Name: 의 형태학의 분석 Drosophila 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 Drosophila 유전 모자이크를 이용한 애벌레 주변 감각 신경 세포의 수상돌기 및 축삭 형태학 분석 방법을. 공초점 면역형광 현미경으로 신경 구조를 시각화하여 신경발생 연구에 활용합니다.

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저자는 자금에 대한 RIKEN 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 유전과 immunohistochemistry 프로토콜에 대한 토론 Cagri Yalgin, 캐롤라인 Delandre, 그리고 제이 패리쉬 감사드립니다.

시약의 1.Preparation <ol><li> 칼슘 + + 무료 HL3.1 식염수 28 준비합니다. <ol><li> MM 년 : 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 자당, 5 trehalose, 산도 7.2. 소독 필터와 4 저장 ° C. 참고 : 칼슘 + + 무료 솔루션 해부하는 동안 근육 수축을 방지합니다. </li></ol></li><li> 폴리 - L - 라이신 (PLL) coverslips하십시오. <ol><li> -20 ° C.에 4.2ml 물에 100mg PLL을 해산하고 Eppendorf 튜브 및 동결에 300μl aliquots을 </li><li> 코팅 coverslips 먼저 해동 나누어지는가 ddH 2 O에서 10ml로 불러 및 코닥 포토 플로의 20μl를 추가하기 전에, 마지막 PLL 농도는 0.7 MG / ML입니다. </li><li> PLL 솔루션에서 30 분에 대한 잠수함의 coverslips은 제거하고 건조 후 물, 건조와 함께 간략하게 린스. 두 번 반복합니다. 치료 coverslips 지난 약 달. </li></ol></li></ol> 2. 유전 십자가 <ol><li> 티O는 MARCM의 클론을 생성합니다. 여기 팬 - DA 드라이버 11,27을 사용하여 예제 교차은 다음과 같습니다 : FRT2A X hsFLP; Gal4 109 (2) 80, UAS - mCD8 : GFP, 욕조 - Gal80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li> 클론을 Flp 아웃 생성합니다. 여기 클래스 IV - 특정 드라이버 8을 사용 예제 교차은 다음과 같습니다 : PPK - Gal4 X yw, hsFLP, UAS - FRT - CD2, Y + - 중지 - FRT - mCD8 : : GFP </li></ol> 3. 배아의 수집 <ol><li> 25 수집 병에 Drosophila의 십자가 유지 ° C와 효모 붙여넣기 30,31의 얇은 레이어와 사과 쥬스 한천 플레이트 29 확산에 배아를 수집합니다. </li></ol> 4. 배아의 열 충격 치료 <ol><li> 배아가 마련되었습니다되었을 사과 쥬스 한천 플레이트에 반대 빈 접시를 놓습니다. Parafilm (그림 2)와 두 접시 주위에 인감. </li><li> 열충격 동안 잠수함의 일전자 물에 목욕의 판 및 금속 무게를 사용하여 누르십시오. </li><li> MARCM의 배아에 대한 <ol><li> 2 시간에 대한 배아를 수집하고 둘러싸인 10cm 배양 접시에있는 부화가 추가로 2 시간 25 ° C에서 조직을 moistened. 참고 : 열 충격 프로토콜을 조정하는 것은 클론이 생성되는 빈도를 바꿀지도 모르겠어. </li><li> 38에 1 시간을위한 물 목욕의 단일 절연 뉴런, 잠수함 및 열 충격을 목표로 클론의 작은 숫자 ° C.에 대한 </li><li> 클론의 큰 번호를, 38에서 45mins에 대한 열 충격 ° C는 추가 30 분 후 다시 RT 30 분, 열 충격에 복구할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 24 시간에 대한 배아를 Flp 아웃 모으고, 38에서 1 시간에 대한 열 충격 ° C. </li></ol> 5. 클론에 대한 심사 <ol><li> 열 충격 후, 물을 꽉 배열의 뚜껑을 제거하고 moistened 조직으로 둘러싸인 10cm의 배양 접시에있는 사과 주스 한천 플레이트를 배치합니다. 문화 돌아다니다까지 배아 25시 이후의 유충 ° CING 3 층 instar. 참고 : 문화 환경, 특히 영양이 다 돌기 아버의 형태 32,33을 변경 표시되었습니다. 