의 형태학의 분석 Drosophila 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

본 실험 절차의 전반적인 목적은 초파리 유충의 수지상 분지 뉴런의 상세한 형태를 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배아를 수집하고 성숙시킨 후, 열 충격으로 유도된 flipase 발현을 통해 GFP가 표지된 유전적 클론을 생성합니다. 두 번째 단계에서는 형광 뉴런 클론이 있는 유충을 선택하여 이들의 수지상 ABA 이미지를 촬영합니다.

라바(lava)를 이미징한 후, 이를 해부하고 고정하며 면역 염색하여 마운트함으로써 공초점 면역형광 현미경을 통해 수지상 돌기 하버와 축삭 말단 형태를 시각화할 수 있습니다. 오늘은 유전적 모스(mos)를 이용한 sula 하부 말초 센서 OID 및 엑손의 형태학적 분석 프로토콜을 시연하겠습니다. 이 방법은 신경 정체성, 수지상 구강 형태 및 외부 배선을 제어하는 유전적 프로그램은 무엇인가와 같은 신경 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

사과 즙 플레이트에 배아를 수집하여 이 프로토콜을 시작하십시오. 열 충격은 38 °C 항온수조에서 가하며, 지속 시간은 배아의 유전형과 원하는 클론 크기에 따라 달라집니다. 본 프로토콜에서는 pand 수지상 돌기 분지 뉴런 드라이버를 가진 배아로부터 markum 클론을 생성합니다. 열 충격을 가하기 전, 마커 배아를 습윤 조직으로 감싸 25 °C에서 2시간 동안 유지하십시오.

빈 플레이트와 파라필름을 사용하여 수몰 가능하게 만들어 열충격용 수집 플레이트를 준비합니다. 그 후 마커 배아에 1시간 동안 열충격을 가하여 작은 클론이나 단일 뉴런 표지를 생성합니다. 클론의 수를 늘리려면 배스에서 45분간 배양하고, 이어서 실온에서 30분, 다시 배스에서 30분 동안 배양하는 연장 열충격 방식을 사용하십시오.

플립아웃(flipout) 클론을 생성하려면 24시간 동안 연속적으로 배아를 수집하십시오. 이 프로토콜은 4등급 특이적 드라이버를 사용합니다. 열충격 처리 후 1시간 동안 플립아웃 배아에 열충격을 가하십시오.

수집 플레이트를 습윤한 조직과 배양액으로 둘러싸인 10 centimeter 페트리 접시에 넣습니다. 배아 배양 중 배아의 온도는 25 degrees Celsius로 유지하며, 필요에 따라 효모 페이스트를 보충합니다. 영양 상태가 신경세포 발달에 결정적인 영향을 미치기 때문입니다.

3령 유충을 수집할 수 있을 때까지 배양을 유지한 다음, 3령 유충을 수돗물로 짧고 부드럽게 헹구어 한천 플레이트로 옮깁니다. 이제 고배율 형광 해부 현미경과 곤충 핀셋을 사용하여 유충을 관찰합니다. 체벽에 GFP 양성 신경세포가 있는 유충을 식별하여 80% glycerol 한 방울이 떨어져 있는 오목 슬라이드로 옮깁니다.

슬라이드 위에 커버 슬립을 덮어 유충을 고정합니다. 유충과 커버 슬립 사이에 공기가 남지 않도록 합니다. 표준 공초점 현미경을 사용하여 유충의 큐티클을 통해 관찰하고자 하는 뉴런을 시각화합니다.

더 나은 관찰 각도를 위해 라바(lava)의 위치를 변경하려면, 커버슬립을 부드럽게 밀어 라바를 굴립니다. 곤충 핀셋을 사용하여 라바를 SIL 가드 플레이트로 옮기는 것으로 이 프로토콜을 시작하십시오. 그 다음, 전단과 후단을 핀으로 고정합니다.

그 다음 칼슘이 없는 HL 3.1 버퍼를 추가합니다. 이제 전후축에 수직이 되도록 lava의 양 끝단을 중간까지 절개합니다. 그런 다음 두 기관 사이의 중앙선을 따라 절개합니다.

장(gut)을 조심스럽게 제거하기 전에 체벽으로 연결된 각각의 기관 연결 부위를 세밀하게 절단하십시오. 이렇게 하면 말초신경계(PNS)와 중추신경계(CNS) 사이에 흐르는 분절 신경을 온전하게 유지할 수 있습니다. 유충이 셀 가드 플레이트에 고정된 상태에서, 완만한 회전 쉐이커를 사용하여 실온의 PBS 내 4% Para formaldehyde에서 20분 동안 고정하십시오. 각 해부 과정은 5분 이내에 완료해야 합니다.

