Name: 배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화 Drosophila (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴을 면역조직화학법으로 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 신경 발달 과정에서 축삭 경로 탐색과 표적 인식을 정밀하게 분석할 수 있게 해줍니다.

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Alex L. Kolodkin에게 감사의 말을 전합니다. 그의 실험실에서이 필렛 준비 프로토콜을 배웠습니다. 홍영기 씨에게도 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ)에 의해 지원되었습니다.

1. 준비 <ol><li> 1X PBS 500 mL에 소 혈청 알부민 (BSA) 0.5 g과 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (표 2 참조) 0.5 mL를 첨가하여 t- 옥틸 페녹시 폴리에 톡시 에탄올 (PBT) 용액으로 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 30 분 이상 교반 하였다. 4 ° C에서 보관하십시오. 비교적 신선한 상태에서 사용하고 용액을 깨끗한 병에 보관하십시오. </li><li> 탈 이온수 6.5 mL에 16 % 스톡 파라 포름 알데히드 용액 2.5 mL와 10 mL PBS 1 mL를 넣어 4 % 파라 포름 알데히드 10 mL를 만든다. 4 ° C에서 보관하고 일주일 이내에 사용하십시오. 주의 : 파라 포름 알데히드 용액은 독성이 강하기 때문에 피부와의 접촉을 피하십시오. </li><li> 1 ML의 DMSO 당 0.1 g의 X-Gal 기질을 용해하여 X-Gal 기질 (10 % w / v X-Gal / dimethyl sulfoxide (DMSO))을 만든다. 100 μL 분취 량으로 -20 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 10 MM 인산 완충액 (산도 7.2), 150 MM NaCl, 1 MM MgCl 2 , 3m을 사용하여 X - Gal 얼룩 솔루션을 확인하십시오MK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ], 및 0.3 % t- 옥틸 페녹시 폴리에 톡시 에탄올. 어둠 속에서 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 탈 이온수로 30 % 스톡 과산화수소 1:10을 희석하여 3 % 과산화수소 용액을 만드십시오. </li><li> 신선한 PBT 용액 35 mL에 DAB 1 정 (10 mg)을 완전히 녹여 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘 (DAB) 용액을 만든다. 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과하고 -20 ℃에서 보관하십시오 (910 μL 분취 량). 주의 : 모든 DAB 폐기물을 표백제로 처리하여 DAB를 폐기하십시오. </li><li> 사과 주스로 달걀 접시를 만드십시오. 한천 35g과 탈 이온수 1L를 2L 플라스크에 넣는다. 1L 플라스크에 33g의 자당, 2g의 테 고세이트 및 375ml의 사과즙을 넣는다. 30 분 동안 고압 증기 멸균으로 그들을 녹입니다. 두 용액을 약 60 ° C로 식힌다. 이 용액을 잘 저 어서 혼합하고 혼합하십시오. 60mm 배양 접시 당 ~ 11mL의 혼합 용액을 붓습니다. </li><li> 빵 굽는 사람을 혼합해서 효모 풀을 만드십시오(1 : 0.8 비율)에 넣고 4 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 2. 배아 컬렉션 (주 1) <ol><li> 젊은 암컷과 수컷 파리 (5 일 미만)를 모으고 1-2 일 동안 센터에 소량의 효모 페이스트가 들어있는 난 접시 (60mm x 15mm)가있는 플라스틱 비이 케이지에 넣어 유지하십시오. </li><li> 후기 16 기 배아를 최적으로 채취하려면 오후 5 시경 파리 (&gt; 50)로 병 케이지를 설치하고 25 ° C에서 3 시간 동안 알을 낳게하십시오. </li><li> 파리를 신선한 음식 병으로 옮기십시오. </li><li> 뚜껑을 달고 계란 접시를 닫고 25 ℃에서 거꾸로 가온하십시오. 가습기 배양기 (~ 70 % 습도) 하룻밤. </li></ol> 3. 면역 염색을위한 태아 준비 (2 일째) <ol><li> 오전 10시 20 분경에 계란 판에 PBT 용액 1.8 mL를 넣고 면봉을 사용하여 접시에서 태아를 느슨하게합니다. 참고 : 부드럽게 cott를 사용하여 효모 붙여 넣기를 매시함으로써면봉에 많은 배아가 발견 될 경우를 대비해 용해하십시오. 