성장하는 애벌레 항상 효모 붙여넣기에 대한 액세스 권한이 있는지 확인, 필요에 따라 붙여 효모를 모니터링하고 보충. </li><li> 프로토콜 이후에이 시점에서, 부드럽게 곤충 집게를 사용하여 애벌레를 조작. </li><li> 간단히 부드럽게 수돗물의 애벌레를 린스, 그리고 한천 플레이트에 놓습니다. 참고 :이 단계는 배경 애벌레 표면에 음식이나 먼지로부터 자동 형광을 줄여줍니다. </li><li> 강력한 형광 해부 현미경으로 애벌레를 검사합니다. 본문 벽에 GFP - 긍정적인 뉴런 / 세포와 애벌레를 식별합니다. </li></ol> dendrites 6.에서는 생체내 이미징 <ol><li> 80 % 글리세롤의 작은 방울로 우울증 슬라이드 유리에 유충을 넣습니다. 유충를 무력화하기 위해 슬라이드에 coverslip 놓으십시오. 공기 유충과 coversli 사이에 남아 없다는 것을 확인P. </li><li> 부드럽게 관심의 신경 세포의 시각화 수 있도록 유충을 롤 coverslip 밀어. 이미지 mCD8 : 공촛점 현미경을 통해 GFP - 라벨이 돌기 아버. </li></ol> 7. 애벌레 해부 시작하기 전에 참고 : DA 신경 세포의 dendrites는 절개의 개시 이후 급격히 저하. 좋은 dendrite의 형태를 보장하기 위해 5 분 미만으로 각각의 유충을 해부하다. <ol><li> 다음과 같은 수정 이전 34 설명된대로 Sylgard 접시에 3 층 instar의 애벌레를 헤매고 해부하다 : <ol><li> DA 신경 세포 축삭 테르의 이미징 들어, CNS는 그대로이고 segmental 신경이 깨진되지 않도록. 애벌레를 연 후, 먼저 조심스럽게 몸 벽에 tracheal 연결을 절단하고 부드럽게 전체 창자를 제거합니다. </li><li> 혼자 이미징 dendrites 경우, 아첨이 장착 있도록 CNS를 제거합니다. </li></ol></li></ol> 8. Fixat애벌레 필레의 이온과 차단 <ol><li> 여전히 Sylgard 판에 고정된 유충으로 부드럽게 회전 흔드는에서 RT에서 20mins 위해 PBS에 4퍼센트 PFA에서 문제를 해결. </li><li> 고정 후 애벌레 조직의 성분 (지방 몸, 기관 등)를 제거합니다. </li><li> Sylgard 접시와 뿌리에 3 배 상업 중심지 (0.1 % 트리톤 X - 100 PBS)를 PBST로 씻으십시오. 축삭의 테르를 검사하면, Sylgard 판에 필렛을 유지. (얼룩의 dendrites 경우이 단계 34에서 0.5 ML 관에 애벌레 필레을 전송 가능합니다) </li><li> 뿌리에 PBST에 5퍼센트 정상 당나귀 혈청 (NDS)에 RT에서 20mins에 대한 애벌레를 차단합니다. </li></ol> 9. 애벌레 필레의 염색법 <ol><li> 차 항체에 차단 솔루션과 부화를 둘러싸인 작은 파티 간다 구 컨테이너에 ° C가 조직을 moistened 4 박 (NDS / PBST 5 %)를 제거합니다. </li><li> 4 ° C에서 튜브를 제거하고 RT에서 추가 시간을 품다. </li><li> PBST에서 배의 상업 중심지 씻으십시오. 보조 antib 추가ody은 (5 %에서 NDS / PBST) 및 커버 형광단 사진 - 표백 34 방지할 수 있습니다. </li><li> 두 시간 동안 RT에서 부화하거나, 또는 야간 4 ° C RT에서 한 시간 따라갔다. </li><li> PBST에서 애벌레 배의 상업 중심지를 씻어 및 장착을 참조하십시오. </li></ol> 10. dendrite 아버의 시험 애벌레 필레의 마운트 <ol><li> 해부 가위 또는 머리 (입 후크 포함), 34 (spiracles 포함) 뒷부분을 차단하기 위해 메스를 사용하여 가능한 한 평면 각 애벌레 필릿를 탑재합니다. </li><li> 슬라이드 아래 표피 사이드에있는 애벌레 필릿를 놓고, 80 % 글리세롤에 마운트하고, '빠른'마운트 34에 대한 매니큐어로 coverslip의 측면을 봉쇄. </li><li> 영구 장착하고 명확한 이미지 <ol><li> PLL의 coverslip에 PBS의 드롭에 해부 애벌레 등심 근육 쪽을 아래로 놓고 빨리 coverslip을 준수합니다. </li><li> howeve, 장착 후 가능한 한 많은 액체로 제거R은 완전히 건조하는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 35 % 에탄올, 50 % 70 %, 95 %, 각 10 분 (2 백퍼센트 EtOH 솔루션 자주 변경해야 결국 2X 100 % 에탄올 다음 : 에탄올 시리즈를 통해 coverslip을 (첨부 애벌레 등심)를 타고 ) 결국, 크실렌의 2 배 상업 중심지를 씻는다. </li><li> 깨끗한 슬라이드 DPX mountant (Distyrene의 가소제의 크실렌)의 방울을 넣고 조심스럽게 위에 등심 쪽 다운 coverslip을 믿는다. 