를 회전합니다.

수동 측정 기능을 사용하여 기저 INL에 남아 INM을 거치지 않는 핵의 맨 아래 수준에서 이미지를 가로질러 수평선을 그립니다. 분석 소프트웨어의 Line Measurement Tool을 사용하여 시계열에 대한 이동하는 핵의 기준선과 기저점 사이의 거리를 측정합니다. 여기에 표시된 것은 다광자 현미경으로 획득한 타임랩스 기록의 다른 시점에서 망막 외식의 z 스택 이미지 시리즈의 최대 YZ 투영입니다.

수동 측정 기능 하의 선 도구를 사용하여 별이 표시된 참조 셀 수준에 수평선을 배치했습니다. 수직 측정 선은 수평선에서 시작하여 이동하는 GF AP 및 GFP 양성 핵의 기저 위치까지 확장되었습니다. 이전 그림에서 측정된 세포 F0가 정점으로 이동하고 발생하는 딸 세포 D1 및 D2가 다광자 시간 경과 기록에서 기저부로 이동한 거리.

빨간색 선은 정점 이동 속도가 계산된 측정값을 나타내고, 검은색 선과 회색 선은 각각 D1 및 D2의 기저 이동 속도를 계산하는 데 사용된 측정값을 나타냅니다. 거리는 핵막이 붕괴되기 전의 정점 이동과 딸세포 D1의 빠른 기저 이동 단계에 대한 시간 자체에 대해 표시되었습니다. 일단 숙달되면, 세 마리의 물고기로부터 망막을 분리하는 것이 제대로 수행된다면 60분에서 90분 안에 완료될 수 있습니다. 이번에는 준비 단계가 제외됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 망막 이식의 생존 가능성을 보장하기 위해 가능한 한 빨리 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 더 깊은 조직층에서 이미징할 수 있도록 망막을 가능한 한 평평하게 장착하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 망막을 분리 및 장착하는 방법, 동역학적 핵 이동을 모니터링하고 이동 속도를 결정하기 위해 라이브 셀 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.