고정하기 전에 ~ 40 분 전에 태아 수집을 시작하십시오 (오전 11 시경). </li><li> 난 접시에서 1 ML 피펫 팁을 사용하여 1.5 ML의 마이크로 튜브로 배아를 전송합니다. </li><li> 배아가 정착하고 가능한 한 PBT 솔루션을 대기음을 허용합니다. 배아를 PBT 솔루션 1 ML로 두 번 씻어. 가능한 한 많이 PBT 용액을 흡인하십시오. </li><li> 50 % 표백제 ( 즉, 탈 이온수로 희석) 1 ML로 튜브를 채우고 실내 온도 (RT)에서 3 분 nutator에 배양하여 배아 dechorionate. 참고 :이 단계는 dechorionated 배아를 죽이지 않습니다. </li><li> dechorionated 배아가 정착되도록 가능한 50 % 표백제를 대기음, 그리고 PBT 솔루션 1 ML로 배아를 3 번 ​​씻어. </li><li> 헵탄 0.5 mL를 넣고 4 ° 파라 포름 알데히드 용액 0.5 mL를 실온에서 오전 11 시경에 관에 넣는다. </li><li> 인큐베이터RT에서 15 분 동안 nutator에 배아. </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드 용액 (바닥층)을 제거한다. </li><li> 100 % 메탄올 0.5 ML을 추가하고 격렬하게 30 초 동안 튜브를 흔드는하여 배아를 devitellinize. </li><li> 헵탄 ( 즉, 상단 층)을 제거하십시오. </li><li> 100 % 메탄올 0.5 ML을 추가하고 격렬하게 10 초 동안 튜브를 흔드십시오. </li><li> 튜브를 도청하여 배아가 정착되도록 최대한 메탄올을 대기음. 10 초 미만 동안 흔들어 100 % 메탄올 1 ML로 배아를 씻어. 주 : 메탄올에 장시간 노출되면 β-Gal 활성이 파괴됩니다. </li><li> 메탄올을 제거하고 PBT 솔루션 1 ML로 devotellinized 배아를 3 번 ​​씻어. </li></ol> 4. LacZ 얼룩을 사용하여 태아의 유전자형 결정 (2 일째) <ol><li> 튜브에 1 ML의 PBT 솔루션을 추가하고 15 분 37 ° C 열 블록 또는 수조에서 튜브를 품어. </li><li> 배양하는 동안, X-Gal 염색 용액 (1 mL / tu) 65 ° C에서 수욕에서 흐려질 때까지. 37 ° C 수 욕조에서 그것을 품어. </li><li> PBT 솔루션을 대기음 튜브에 X - Gal 얼룩 솔루션 1 ML 및 X - 갈색 기판 20 μL를 추가합니다. </li><li> 푸른 침전물이 분명 때까지 계곡과 37 ° C에서 튜브를 품어. 참고 : 2 차 및 3 차 블루 밸런서의 배양 시간은 일반적으로 2 ~ 4 시간입니다. </li><li> X - Gal 얼룩 솔루션을 제거하고 1 ML의 RT PBT 솔루션으로 배아를 씻어 3 회. </li><li> 바늘 프로브 또는 포 셉를 사용하여 원하는 유전자형 ( 즉, 비 얼룩 흰 배아)의 배아를 빛 해부 현미경 (1.6X - 2.5X 목적)과 손으로 정렬합니다. 주 : CyO, 액틴 -LacZ 및 TM3, 액틴 -LacZ 와 같은 일부 청색 밸런서는 액틴 프로모터의 제어하에 박테리아 β-Gal (LacZ)을 발현하는 트랜스 제닉 구조물을 지니고 있기 때문에, 유비쿼터스 방식으로 청색으로 착색 된 배아는블루 밸런서 염색체 하나 또는 두 개의 복사본. 따라서 염색되지 않은 흰 배아는 원하는 치사 대립 유전자에 대해 동형 접합체이다. </li></ol> 5. 항 Fasciclin II 항체로 태아의 Immunostaining (2-3 일) <ol><li> 수집 및 1 ML 피펫 팁을 사용하여 0.5 ML microtube에 원하는 유전자형 ( 즉, 비 얼룩 흰 배아)의 배아를 전송할 수 있습니다. 참고 :이 단계에서 배아는 표피의 세분화 패턴과 머리와 꼬리의 구조를 포함하여 형태 학적 기준에 따라 대략적으로 스테이징 될 수 있습니다. 머리가 빠져 나가는 동안, 난자가 놓인 후 10 시간에서 16 시간 사이에, 배아는 가장 앞쪽에있는 부분을 현저히 감소시킵니다. </li><li> 배아를 0.4 mL의 PBT 용액으로 한번 씻고 0.3 mL의 블로킹 용액 (5 % 정상 염소 혈청 및 5 % DMSO를 PBT 용액에 넣는다)을 넣는다. </li><li> 15 분 RT에서 nutation과 배아를 차단합니다. </li><li&gt; 항 Fasciclin II 항체 75 μL를 추가하고 하룻밤 RT에서 관상 동맥과 튜브를 품어. </li><li> 배양액을 0.4 mL의 PBT 용액으로 4 회 씻으십시오. </li><li> 염소 항 마우스 HRP 항체 (2 μg / ML)를 포함하는 차단 용액 (PBT 용액에 5 % 정상 염소 5 %) 0.3 ML을 추가하고 하룻밤 RT에 nutration와 튜브를 품어. </li><li> 배양액을 0.4 mL의 PBT 용액으로 6 회 씻으십시오. </li><li> 튜브에 DAB 용액 0.3 mL를 넣는다. 주의 : 장갑을 착용하고 모든 DAB 폐기물 / 튜브 / 팁을 표백제에 넣으십시오. </li><li> 3 % 과산화수소 2 μL를 추가하고 침전물의 원하는 금액이 생산 때까지 RT에서 열차와 어둠 속에서 튜브를 품어. 