어둠 속에서 계속 및 이미징하기 전에 설정하는 DPX 한 하루를 기다립니다. </li></ol></li></ol> 11. 축삭 테르의 시험 애벌레 필레의 마운트 <ol><li> segmental 신경 해부, 고정 기간 동안 그대로 PNS와 CNS 간의 실행 그리고 주변 감각 신경 세포 본체에서 VNC로 axons의 추적 수 있도록 염색법 유지. </li><li> 우울증 슬라이드에 80 % 글리세롤의 각 애벌레 등심 표피 쪽을 탑재합니다. DA 세포 본체에서에 axons를 추적공촛점 현미경으로 VNC. 참고 : VNC의 기원 세그먼트에 각 바디 벽 세그먼트 프로젝트에 PNS의 신경. </li></ol> 12. 대표 결과 : 대표 결과는 수치 3-5에 표시됩니다. 그림. 3 공촛점 현미경 생체내에서 캡처한 클래스 IV DA 신경 세포의 전체 아버를 보여줍니다. 그림. 4 제대로 형태를 보존하기 위해 수정되었습니다 immunohistochemically 분류 클래스 III 신경 세포의 dendrite 아버의 일부까지 가까이를 보여줍니다. 관련 삽입은 (안티 GFP 항체와 함께 모두 스테인드) 실패 절개 및 고정 후 발생할 수있는 저하를 보여줍니다. 그림. 5 CNS의 단일 클래스 IV 축삭 말단 (안티 - GFP, 녹색)을 보여줍니다, 모든 클래스 IV의 테르는 반 CD2 (마젠타)와 공동으로 얼룩진 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg"> 한 프로토콜 개요를 그림. A) 수집 후 열 충격 배아. B) 라이브 유충에 다음 GFP 양성 DA 신경 세포 복제와 유충 및 이미지 GFP - 라벨 dendrite 아버을 선택합니다. C) 유충을 해부하다, 그리고 immunohistochemically 등심을 얼룩. D) 스테인드 필릿를 탑재하고 이미지를 돌기 아버과 DA 신경 세포 클론의 axonal 예상합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg"> 열 충격에 대한 사과 쥬스 한천 플레이트 2 준비 그림. 접시 (흰색 화살표, AB)를 타고, (빨간색 화살표 B) 위에 두 번째 페트리 접시를 추가하고 Parafilm (파란색 화살표, B)와 주변 인감. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg"> mCD8의 dendrite 아버의 생체내 이미지 그림 3 : 제 3 instar의 유충의 클래스 IV (v'ada) 뉴런을 나타내는 GFP - 표시 MARCM 클론 (2.1에서와 같이 유전자형). 스케일 바 50μm이다. d/3111/3111fig4.jpg "/&gt; 그림 4 mCD8 : 성공 절개 및 고정 (녹색) 이후 좋은 형태를 보여주는 안티 - GFP 항체 물들일 클래스 III 신경 세포 (ddaA)의 GFP - 표시 MARCM 클론. 실패 해부와 고정 (마젠타) 이후 발생 삽입 보여줍니다 dendrite 저하 (흰색 화살표). 스케일 바 25μm이다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg"> 그림 5 제 3 회 instar 애벌레 VNC. 하나의 클래스 VI (vdaB) 축삭 말단 (2.2에서와 같이 유전자형)의 Flp 아웃 클론은 안티 - GFP 항체 (녹색)를 사용하여 감지됩니다. 안티 - CD2는 모든 클래스 IV 테르 (마젠타)를 표시합니다. 스케일 바 25μm이다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Drosophila 애벌레 DA 신경 세포 모델은 메커니즘을 조사 한 우수한 유전자 시스템을 제공하는 제어 신경 세포의 형태 및 회로 형성. MARCM은 일반적으로 라벨 및 돌연변이 DA 신경 세포의 클론을 생성하는 데 사용됩니다. MARCM 위해 우리는 두 팬 - 신경 (예 : Gal4 c155) 또는 DA 뉴런 특정 드라이버를 사용합니다. 팬 - 신경 드라이버를 사용하면 직접 공개 주식 센터에서 널리 사용되는 몇 가지 주식을 사용하는 것이 가능합니다. 표시된 클론이 CNS에서 생성되지 않습니다, 그리고 클론이 검찰 axonal 테르의 분석을 복잡 수 있기 때문에 그러나 DA - 뉴런 특정 드라이버를 사용하면 유리한 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 DA - 특정 Gal4 라인의 목록은 시모노 외 (2009) 27에서 찾을 수 있습니다. Flp 아웃은 조사단이 concomitantly ectopically 단일 레이블 신경 세포에있는 Gal...

