의 형태학의 분석 Drosophila 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

이 절차의 전반적인 목적은 초파리, 유충, 수지상, 수목 뉴런의 상세한 형태를 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 배아를 수집하고, 노화시키고, 열 충격에 의한 유도 리파제 발현에 의해 GFP 표지된 유전자 클론을 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 형광 뉴런 클론이 있는 유충을 선택하고 수지상 ABA의 이미지를 촬영

용암을 이미징한 후, 용암을 해부, 고정 및 면역 염색하여 장착할 수 있으며, 수지상 하버와 축삭 말단 형태를 컨포칼 면역형광 현미경을 통해 시각화할 수 있습니다. 오늘 저는 유전적 mos를 사용하여 sula 하부 주변 센서 OID 및 엑손의 형태학적 분석을 위한 프로토콜을 시연할 것입니다. 이 방법은 신경 정체성, 수지상 구강 모양 및 외부 배선을 제어하는 유전 프로그램은 무엇입니까?

사과 주스 플레이트에서 배아를 채취하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다. 열 충격은 섭씨 38도의 수조에서 전달되며 지속 시간은 배아 유전학과 원하는 클론 크기에 따라 다릅니다. 이 프로토콜의 경우, 열 쇼크가 발생하기 전에 마커 배아를 섭씨 25도로 유지하고 촉촉한 조직으로 둘러싸는 배아에서 마컴 클론을 생성합니다.

수집 플레이트는 빈 플레이트와 파라 채우기를 사용하여 잠수할 수 있도록 하여 열 충격에 대비합니다. 그런 다음 마커 배아를 한 시간 동안 열 충격을 가하여 작은 클론 또는 단일 뉴런 표지를 생성합니다. 클론의 수를 늘리려면 수조에서 45분 동안 배양한 다음 실온에서 30분, 수조에서 30분 더 배양하여 확장된 열 충격을 사용하십시오.

플립아웃 클론을 생성하려면 연속 24시간 동안 배아를 수집합니다. 이 프로토콜은 클래스 4 특정 드라이버를 사용합니다. 열 충격 후 한 시간 동안 플립아웃 배아에 열 충격을 가합니다.

수집 플레이트를 촉촉한 조직과 배양으로 둘러싸인 10cm 페트리 접시에 놓습니다. 배아 배양 중 배아는 섭씨 25도이며 모니터링하며 필요에 따라 효모 페이스트를 보충합니다. 영양은 신경 발달에 치명적인 영향을 미치기 때문입니다.

별에서 세 번째 방황하는 용암을 잠시 모을 수 있을 때까지 배양을 유지하고 세 번째 instar 유충을 수돗물로 부드럽게 헹구고 한천 플레이트로 옮깁니다. 이제 강력한 형광 해부 현미경과 곤충 집게를 사용하여 유충을 검사하십시오. 체벽에 GFP 양성 뉴런이 있는 유충을 식별하고 80%글리세롤이 한 방울 떨어진 우울증 슬라이드로 이동합니다.

용암을 움직이지 못하게 하기 위해 슬라이드에 덮개 슬립을 놓습니다. 용암과 덮개 슬립 사이에 공기가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 표준 컨포칼 현미경을 사용하여 용암 표피를 통해 관심 뉴런을 시각화합니다.

시야각을 개선하기 위해 용암의 위치를 변경하려면 커버 슬립을 부드럽게 밀어 용암을 굴립니다. 곤충 집게를 사용하여 용암을 SIL 가드 플레이트로 옮기는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다. 그런 다음 앞쪽과 뒤쪽 끝에 고정합니다.

그런 다음 칼슘이 없는 HL 3.1 완충액을 추가합니다. 이제 용암의 양쪽 끝을 전방 후방 축에 수직으로 반쯤 자릅니다. 그런 다음 두 기관 사이의 정중선을 따라 자릅니다.

장을 부드럽게 제거하기 전에 신체 벽에 대한 각 개별 기관 연결을 조심스럽게 절단합니다. 이렇게 하면 PNS와 CNS 사이를 달리는 분절 신경이 손상되지 않게 유지됩니다. 유충을 세포 보호판에 고정한 상태에서 부드럽게 회전하는 셰이커에서 실온의 20분 동안 PBS의 4% 파라 포름알데히드에 고정하고 5분 이내에 각 해부를 수행합니다.

