배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화 Drosophila

이 실험의 전반적인 목표는 Drosophila melanogaster의 말기 배아에서 운동 뉴런 투영 패턴을 분석하는 것입니다. 이 방법은 운동 축삭 유도 및 신경 subcu 형성과 같은 신경 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배아 발달 시 운동 축삭을 정밀하게 시각화하여 축삭 경로 찾기를 신뢰할 수 있게 분석하고 상태 결함을 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다.

난자 채취 플레이트를 설치한 다음 날, 플레이트를 갓 만든 효모 페이스트 약간이 들어 있는 새 플레이트로 교체합니다. 신선한 접시에서 3시간 후 파리를 새 음식병으로 옮깁니다. 그리고 계란 플레이트를 섭씨 25도에서 밤새 부화시킵니다.

아침에 플레이트에 1.8ml의 PBT 용액을 추가합니다. 그리고 면봉을 사용하여 배아를 제거합니다. 그런 다음 1ml 피펫을 사용하여 배아와 용액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

배아가 바닥에 안착하면 가능한 한 많은 용액을 흡인합니다. 그런 다음 헹굼 당 1ml의 PBT를 사용하여 배아를 두 번 헹굽니다. 배아를 장식하려면 마지막 헹굼을 50% 표백제 1ml로 교체하고 실온에서 3분 동안 튜브를 흔듭니다.

표백제를 제거하려면 PBT로 배아를 세 번 헹굽니다. 그런 다음 마지막 헹굼을 100% 헵탄가 1/2밀리리터와 4% 파라포름알데히드 1/2밀리리터로 교체합니다. 이제 부드럽게 흔들면서 15분 동안 배아를 배양합니다.

배양 후 기본 용액 층을 제거하고 500 마이크로 리터의 100 % 메탄올을 다시 첨가하십시오. 이제 30초 동안 튜브를 세게 흔들어 배아를 분리한다. 그런 다음 위에 있는 용액을 제거하고 500마이크로리터의 100% 메탄올을 다시 넣고 튜브를 10초 동안 더 흔듭니다.

튜브를 흔든 후 튜브를 두드려 배아가 안정되고 가능한 한 많은 용액을 제거할 수 있도록 합니다. 다음으로, 100% 메탄올로 배아를 간단히 헹굽니다. 그런 다음 즉시 PBT로 배아를 세 번 헹굽니다.

이제 1ml의 새로운 PBT에 배아를 재현탁시킵니다. 그리고 배아를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 LacZ 염색을 준비합니다. 배아가 배양하는 동안 X-gal 염색 용액 1ml를 준비합니다.

부분 표본이 흐려질 때까지 섭씨 65도의 수조에서 데웁니다. 그런 다음 섭씨 37도의 열 블록으로 옮깁니다. 배아를 15분 동안 데운 후 PBT 용액을 제거하고 1ml의 염색 용액 분취액으로 교체합니다.

그런 다음 20마이크로리터의 X-gal 기판을 추가합니다. 약 2-4시간 동안 섭씨 37도에서 파란색 침전물이 형성될 때까지 부드럽게 흔들면서 튜브를 배양합니다. 그런 다음 염색 용액을 제거하고 실온 PBT로 배아를 세 번 헹굽니다.

헹굼 후 바늘 프로브나 집게를 사용하여 해부 현미경으로 배아를 수동으로 분류합니다. 1ml 피펫을 사용하여 염색된 관심 배아를 1/2mm 마이크로 원심분리 튜브에 모읍니다. 다음으로, 선택한 배아를 0.4ml의 PBT로 세척합니다.

그런 다음 PBT를 0.3ml의 차단 용액으로 교체하고 배아가 15분 동안 부드럽게 교반하며 배양하도록 합니다. 15분 후, 1차 항체 75마이크로리터를 추가하고 밤새 배양을 계속합니다. 다음 날 아침, 약 2시간 동안 PBT로 배아를 세척하고 약 30분마다 세척액을 교체합니다.

세척 후 2차 항체가 함유된 차단 용액 0.3ml를 넣고 실온에서 하룻밤 동안 튜브를 부드럽게 흔들어 배양합니다. 다음 날 아침, 약 3시간 동안 PBT로 배아를 씻는다. 세탁 기간 동안 PBT를 최소 5회 교체하십시오.