<table border="1"><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> SZX16 형광 해부 현미경 (GFPHQ 필터 포함) </td><td> 올림포스 산 </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> 곤충 집게 라이브 </td><td> FST </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26mm X 76mm 우울증 슬라이드 유리 </td><td> Toshinriko (주) </td><td> T8 - R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (또는 Silpot 184) </td><td> 다우 코닝 </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 - L - 라이신 </td><td> 시그마 </td><td> P - 1524 </td><td> 이 제품은 가장 효과적인 입증되었습니다 </td></tr><tr><td> DPX 장착 매체 </td><td> 시그마 </td><td> 44,581 </td><td></td></tr><tr><td> 토끼 방지 GFP </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11122 </td><td> 희석 1:500 </td></tr><tr><td> 쥐 방지 CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5H10 </td><td> 희석 1:200 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 - CD2 </td><td> ABD serotec </td><td> MCA443R </td><td> 희석 1:700 </td></tr><tr><td> 마우스 방지 Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td> 희석 1시 10분 </td></tr></table>

의 형태학의 분석 drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 dendrites 및 axons

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

신경 시스템 개발은 정확한 신경 클래스 특정 돌기 개발 및 axonal 배선 다음 신경 세포의 위치와 정체성의 정확한 사양을 필요로합니다. 최근 Drosophila 애벌레 말초 신경계 (PNS)의 돌기 arborization (DA) 감각 뉴런은 신경 세포의 분화 모두 일반 클래스 구체적인 메커니즘을 명료하게하다하는 강력한 유전자 모델이되고 있습니다. 네 가지 주요 DA 신경 세포 클래스 (I - IV) 1이 있습니다. 그들은 증가 dendrite 아버 복잡한 순서에 따라 이름이, 그들의 분화 20-10의 유전자 컨트롤에 클래스 구체적인 차이점을 가지고 있습니다. 1) 그것이 검찰 신경 dendrite 아버가 확산 과일 파리에서 사용할 수있는 강력한 유전자 도구, 2)를 활용할 수 있기 때문에 검찰 감각 시스템은 돌기 형태 11-13의 통제 뒤에 분자 메커니즘을 조사하기 위해 실용적인 모델입니다 광학 CLE 아래에 단지 2 차원에AR 애벌레의 표피)는 쉽게 생체내, 3 고해상도로 시각화하고 있습니다 돌기 형태의 클래스 특정 다양성)은 단순한 대 고도로 분지 돌기 나무의 형성을 제어하는 핵심 요소를 찾을 수 비교 분석을 용이하게, 4 틀에 박힌 돌기 아버 다른 검찰 뉴런의 모양은 morphometric 통계 분석을 용이하게합니다. DA 신경 세포 활동 애벌레 운동 중앙 패턴 발생기 14-16의 출력을 수정합니다. 다른 신경 세포 DA 수업은 독특한 감각 modalities를 가지고 있고, 자신의 정품 인증 14,16-20 다른 행동 반응을 elicits. 또한 다른 클래스는 복부 신경 코드에 Drosophila 애벌레 중추 신경계 (VNC) 21에 stereotypically axonal 전망을 보낼 수 있습니다. 이러한 예측은 돌기 분야 7,22의 본문 벽에 DA 뉴런 감각 양상과 위치를 모두 지형 표현과 종료, 23. DA axonal 추정치 그래서 시험은 지형 매핑 7,22,23뿐만 아니라, 간단한 회로 modulating 애벌레의 운동 14-17의 배선을 기본 메커니즘을 명료하게하다하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 여기서 MARCM (Repressible 세포 마커와 함께 모자이크 분석) 1,10,25과 Flp 아웃 22,26,27 기술 (그림 1.에 요약)를 통해 24 마킹 검찰의 뉴런을 생성하고 유전자 모자이크를 분석하는 실용적인 가이드를 제시한다.