참고 : 1D4 면역 조직 화학 요법의 배양 시간은 일반적으로 0.5-1 시간입니다. </li><li> 0.4 ML의 PBT 솔루션으로 배아를 4 번 씻으십시오. 주의 : DAB 용액을 제거하고 처음 두 번의 세척은 피펫과 di표백제에 그들을 두려워하십시오. </li><li> RT 또는 4 ° C에서 튜브에 70 % 글리세롤 / PBS 용액을 올려 놓고 0.2 mL를 넣으십시오. 참고 : 튜브는 빛으로부터 멀리하십시오. 배아를 90 % 글리세롤 / PBS 용액에 넣음으로써 더 깨끗한 준비를 할 수 있습니다 10 . 그러나, 90 % 글리세롤 / PBS 솔루션 10 에서 제거 된 것보다 90 % 글리세롤 / PBS 솔루션에서 제거 된 배아를 해부하는 것이 더 어렵습니다. </li></ol> 6. 준비, 해부, 설치 및 이미징 (4 일) <ol><li> 준비를 위해 70 % 글리세롤 / PBS로 평형 배아를 슬라이드 유리에 옮기십시오. </li><li> 복부 부분 7 (A7), A8 및 A9 ISN 신경이 서로 닿기 위해 수렴하거나 / 또는 3 개의 밴드로 세분되는 중간 덩어리를 가진 늦은 무대 -16 배아를 수집합니다. 참고 : 1D4 항체로 얼룩진 태아는 ISN 및 ISNb 모터 axons의 투영 패턴을 기반으로 준비 할 수 있습니다. CNS, A7, A8 및 A9 ISN ne를 종료 한 후후기 16 단계 태아의 줄기는 서로 닿기 위해 수렴하고 이후에 서로 엇갈려서 등 근육으로 멀리 확장됩니다 ( 그림 1A의 화살촉). 그러나 16 단계 중반의 배아에서는 A7 ISN 신경이 A8 / A9 신경과 평행하게 확장됩니다 ( 그림 1B의 대괄호). 또한, 양쪽 hemisegments의 A6 ISNb 신경 (ventralateral 근육에 수직)의 투영 축은 대략 CNS 종축 axon fascicles ( 그림 1C의 화살표와 라인)의 후부와 정렬됩니다. 이러한 형태학적인 기준은 다른 유전형간에 다소 차이가 있습니다. 또는, 배아는 창자 형태학에 기초하여 준비 될 수있다 9 , 11 . 17 단계 이전에, midgut은 가슴과 같은 모양을 가지고있는 반면, midgut은 17 단계 12 단계로 세 개의 밴드로 세분됩니다. </li><li> 배아를 해부하십시오. <ol><li> 1m 사용L 주사기, 글리세롤 드롭에서 각 배아를 이동하고 배아 복부 - 얼굴을 위로 놓습니다. 전신 부분의 1/4과 전 축삭 돌기가없는 가장 후방 부위에서 앞쪽 부분을 잘라냅니다. </li><li> 바늘 탐침을 사용하여 글리세롤 드롭에서 끝 컷 배아를 움직여 배면쪽으로 위로 향하게하고 롤을 필드에 수평으로 놓습니다. 참고 : 배아가 글리세롤 방울 밖으로 옮겨지면 배아와 관련된 글리세롤이 약간 끈적 거리게됩니다. </li><li> 하나의 매우 미세한 텅스텐 바늘 13을 사용하여 지느러미 중간 선을 따라 배아를 잘라내십시오. 배아의 후부 끝 부분에 작은 상처를 만들고 앞쪽을 향해 지느러미 중간 선을 계속 잘라내십시오. 반대 방향으로 절단해도 괜찮습니다. </li><li> 바늘 탐침을 사용하여 정중선 절단 배아를 글리세롤 방울로 옮기고 등쪽면을 위로 향하게하고 각 몸 벽을 ventralateral (대각선) 방향으로 펼쳐서 몸 벽에서 창자를 분리합니다 (2.5X 목표). 참고 : 등쪽 중간 선이 완전히 절단되어 왼쪽 및 오른쪽 몸체 벽이 완전히 분리되도록하십시오. </li><li> 조심스럽게 정중선 컷 배아를 글리세롤 드롭 밖으로 이동하고 미세 바늘 프로브 (2.5X 객관적인)를 사용하여 유리 슬라이드에 몸 벽의 두 플랩을 내려 놓으십시오. </li><li> 아주 미세한 텅스텐 바늘을 사용하여 내부 장기를 옆으로 밀어 (5X 객관적인) 해부 된 배아에서 제거하십시오. 참고 : 비슷한 해부 절차에 대한 자세한 설명은 웹 사이트 5 에서 찾을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 장착을 위해 깨끗하고 해부 된 배아에 70 % 글리세롤 / PBS 용액 2 ~ 3 μL를 넣고 미세 바늘 프로브를 사용하여 7 μL의 70 % 글리세롤 / PBS 용액이 퍼져있는 새로운 유리 슬라이드로 옮깁니다 센터 (2.5X 대물 렌즈). </li><li> 커버 슬립 (18mm x 18mm)을 착용하십시오. 정기 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 봉인하십시오 (맑거나 채색이 좋다). </li><li> 제조업체의 지침에 따라 차동 간섭 명암 (DIC) 광학 현미경으로 고해상도 (20X, 40X 및 63X 오일 침지 대물 렌즈)로 이미지를 캡처합니다. 참고 : 특히 ISNb 모터 축삭 돌기에 대한보다 나은 시각화 및 표현형 특성 분석은 63X 오일 침지 객관 물을 사용하여 생성 할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그가 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언한다.