그렇지 않으면 가지돌기 권한 뉴런의 신경돌기가 분해되기 시작합니다. 고정 후, 과잉 유충 조직을 제거합니다. 그런 다음 필렛을 PBST로 10분씩 3회 세척합니다.

세척 후, 유충을 블로킹 용액이 담긴 상태에서 실온의 완만한 진탕과 함께 20분 동안 배양합니다. 블로킹이 완료되면 블로킹 용액을 1차 항체 용액으로 교체합니다. 샘플을 습윤한 조직으로 둘러싸인 작은 플라스틱 용기에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 실온에서 1시간 더 추가 배양을 진행합니다.

그 다음, lava 필렛을 PBST로 10분씩 6회 세척합니다. 이제 2차 항체를 첨가하고, 형광 물질의 광퇴색을 방지하기 위해 필렛을 차광 용기에 넣습니다. 필렛을 실온에서 수 시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 실온에서 1시간 동안 추가로 배양합니다.

마지막으로 필렛을 PBST로 10분씩 6회 세척합니다. 그러면 조직을 마운팅할 준비가 됩니다. 축삭 말단을 시각화하려면, 유충 필렛의 큐티클 면이 아래로 향하게 하여 오목 슬라이드 내의 80% glycerol에 마운팅하십시오.

수지상 돌기의 이미지를 더 선명하게 얻으려면, PLL이 코팅된 커버슬립으로 영구 표본을 제작하십시오. 커버슬립을 코팅하기 위해 PLL 분액물을 준비합니다. 이를 2중 증류수 10 milliliters로 희석하고 20 microliters의 Kodak photo flow를 첨가합니다.

커버슬립을 PLL 용액에 30분 동안 담근 후, 꺼내어 공기 중에서 건조합니다. 그다음 물과 공기로 짧게 헹구고 다시 건조합니다.

이 과정을 두 번 반복합니다. PLL 배스(bath)부터 시작하여, 처리된 커버슬립은 약 한 달 동안 사용할 수 있습니다. 이제 해부한 유충의 필렛(fillet)을 PLL 커버슬립 위의 PBS 한 방울에 근육 면이 아래로 향하게 하여 마운팅합니다.

티슈 페이퍼를 사용하여 필렛을 커버 슬립에 빠르게 부착시킵니다. 액체를 가능한 한 많이 제거하되, 완전히 마르지 않도록 주의하십시오. 다음으로 유생 필렛을 탈수시키는데, 35% ethanol을 시작으로 50%, 70%, 95%, 100% 순으로 각각 10분간 에탄올 배스(ethanol bath) 처리를 하며, 마지막으로 100% ethanol 배스 처리를 한 번 더 수행합니다.

에탄올 세척 후, 자일렌(xylene)에서 10분씩 2~3회 세척합니다. 그런 다음 깨끗한 슬라이드 위에 DPX를 한 방울 떨어뜨리고, 커버 슬립을 DPX 위에 조심스럽게 놓은 뒤 뒤집어서 채웁니다. 슬라이드를 암소에 보관하고 DPX가 굳을 때까지 하루 동안 기다립니다.

in vivo 및 초점 현미경을 사용하여 조직을 이미징하기 전에, 이와 같은 이미지를 캡처할 수 있습니다. 이는 4급 수지상 돌기 뉴런의 전체 수지상 구조입니다. 이것은 형태학적 구조를 보존하기 위해 적절히 고정된 IHC 표지 3급 뉴런의 수지상 돌기를 확대한 모습입니다.

삽입도는 성공적이지 못한 해부 및 고정 후에 발생할 수 있는 퇴화 과정을 보여줍니다. 이 오버레이는 중추신경계(CNS) 내의 단일 4등급 축삭 말단을 보여줍니다. 축삭은 anti GFP로 녹색으로 표지되었으며, 모든 4등급 말단은 anti CD two로 마젠타색으로 공동 염색되었습니다.

이 절차를 수행할 때, 말초에서 중추신경계(CNS)로 이어지는 축삭을 추적하여 샘플을 빠르게 해부하고 고정하는 것이 중요합니다. 각 신체의 말초신경계(PNS) 뉴런이 복측 신경 코드의 인지 세그먼트로 분절 투사된다는 점을 유념하는 것이 유용합니다. 또한, 수상돌기만 시각화하려는 경우에는 해부 과정에서 CNAs를 제거하고, 염색은 플레이트 대신 튜브에 넣어 수행할 수 있습니다.

수지상 돌기 이미징을 위해 이 필레를 마운팅할 때, 먼저 마우스 훅(mouth hooks)을 사용하여 머리 부분을 절단하고 스파클(sparkles)을 사용하여 후방 부분을 절단하십시오. 이는 원활한 표본 준비를 위한 것입니다.