의 돌기 arborization 감각 뉴런<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레 주변 신경 시스템은 일반 신경 세포의 분화의 신경 세포 수준의 특정 메커니즘 모두를 명료하게하다 유용 모델입니다. 우리는 돌기 arborization의 신경 세포 유전자의 모자이크를 생성하고 분석하는 실용적인 가이드를 제시한다.

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

신경계 발달에는 뉴런의 위치와 정체성의 정확한 규명이 필요하며, 이어서 뉴런 클래스 특이적인 수지상 돌기의 정확한...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 초파리 유충의 수지상 분지 뉴런의 상세한 형태를 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배아를 수집하고 성숙시킨 후, 열 충격으로 유도된 flipase 발현을 통해 GFP가 표지된 유전적 클론을 생성합니다. 두 번째 단계에서는 형광 뉴런 클론이 있는 유충을 선택하여 이들의 수지상 ABA 이미지를 촬영합니다.라바(lava)를 이미징한 후, 이를 해부하고 고정하며 면역 염색하여 마운트함으로써 공초점 면역형광 현미경을 통해 수지상 돌기 하버와 축삭 말단 형태를 시각화할 수 있습니다. 오늘은 유전적 모스(mos)를 이용한 sula 하부 말초 센서 OID 및 엑손의 형태학적 분석 프로토콜을 시연하겠습니다. 이 방법은 신경 정체성, 수지상 구강 형태 및 외부 배선을 제어하는 유전적 프로그램은 무엇인가와 같은 신경 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.사과 즙 플레이트에 배아를 수집하여 이 프로토콜을 시작하십시오. 열 충격은 38 °C 항온수조에서 가하며, 지속 시간은 배아의 유전형과 원하는 클론 크기에 따라 달라집니다. 본 프로토콜에서는 pand 수지상 돌기 분지 뉴런 드라이버를 가진 배아로부터 markum 클론을 생성합니다. 열 충격을 가하기 전, 마커 배아를 습윤 조직으로 감싸 25 °C에서 2시간 동안 유지하십시오.빈 플레이트와 파라필름을 사용하여 수몰 가능하게 만들어 열충격용 수집 플레이트를 준비합니다. 그 후 마커 배아에 1시간 동안 열충격을 가하여 작은 클론이나 단일 뉴런 표지를 생성합니다. 클론의 수를 늘리려면 배스에서 45분간 배양하고, 이어서 실온에서 30분, 다시 배스에서 30분 동안 배양하는 연장 열충격 방식을 사용하십시오.플립아웃(flipout) 클론을 생성하려면 24시간 동안 연속적으로 배아를 수집하십시오. 이 프로토콜은 4등급 특이적 드라이버를 사용합니다. 열충격 처리 후 1시간 동안 플립아웃 배아에 열충격을 가하십시오.수집 플레이트를 습윤한 조직과 배양액으로 둘러싸인 10 centimeter 페트리 접시에 넣습니다. 배아 배양 중 배아의 온도는 25 degrees Celsius로 유지하며, 필요에 따라 효모 페이스트를 보충합니다. 영양 상태가 신경세포 발달에 결정적인 영향을 미치기 때문입니다.3령 유충을 수집할 수 있을 때까지 배양을 유지한 다음, 3령 유충을 수돗물로 짧고 부드럽게 헹구어 한천 플레이트로 옮깁니다. 이제 고배율 형광 해부 현미경과 곤충 핀셋을 사용하여 유충을 관찰합니다. 체벽에 GFP 양성 신경세포가 있는 유충을 식별하여 80% glycerol 한 방울이 떨어져 있는 오목 슬라이드로 옮깁니다.슬라이드 위에 커버 슬립을 덮어 유충을 고정합니다. 유충과 커버 슬립 사이에 공기가 남지 않도록 합니다. 표준 공초점 현미경을 사용하여 유충의 큐티클을 통해 관찰하고자 하는 뉴런을 시각화합니다.더 나은 관찰 각도를 위해 라바(lava)의 위치를 변경하려면, 커버슬립을 부드럽게 밀어 라바를 굴립니다. 곤충 핀셋을 사용하여 라바를 SIL 가드 플레이트로 옮기는 것으로 이 프로토콜을 시작하십시오. 그 다음, 전단과 후단을 핀으로 고정합니다.그 다음 칼슘이 없는 HL 3.1 버퍼를 추가합니다. 이제 전후축에 수직이 되도록 lava의 양 끝단을 중간까지 절개합니다. 그런 다음 두 기관 사이의 중앙선을 따라 절개합니다.장(gut)을 조심스럽게 제거하기 전에 체벽으로 연결된 각각의 기관 연결 부위를 세밀하게 절단하십시오. 이렇게 하면 말초신경계(PNS)와 중추신경계(CNS) 사이에 흐르는 분절 신경을 온전하게 유지할 수 있습니다. 