모터 축색 돌연변이 결함의 세부 사항은 DAB로 얼룩진 배아의 filleted 준비가 형광으로 표시된 것들의 공 촛점 현미경 검사보다 더 빠르고 정확도가 높습니다. 따라서, 고정 및 1D4 얼룩 배아의 필렛 된 준비는 안내 큐 분자의 기능적 특성 결정에 가장 적합합니다. 넷린, 슬릿, 세마포린 (semas) 및 에프 린을 비롯한 네 가지 주요 안내 단서와 그 동족 수용체는 웜, 파리 및 척추 동물을 통해 진화 적으로 보존 된 역할을합니다 20 . Drosophila Robo는 Slit에 대한 수용체 역할을하는 원형 (Robo) 계열 분자 중에서 CNS 6 에서 반발 유도 기능을 매개하는 것으로 처음 확인되었습니다. Semas는 plexin-containing 수용체 복합체 22 에 결합하는 안내 분자의 큰 계열입니다. Semas의 축삭 유도 기능메뚜기 CNS <sup class="xr...

배아 발생 과정에서 모터 축삭과 표적 근육 사이의 정확하고 선택적 연결은 Drosophila 애벌레의 정상적인 이동에 필수적 입니다. 복부 hemisegment A2-A7 각각에서 30 개의 근육 섬유의 배아 패터닝은 단계 16 1 에 의해 확립된다. 복부 신경 코드에서 생성 된 36 개의 운동 뉴런은 축삭을 주변으로 확장시켜 특정 표적 근육을 신경 자극합니다 2 . 모터 축색 돌연변이와 표적인지는 항체 (마우스 단클론 항체 1D4) 3 , 4로 면역 조직 화학으로 시각화 할 수 있습니다. 야생형 배아에서 모터 축삭 돌기 패턴의 다중 이미지는 웹 5에서 사용할 수 있습니다. 1D4 항체는 배아 중추 신경계 (CNS) 4 정중선의 각 측면에있는 모든 모터 축삭 및 세 개의 세로축 축삭 줄기를 표시합니다 </sup&gt; , 6 ( 도 1C 및 도 2A ). 따라서 FasII 항체를 이용한 면역 조직 화학은 운동 축삭 유도 및 표적 인식의 기본이되는 분자 메커니즘을 증명하기 위해 신경근 연결에 필요한 유전자를 확인하는 강력한 도구를 제공합니다. 복부 hemisegments A2-A7의 각각에서, 모터 축삭 돌기는 2 개의 주요한 신경 가지로 분열 신경 (SN) 및 intersegmental 신경 (ISN) 2 및 4 , 및 작은 신경 분기, TN ) 7 . SN은 ISN, ISNb 및 ISNd 2 , 4 라고 불리는 3 개의 신경 가지로 분할하는 반면, SN은 선택적으로 탈 섬유되어 두 개의 신경 가지 인 SNa 및 SNc를 발생시킵니다. 그 중에서도 ISN, ISNb 및 SNa 모터 축삭투상 패턴은 말기 16 기 배아가 FasII 항체로 염색되고 필렛 처리되면 가장 정확하게 시각화됩니다 ( 그림 1C 및 그림 2A ). ISN 운동 뉴런은 축삭을 등쪽 근육 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19, 20 2 , 4 ( 그림 2A )를 자극하도록 확장시킵니다. ISNb 모터 뉴런은 6, 7, 12, 13, 14, 28 및 30 2 , 4 ( 그림 2A 및 2B)의 복근 근육을 자극합니다. SNa 신경 가지는 측면 근육 5, 8, 21, 22, 23 및 24 2 , 4 ( 그림 2A )에 신경을 작용하도록 돌출합니다. 두 모터 엑손으로 구성된 TN은 근육을 자극 할 수 있도록 분절 경계를 따라 일 측적으로 돌출하고, 근육에서 신경 양측 신경근 (lateral bipolar dendritic neuron, LBD)과 시냅스를 만든다.( 도 7 ). 이러한 목표 근육 내향은 특정 ​​선택 지점에서 모터 축삭의 선택적 탈 섬유화뿐만 아니라 근육 인식을 목표로합니다. 또한, 중간 표적으로 작용하는 일부 추정 중배엽 안내 표지 세포는 ISN 및 SNa 경로 모두에서 발견되었지만 ISNb 경로에서는 발견되지 않았다. 이것은 ISNb 모터 축삭 길 찾기가 ISN 및 SNa 모터 축삭 유도와 비교하여 뚜렷한 방식으로 조절 될 수 있음을 시사하며, 또한 말초 모터 축삭 유도가 단일 안내 큐의 차별적 인 또는 보존 된 역할을 연구하기위한 매력적인 실험 모델을 제공한다는 것을 나타낸다 분자 8 . 이 작품은 Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 axonal 투영 패턴을 시각화하는 표준 방법을 제공합니다. 설명한 프로토콜은 1D4로 얼룩진 고정 배아를 해부하는 방법을 포함filtted 제제의 경우 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘 (DAB)으로 가공한다. 고정 배아의 편평한 준비의 한 가지 중요한 이점은 주변에서 축삭 돌기 및 근육 패턴의 더 나은 시각화입니다. 또한,이 작품은 또한 LacZ 얼룩 방법을 사용하여 원하는 돌연변이 배아를 정렬 고정 배아를 유전자형하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>X100</td><td>t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올</td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드 용액</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마-알드리치</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td><td>성 시그마-알드리치</td><td>71500</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal 기판</td><td>US Biological</td><td>X1000</td><td>X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-D-갈락토시드 갈락토피라노사이드)</td></tr><tr><td>디메틸설프사이드</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 헥사시아노페레이트(II) 삼수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 헥사시아노페레이트(III)</td><td>시그마-알드리치</td><td>244023</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>시그마-알드리치</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>US Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Tricon Beaker</td><td>Simport</td><td>B700-100</td><td>이것은 배아 채취를 위한 플라스틱 비커 케이지를 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>효모</td><td>Societe Industrielle Lesaffre</td><td>Saf 인스턴트 효모 레드</td><td></td></tr><tr><td>코튼 면봉 (나무 단일 팁 코튼 PK100)</td><td>VWR</td><td>14220-263</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube (1.5 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>#72.690</td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>The Clorox Company</td><td>Clorox</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1230</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FasciculinII 항체</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>1D4 anti-Fasciclin II</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-mouse-HRP 항체</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-068</td><td>AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 유리</td><td>듀란 그룹</td><td>235501403</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>듀란 그룹</td><td>235503104</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>Becton Dickinson Medical(s)</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 바늘</td><td>Ted Pella</td><td>#27-11</td><td>텅스텐 와이어, &oslash; 0.13mm/6.1m (&oslash;. 005인치/20피트)</td></tr><tr><td>Nutator (Mini twister)</td><td>Korean Science</td><td>KO. VS-96TWS</td><td>대안, BD 클레이 아담스 브랜드 너트 (BD 421125)</td></tr></tbody></table>