세척 후 0.3ml의 소량 용액에 배아를 재현탁시키고 3% 과산화수소 2마이크로리터를 첨가합니다. 그런 다음 충분한 침전물이 생성될 때까지 실온에서 부드럽게 흔들면서 어둠 속에서 배양합니다. 일반적으로 30분에서 60분 정도 걸립니다.

그런 다음 배아를 PBT로 4회 헹구고 0.2ml의 장착 용액에 다시 현탁시킵니다. 이제 배아가 섭씨 4도의 어둠 속에서 평형을 이루도록 합니다. 배아를 필레팅하려면 유리 슬라이드에 올려 놓습니다.

먼저 글리세롤 한 방울을 복부 쪽이 위로 향하게 하여 움직입니다. 다음으로, 해부 현미경으로 앞쪽 부분과 몸 길이의 1/4을 잘라 내고 운동 축삭돌기가없는 가장 뒤쪽 영역을 제거합니다. 이제 바늘 프로브를 사용하여 글리세롤에서 제제를 등쪽이 위로 향하게 하고 시야에 수평으로 배치합니다.

다음 단계에서는 바늘 프로브의 빈 영역에 삽입한 다음 끝이 구부러진 미세한 텅스텐 바늘이 필요합니다. 텅스텐 바늘을 사용하여 배아의 뒤쪽 끝을 작게 자르고 등쪽 정중선을 계속 자릅니다. 바늘이 유리에 대해 쉽게 구부러 지므로 해부 중에 텅스텐 바늘의 끝이 유리 슬라이드의 표면에 닿지 않도록하십시오.

그런 다음 프로브를 사용하여 준비물을 글리세롤로 다시 떨어뜨리고 등쪽이 위로 향하게 놓습니다. 거기에서 각 체벽을 복부-측면 방향으로 펼쳐 체벽에서 장을 분리합니다. 두 개의 신체 벽이 분리되어야 합니다.

이제 프로브를 사용하여 본체 벽 덮개를 유리 슬라이드로 조심스럽게 이동합니다. 슬라이드에서 텅스텐 바늘을 사용하여 내부 장기를 옆으로 밀어 제거합니다. 텅스텐 바늘을 안정화하고 손상되지 않도록하려면 텅스텐 바늘을 프로빙 된 상태로 유지하고 텅스텐 바늘을 유리 슬라이드 표면에 고정시키는 동안 텅스텐 바늘을 유리 슬라이드 표면에 고정하십시오.

이제 8마이크로리터의 장착 용액에 준비물을 새 유리 슬라이드에 장착합니다. 커버 슬립을 부착하고 일반 매니큐어로 가장자리를 밀봉합니다. 그런 다음 DIC 광학 장치를 사용하여 고해상도로 이미지를 캡처합니다.

설명된 방법을 사용하여 16기 배아를 Fas2 항체로 염색하고 운동 뉴런과 복부 반분 A3 및 A4의 시각화를 준비했습니다. 일반적으로 최소 7개의 운동 뉴런이 축삭을 확장하고 매료시켜 ISNb 신경 가지를 형성합니다. 이 준비에서 주변의 많은 신경 다발도 식별할 수 있었습니다. 분절간 신경 다발이 근육 6과 7의 선택 지점에 도달하면 두 개의 축삭돌기가 선택적으로 근육 6과 7을 탈매료시키고 활력을 불어넣습니다.

다발이 등쪽으로 확장되는 것과 같은 다른 선택 지점에서도 동일한 일이 발생합니다. 그런 다음 마지막 선택 지점에서 두 개의 축삭이 근육 12에 활력을 불어넣습니다. 대조적으로, Sema-1a 돌연변이 배아에서는 동일한 축삭돌이가 선택한 지점에서 탈색에 실패합니다.

Sema-1 에게해 생성물은 신경 발달 중에 운동 축삭과 목표 근육 사이의 연결을 형성하는 데 도움이 되는 것으로 알려져 있기 때문에 이는 예상치 못한 일이 아닙니다. 따라서, 설명된 방법은 돌연변이 표현형을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 원하는 돌연변이 배아를 분류하는 방법, 운동 뉴런의 축삭 돌기 패턴을 면역 염색하는 방법, 편평한 준비를 위해 고정된 배아를 해부하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.