유충이 셀 가드 플레이트에 고정된 상태에서, 완만한 회전 쉐이커를 사용하여 실온의 PBS 내 4% Para formaldehyde에서 20분 동안 고정하십시오. 각 해부 과정은 5분 이내에 완료해야 합니다.그렇지 않으면 가지돌기 권한 뉴런의 신경돌기가 분해되기 시작합니다. 고정 후, 과잉 유충 조직을 제거합니다. 그런 다음 필렛을 PBST로 10분씩 3회 세척합니다.세척 후, 유충을 블로킹 용액이 담긴 상태에서 실온의 완만한 진탕과 함께 20분 동안 배양합니다. 블로킹이 완료되면 블로킹 용액을 1차 항체 용액으로 교체합니다. 샘플을 습윤한 조직으로 둘러싸인 작은 플라스틱 용기에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 실온에서 1시간 더 추가 배양을 진행합니다.그 다음, lava 필렛을 PBST로 10분씩 6회 세척합니다. 이제 2차 항체를 첨가하고, 형광 물질의 광퇴색을 방지하기 위해 필렛을 차광 용기에 넣습니다. 필렛을 실온에서 수 시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 실온에서 1시간 동안 추가로 배양합니다.마지막으로 필렛을 PBST로 10분씩 6회 세척합니다. 그러면 조직을 마운팅할 준비가 됩니다. 축삭 말단을 시각화하려면, 유충 필렛의 큐티클 면이 아래로 향하게 하여 오목 슬라이드 내의 80% glycerol에 마운팅하십시오.수지상 돌기의 이미지를 더 선명하게 얻으려면, PLL이 코팅된 커버슬립으로 영구 표본을 제작하십시오. 커버슬립을 코팅하기 위해 PLL 분액물을 준비합니다. 이를 2중 증류수 10 milliliters로 희석하고 20 microliters의 Kodak photo flow를 첨가합니다.커버슬립을 PLL 용액에 30분 동안 담근 후, 꺼내어 공기 중에서 건조합니다. 그다음 물과 공기로 짧게 헹구고 다시 건조합니다.이 과정을 두 번 반복합니다. PLL 배스(bath)부터 시작하여, 처리된 커버슬립은 약 한 달 동안 사용할 수 있습니다. 이제 해부한 유충의 필렛(fillet)을 PLL 커버슬립 위의 PBS 한 방울에 근육 면이 아래로 향하게 하여 마운팅합니다.티슈 페이퍼를 사용하여 필렛을 커버 슬립에 빠르게 부착시킵니다. 액체를 가능한 한 많이 제거하되, 완전히 마르지 않도록 주의하십시오. 다음으로 유생 필렛을 탈수시키는데, 35% ethanol을 시작으로 50%, 70%, 95%, 100% 순으로 각각 10분간 에탄올 배스(ethanol bath) 처리를 하며, 마지막으로 100% ethanol 배스 처리를 한 번 더 수행합니다.에탄올 세척 후, 자일렌(xylene)에서 10분씩 2~3회 세척합니다. 그런 다음 깨끗한 슬라이드 위에 DPX를 한 방울 떨어뜨리고, 커버 슬립을 DPX 위에 조심스럽게 놓은 뒤 뒤집어서 채웁니다. 슬라이드를 암소에 보관하고 DPX가 굳을 때까지 하루 동안 기다립니다.in vivo 및 초점 현미경을 사용하여 조직을 이미징하기 전에, 이와 같은 이미지를 캡처할 수 있습니다. 이는 4급 수지상 돌기 뉴런의 전체 수지상 구조입니다. 이것은 형태학적 구조를 보존하기 위해 적절히 고정된 IHC 표지 3급 뉴런의 수지상 돌기를 확대한 모습입니다.삽입도는 성공적이지 못한 해부 및 고정 후에 발생할 수 있는 퇴화 과정을 보여줍니다. 이 오버레이는 중추신경계(CNS) 내의 단일 4등급 축삭 말단을 보여줍니다. 축삭은 anti GFP로 녹색으로 표지되었으며, 모든 4등급 말단은 anti CD two로 마젠타색으로 공동 염색되었습니다.이 절차를 수행할 때, 말초에서 중추신경계(CNS)로 이어지는 축삭을 추적하여 샘플을 빠르게 해부하고 고정하는 것이 중요합니다. 각 신체의 말초신경계(PNS) 뉴런이 복측 신경 코드의 인지 세그먼트로 분절 투사된다는 점을 유념하는 것이 유용합니다. 또한, 수상돌기만 시각화하려는 경우에는 해부 과정에서 CNAs를 제거하고, 염색은 플레이트 대신 튜브에 넣어 수행할 수 있습니다.수지상 돌기 이미징을 위해 이 필레를 마운팅할 때, 먼저 마우스 훅(mouth hooks)을 사용하여 머리 부분을 절단하고 스파클(sparkles)을 사용하여 후방 부분을 절단하십시오. 이는 원활한 표본 준비를 위한 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 개최 준비하는 절차를...