배아 운동 뉴런의 axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; drosophila</em

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

기능적 신경근 회로의 구축은 모터 축색 돌기와 표적 근육의 정확한 연결에 의존한다. 모터 뉴런은 주변 세포 외 환경에서 발생하는 많은 수의 축색 유도 신호에 반응하여 특정 경로를 따라 이동하기 위해 성장 원뿔을 확장시킵니다. 성장 원뿔 표적 인식은 또한 신경근 특이성에 중요한 역할을합니다. 이 연구는 후기 무대 16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 immunohistochemistry 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 원하는 돌연변이 배아를 분류하기위한 genotyping 절차를 포함한 몇 가지 주요 단계가 포함되어 있습니다. 배아에 fasciclin II (FasII) 항체를 표지하기위한 면역 염색 절차; 및 해부 절차, 고정 배아에서 filleted 준비를 생성합니다. 말초의 모터 축삭 돌기 및 근육 패턴은 filleted embryos의 편평한 준비 과정에서 wh보다 훨씬 더 잘 시각화됩니다올레 - 마운트 배아. 따라서, FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 모터 축색 돌연변이 및 표적 인식에 필요한 유전자를 특성화하기위한 강력한 도구를 제공하며, 기능 상실 및 기능 상실 유전 스크린 모두에 적용될 수있다 .

신경 발달 동안 모터 축삭과 표적 근육 사이의 정확한 연결은 선택적 축삭 - 축색 반발과 특정 선택 지점에서의 표적 인식에 달려 있습니다 4 . 초파리에서 모터 축삭 사이의 선택 반발은 부분 1과 2 세마포린 (Sema-1a, Sema-2a, Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . 따라서 Sema-1a 기능이 상실되면 ISNb 축삭 돌기가 특정 선택 지점에서 결석이 제거되어 비정상적으로 두꺼운 형태를 보이지 않게됩니다 ( <strong...