그렇지 않으면 수지상 승인 뉴런의 nites가 분해되기 시작합니다. 고정 후에는 과도한 유충 조직을 제거하십시오. 그런 다음 필레를 PBST로 세척당 10분 동안 세 번 세척합니다.

세척 후 유충을 실온에서 20분 동안 차단 용액에서 부드럽게 흔들어 배양합니다. 차단이 완료되면 차단 용액을 1차 항체 용액으로 교체합니다. 촉촉한 티슈로 둘러싸인 작은 플라스틱 용기에 샘플을 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양하고 다음 날 실온에서 한 시간 더 배양을 계속합니다.

그런 다음 용암 필레를 PBST에서 세척 당 10 분 동안 6 번 세척합니다. 이제 2차 항체를 추가하고 필렛을 어두운 용기에 넣어 Fluor의 광표백을 방지합니다. 필레를 실온에서 몇 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양한 다음 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

마지막으로 필레를 PBST에서 세탁당 10분 동안 6회 세척합니다. 그러면 조직을 장착할 준비가 됩니다. 축삭 말단을 시각화하려면 함몰 슬라이드에서 유충 필레 큐티클 쪽을 80% 글리세롤로 아래로 향하게 하여 장착하기만 하면 됩니다.

수상돌기의 이미지를 보다 선명하게 만들려면 PLL 코팅된 커버 슬립으로 영구 마운트를 만드십시오. PLL의 커버 슬립과 분취를 코드화합니다. 최대 10ml의 이중 증류수를 넣고 20마이크로리터의 Kodak 포토 플로우를 추가합니다.

커버 슬립을 PLL 용액에 30분 동안 담그고 제거 후 자연 건조합니다. 그런 다음 물과 공기로 짧게 헹굽니다. 다시 말리십시오.

이 과정을 두 번 반복합니다. PLL 수조를 시작으로 처리된 커버 슬립은 약 한 달 동안 지속됩니다. 이제 절개된 유충 필레 근육 쪽을 PLL 커버 슬립의 PBS 한 방울에 장착합니다.

필레는 티슈 페이퍼 조각을 사용하여 커버 슬립에 빠르게 부착됩니다. 가능한 한 많은 액체를 제거하되 완전히 건조되지 않도록 하십시오. 다음으로 유충 필레를 탈수하고 35 % 에탄올로 시작하여 50 %, 70 %, 95 %, 100 %, 마지막으로 두 번째 100 % 에탄올 목욕을 10

에탄올 목욕을 따라 자일렌으로 10분 목욕을 두세 번 합니다. 그런 다음 깨끗한 슬라이드에 DPX 한 방울을 떨어뜨리고 커버 슬립을 DPX에 조심스럽게 놓고 면이 아래로 향하게 채웁니다. 슬라이드를 어두운 곳에 두고 DPX가 설정될 때까지 하루를 기다립니다.

in vivo 및 focal microscopy를 사용하여 조직을 이미징하기 전에 이와 같은 이미지를 캡처할 수 있습니다. 클래스 4 수지상 수목 뉴런의 전체 아버. 이것은 형태학을 보존하기 위해 올바르게 고정된 IHC로 표시된 클래스 3 뉴런의 수지상 아버를 클로즈업

삽입은 실패한 해부 및 고정 후에 발생할 수 있는 성능 저하를 보여줍니다. 이 오버레이는 CNS의 단일 클래스 4 축삭 말단을 보여줍니다. 축삭돌기는 녹색의 안티 GFP로 표시되고 모든 클래스 4 흰개미는 마젠타색의 안티 CD 2로 염색 된 co로 표시됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 주변부에서 CNS까지 축삭을 추적하여 샘플을 신속하게 해부하고 고정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 각 신체의 PNS 뉴런은 환기 신경 코드의 인지 분절로 투영을 분할한다는 점을 명심하는 것이 유용합니다. 또한 수상돌기만 시각화하려는 경우 해부 중에 CNA를 제거하면 플레이트가 아닌 튜브를 추가하여 염색을 수행할 수 있습니다.

수상돌기 이미징을 위해 이러한 필릿을 장착할 때는 먼저 입 고리로 머리를 자르고 반짝임으로 뒤쪽을 잘라냅니다. 즐거움 준비를 위해.