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

출처: Ting, C., et al., 열과 층의 수지상 형태 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 초파리 뇌를 준비하고, 공초점 현미경으로 GFP 표지 수질 수상돌기의 수평 및 정면 이미지 스택을 캡처하고, 층과 열에 걸쳐 형태를 분석하기 위한 3D 재구성을 생성하는 절차를 보여줍니다.

Drosophila Medulla 층과 기둥에 걸친 수지상 형태 분석

우리는 중추 신경 시스템에 하나의 뉴런을 라벨에 대한 기술 (CNS)의...

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포를 사용하여 신경 세포의 형태 형성의 연구는 면역에 의해 신경 세포와 표피 단백질의 현장 시각화 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 애벌레 몸 벽에서 근육 조직을 제거하여 다 신경 세포와 주변 표피 세포의 면역 형광 분석을 개선하는 절차를 설명합니다.

제거<em&gt; 초파리</em감각 뉴런과 표피 세포의 면역 형광 분석을위한 애벌레 필렛에서&gt; 근육 조직

두 이미지 분석 알고리즘, "초파리 NMJ Morphometrics"및 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"가 자동 초파리 신경근 접합부 (NMJ)의 구 개 형태 적 특징을 정량화하기 위해 만들어졌다.

높은 처리량 및 다중 파라 메트릭 정량화를위한 ​​두 알고리즘<em&gt; 초파리</em&gt; 신경 근육 접합 형태학

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

이 프로토콜에서 초파리, 수지상 morphogenesis의 연구를 위해 사용 될 수 있는 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)의 정량 분석에 집중 한다.

초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

여기는 고정, 설치, 영상, 및 후 이미징 단계 초파리 의 성인 다리에 형광 단백질 axonal 대상으로 시각화 하는 프로토콜에 설명 합니다.

성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

여기에서, 우리는 절단된 축색및 그들의 시냅스의 형태학적 그리고 기능적인 보존을 평가하기 위하여 Drosophila melanogaster에 있는 3개의 간단한 상해 유도한 축사 변성 (축세포 죽음) 분석사를 능력을 발휘하는 프로토콜을 제공합니다.

드로소필라 멜라노가스터에서 축사 사망 시축과 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

배우세요 Drosophila 유전 모자이크를 이용한 애벌레 주변 감각 신경 세포의 수상돌기 및 축삭 형태학 분석 방법을. 공초점 면역형광 현미경으로 신경 구조를 시각화하여 신경발생 연구에 활용합니다.

의 형태학의 분석 Drosophila 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

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