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

이 실험의 전반적인 목표는 초파리(Drosophila melanogaster) 후기 배아의 운동 신경세포 투사 패턴을 분석하는 것입니다. 이 방법은 운동 축삭 유도 및 신경 하위 회로 형성 등 신경 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 발달 중인 배아 내 운동 축삭을 정밀하게 시각화하여, 축삭 경로 탐색 및 표적 조건 결함을 신뢰성 있게 분석할 수 있다는 점입니다.알 수집 플레이트를 설치한 하루 후, 갓 만든 효모 페이스트를 소량 도포한 새 플레이트로 교체합니다. 새 플레이트에서 3시간이 지난 후, 초파리를 새로운 먹이 병으로 옮깁니다. 그리고 알 플레이트를 25 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.오전에 플레이트에 PBT 용액 1.8 milliliters를 첨가합니다. 그리고 면봉을 사용하여 배아를 떼어냅니다. 그런 다음, 1 milliliter 피펫을 사용하여 배아와 용액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.배아가 바닥에 가라앉으면 용액을 가능한 한 많이 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 1 mL의 PBT를 사용하여 배아를 두 번 헹굽니다. 배아의 난막을 제거하려면 마지막 헹굼 단계를 1 mL의 50% bleach로 대체하고, 실온에서 튜브를 3분 동안 흔들어 줍니다.표백제를 제거하기 위해 배아를 PBT로 3회 헹굽니다. 그런 다음, 마지막 세척액을 100% heptane 0.5 mL와 4% paraformaldehyde 0.5 mL로 교체합니다. 이제 배아를 부드럽게 흔들어주며 15분 동안 배양합니다.배양 후, 하층액을 제거하고 100% methanol 500 µL를 다시 첨가합니다. 다음으로, 배아의 난황을 제거(devitellinize)하기 위해 30초 동안 튜브를 강하게 흔들어 줍니다. 그 후, 상층액을 제거하고 100% methanol 500 µL를 다시 첨가한 뒤 10초 동안 더 흔들어 줍니다.튜브를 흔든 후, 배아가 가라앉도록 가볍게 두드리고 용액을 가능한 한 많이 제거합니다. 다음으로, 100% methanol로 배아를 짧게 헹굽니다. 그 후, 즉시 PBT로 배아를 세 번 헹굽니다.이제 배아를 1 mL의 신선한 PBT에 다시 부유시킵니다. 그리고 LacZ 염색을 준비하기 위해 배아를 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 배아가 배양되는 동안 X-gal 염색액 1 mL 분량을 준비합니다.분취액이 탁해질 때까지 65 °C 항온수조에서 가온합니다. 그런 다음 37 °C 히팅 블록으로 옮깁니다. 배아를 15분 동안 가온한 후 PBT 용액을 제거하고, 1 mL의 염색액 분취액으로 교체합니다.그다음 X-gal 기질 20 µL를 첨가합니다. 청색 침전물이 형성될 때까지 튜브를 37 °C에서 가볍게 흔들어주며 약 2~4시간 동안 배양합니다. 그 후, 염색액을 제거하고 상온의 PBT로 배아를 3회 헹굽니다.세척 후, 해부 현미경 하에서 니들 프로브나 핀셋을 사용하여 배아를 수동으로 분류합니다. 염색된 관심 배아들을 1 mL 피펫을 사용하여 0.5 mm 마이크로 원심 분리 튜브에 수집하십시오. 다음으로, 선택한 배아들을 0.4 mL의 PBT로 세척합니다.그 다음, PBT를 0.3 milliliters의 블로킹 용액으로 교체하고 배아를 부드럽게 흔들어주며 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 1차 항체 75 microliters를 첨가하고 밤새 배양을 계속합니다. 다음 날 아침, 약 30분마다 세척액을 교체하며 PBT로 배아를 약 2시간 동안 세척합니다.세척 후, 2차 항체가 포함된 블로킹 용액 0.3 milliliters를 첨가하고 튜브를 실온에서 가볍게 흔들어주며 밤새 배양합니다. 다음 날 아침, 배아를 PBT로 약 3시간 동안 세척합니다. 세척 과정 동안 PBT를 최소 5회 교체하십시오.세척 후, 배아를 0.3 milliliters의 dab 용액에 다시 부유시키고 3% hydrogen peroxide 2 microliters를 첨가합니다. 그런 다음, 충분한 침전물이 생성될 때까지 실온에서 완만하게 흔들어주며 암소에서 배양합니다. 이 과정은 일반적으로 30분에서 60분 정도 소요됩니다.그 후, 배아를 PBT로 4회 헹구고 0.2 milliliters의 마운팅 용액에 다시 현탁합니다. 이제 배아가 4 degrees Celsius의 암소에서 평형을 이룰 수 있도록 둡니다. 배아를 필렛팅하기 위해 유리 슬라이드 위에 배치합니다.먼저 시료를 글리세롤 한 방울 위에 복측이 위로 향하도록 옮깁니다. 다음으로 해부 현미경 하에서 전단부와 몸길이의 1/4을 절단하고, 운동 신경삭이 없는 가장 후방 부위를 제거합니다. 이제 니들 프로브를 사용하여 준비된 시료를 글리세롤 밖으로 옮겨 배측이 위로 향하게 정렬하고 시야 내에 수평으로 배치합니다.다음 단계에서는 니들 프로브의 중공 영역에 삽입한 후 끝부분을 구부린 미세 텅스텐 바늘이 필요합니다. 텅스텐 바늘을 사용하여 배아의 후단에 작은 절개창을 내고 등쪽 정중선을 따라 계속해서 절개합니다. 해부 과정 중에 텅스텐 바늘의 끝이 유리 슬라이드 표면에 닿지 않도록 주의하십시오. 바늘이 유리에 닿으면 쉽게 구부러질 수 있기 때문입니다.그 다음, 프로브를 사용하여 시료를 다시 글리세롤 방울로 옮기고 등쪽이 위로 향하게 배치합니다. 그 상태에서 각 체벽을 배측-측면 방향으로 펼쳐 장을 체벽으로부터 분리합니다. 그러면 두 체벽이 서로 떨어지게 됩니다.이제 프로브를 사용하여 체벽 플랩을 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 슬라이드 위에서 텅스텐 바늘을 사용하여 내부 장기를 측면으로 밀어 제거합니다. 텅스텐 바늘을 고정하고 손상을 방지하려면, 중공 바늘(hollow needle) 내부에 프로브를 삽입한 상태를 유지하고, 텅스텐 바늘을 조작하는 동안 바늘이 유리 슬라이드 표면에 밀착되어 지지되도록 잡으십시오.이제 준비된 시료를 8 µL의 마운팅 용액과 함께 새로운 유리 슬라이드 위에 마운팅합니다. 커버 슬립을 덮고 가장자리를 일반 매니큐어로 밀봉합니다. 그 후, DIC 광학계를 사용하여 고해상도 이미지를 캡처합니다.설명된 방법을 사용하여 16단계 배아를 Fas2 항체로 염색하고, 운동 신경세포와 복부 반분절 A3 및 A4의 시각화를 위해 준비했습니다. 일반적으로 최소 7개의 운동 신경세포가 축삭을 뻗어 다발을 형성함으로써 ISNb 신경 분지를 구성합니다. 본 표본에서는 주변의 많은 신경 다발 또한 식별 가능했습니다. 절간 신경 다발이 근육 6과 7의 분기점에 도달하면, 두 개의 축삭이 선택적으로 다발에서 벗어나 근육 6과 7에 분포합니다.신경다발이 등쪽으로 뻗어 나감에 따라 다른 선택 지점에서도 동일한 현상이 발생합니다. 이후 마지막 선택 지점에서 두 개의 축삭이 근육 12를 지배하게 됩니다. 이와 대조적으로, Sema-1a 돌연변이 배아에서는 동일한 축삭들이 선택 지점에서 다발 풀림(defasciculate)에 실패합니다.Sema-1 aegean 산물이 신경 발달 과정에서 운동 축삭과 표적 근육 사이의 연결 형성을 돕는 것으로 알려져 있으므로 이는 예상 가능한 결과입니다. 따라서 설명된 방법을 사용하여 돌연변이 표현형을 분석할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 원하는 돌연변이 배아를 분류하는 방법, 운동 뉴런의 축삭 투사 패턴을 면역 염색하는 방법, 그리고 평면 표본 제작을 위해 고정된 배아를 해부하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

visualization-axonal-projection-pattern-embryonic-motor-neurons

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 개최 준비하는 절차를...

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

여기 스테인드에 대한 마운트 프로토콜을...

의 입식 이미징 Drosophila 태아

출처: Inal, M. A. et. al., Retrograde tracing of Drosophila Embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes(유성필 형광 염료를 사용한 {{}}초파리{{}} 배아 운동 뉴런의 역행 추적. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 친유성 염료를 사용하여 Drosophila 운동 뉴런의 역행 표지 방법을 보여줍니다. 염료는 축삭돌기로 들어가 역행적으로 이동하고 뉴런을 녹색으로 표시하여 컨포칼 현미경 하에서 뉴런의 형태와 투영을 자세히 시각화할 수 있습니다.

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes (형광 친유성 염료를 사용한 초파리 운동 뉴런의 역행 라벨링)

출처: Guan, W., et. al. 시각화 Drosophila  다리 운동 뉴런은 성인 표피를 통해 축삭을 형성합니다. J. Vis. Exp. (2018년) 이 비디오는 다음의 이미징을 보여줍니다.Drosophila 다리. 레이저와 두 개의 검출기가 GFP와 큐티클 자가형광을 포착합니다. 이미지는 채널을 분할하고, 자가형광을 빼고, 착색된 복합 이미지로 병합하여 다리 세그먼트 내의 축삭을 시각화하여 처리됩니다.

Imaging of fluorescently-labeled motor neurons in an adult drosophila leg(성인 초파리 다리에서 형광 표지된 운동 뉴런의 이미징)

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S.  et al. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. 특급. (2018). 이 비디오는 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여 운동 뉴런 투영과 축삭 분기를 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 형질전환 마우스 배아. 운동 뉴런 성장 및 연결성을 평가하기 위한...

광시트 형광 현미경을 사용한 운동 뉴런 투영 및 축삭 분지 시각화

출처: Jeong, S. Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 초파리 배아에서 축삭돌기의 시각화를 보여줍니다. 운동 뉴런의 면역 라벨링, 뉴런 구조를 드러내기 위한 정확한 해부, 미분 간섭 대비 현미경을 통해 축삭 돌기 패턴을 강조하는 상세한 뉴런 구조를 총체적으로 보여줍니다.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila (초파리에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴의 시각화)

우리는 유전자 조작 마우스 개발에서 감각 축삭 성장 표현형을 평가하는 효과적인 방법으로 전체 동물에서 말초 통각 수용기 축삭돌기 이미징을 위해 태아 마우스를 유전형, 염색 및 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

여기는 고정, 설치, 영상, 및 후 이미징 단계 초파리 의 성인 다리에 형광 단백질 axonal 대상으로 시각화 하는 프로토콜에 설명 합니다.

성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

배우세요 Drosophila melanogaster 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴을 면역조직화학법으로 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 신경 발달 과정에서 축삭 경로 탐색과 표적 인식을 정밀하게 분석할 수 있게 해줍니다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화

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