배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화

이 실험의 전반적인 목표는 초파리(Drosophila melanogaster) 후기 배아의 운동 신경세포 투사 패턴을 분석하는 것입니다. 이 방법은 운동 축삭 유도 및 신경 하위 회로 형성 등 신경 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 발달 중인 배아 내 운동 축삭을 정밀하게 시각화하여, 축삭 경로 탐색 및 표적 조건 결함을 신뢰성 있게 분석할 수 있다는 점입니다.

알 수집 플레이트를 설치한 하루 후, 갓 만든 효모 페이스트를 소량 도포한 새 플레이트로 교체합니다. 새 플레이트에서 3시간이 지난 후, 초파리를 새로운 먹이 병으로 옮깁니다. 그리고 알 플레이트를 25 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

오전에 플레이트에 PBT 용액 1.8 milliliters를 첨가합니다. 그리고 면봉을 사용하여 배아를 떼어냅니다. 그런 다음, 1 milliliter 피펫을 사용하여 배아와 용액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

배아가 바닥에 가라앉으면 용액을 가능한 한 많이 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 1 mL의 PBT를 사용하여 배아를 두 번 헹굽니다. 배아의 난막을 제거하려면 마지막 헹굼 단계를 1 mL의 50% bleach로 대체하고, 실온에서 튜브를 3분 동안 흔들어 줍니다.

표백제를 제거하기 위해 배아를 PBT로 3회 헹굽니다. 그런 다음, 마지막 세척액을 100% heptane 0.5 mL와 4% paraformaldehyde 0.5 mL로 교체합니다. 이제 배아를 부드럽게 흔들어주며 15분 동안 배양합니다.

배양 후, 하층액을 제거하고 100% methanol 500 µL를 다시 첨가합니다. 다음으로, 배아의 난황을 제거(devitellinize)하기 위해 30초 동안 튜브를 강하게 흔들어 줍니다. 그 후, 상층액을 제거하고 100% methanol 500 µL를 다시 첨가한 뒤 10초 동안 더 흔들어 줍니다.

튜브를 흔든 후, 배아가 가라앉도록 가볍게 두드리고 용액을 가능한 한 많이 제거합니다. 다음으로, 100% methanol로 배아를 짧게 헹굽니다. 그 후, 즉시 PBT로 배아를 세 번 헹굽니다.

이제 배아를 1 mL의 신선한 PBT에 다시 부유시킵니다. 그리고 LacZ 염색을 준비하기 위해 배아를 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 배아가 배양되는 동안 X-gal 염색액 1 mL 분량을 준비합니다.

분취액이 탁해질 때까지 65 °C 항온수조에서 가온합니다. 그런 다음 37 °C 히팅 블록으로 옮깁니다. 배아를 15분 동안 가온한 후 PBT 용액을 제거하고, 1 mL의 염색액 분취액으로 교체합니다.

그다음 X-gal 기질 20 µL를 첨가합니다. 청색 침전물이 형성될 때까지 튜브를 37 °C에서 가볍게 흔들어주며 약 2~4시간 동안 배양합니다. 그 후, 염색액을 제거하고 상온의 PBT로 배아를 3회 헹굽니다.

세척 후, 해부 현미경 하에서 니들 프로브나 핀셋을 사용하여 배아를 수동으로 분류합니다. 염색된 관심 배아들을 1 mL 피펫을 사용하여 0.5 mm 마이크로 원심 분리 튜브에 수집하십시오. 다음으로, 선택한 배아들을 0.4 mL의 PBT로 세척합니다.

그 다음, PBT를 0.3 milliliters의 블로킹 용액으로 교체하고 배아를 부드럽게 흔들어주며 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 1차 항체 75 microliters를 첨가하고 밤새 배양을 계속합니다. 다음 날 아침, 약 30분마다 세척액을 교체하며 PBT로 배아를 약 2시간 동안 세척합니다.

세척 후, 2차 항체가 포함된 블로킹 용액 0.3 milliliters를 첨가하고 튜브를 실온에서 가볍게 흔들어주며 밤새 배양합니다. 다음 날 아침, 배아를 PBT로 약 3시간 동안 세척합니다. 세척 과정 동안 PBT를 최소 5회 교체하십시오.

세척 후, 배아를 0.3 milliliters의 dab 용액에 다시 부유시키고 3% hydrogen peroxide 2 microliters를 첨가합니다. 그런 다음, 충분한 침전물이 생성될 때까지 실온에서 완만하게 흔들어주며 암소에서 배양합니다. 이 과정은 일반적으로 30분에서 60분 정도 소요됩니다.

그 후, 배아를 PBT로 4회 헹구고 0.2 milliliters의 마운팅 용액에 다시 현탁합니다. 이제 배아가 4 degrees Celsius의 암소에서 평형을 이룰 수 있도록 둡니다. 배아를 필렛팅하기 위해 유리 슬라이드 위에 배치합니다.

먼저 시료를 글리세롤 한 방울 위에 복측이 위로 향하도록 옮깁니다. 다음으로 해부 현미경 하에서 전단부와 몸길이의 1/4을 절단하고, 운동 신경삭이 없는 가장 후방 부위를 제거합니다. 이제 니들 프로브를 사용하여 준비된 시료를 글리세롤 밖으로 옮겨 배측이 위로 향하게 정렬하고 시야 내에 수평으로 배치합니다.

다음 단계에서는 니들 프로브의 중공 영역에 삽입한 후 끝부분을 구부린 미세 텅스텐 바늘이 필요합니다. 텅스텐 바늘을 사용하여 배아의 후단에 작은 절개창을 내고 등쪽 정중선을 따라 계속해서 절개합니다. 해부 과정 중에 텅스텐 바늘의 끝이 유리 슬라이드 표면에 닿지 않도록 주의하십시오. 바늘이 유리에 닿으면 쉽게 구부러질 수 있기 때문입니다.

그 다음, 프로브를 사용하여 시료를 다시 글리세롤 방울로 옮기고 등쪽이 위로 향하게 배치합니다. 그 상태에서 각 체벽을 배측-측면 방향으로 펼쳐 장을 체벽으로부터 분리합니다. 그러면 두 체벽이 서로 떨어지게 됩니다.

이제 프로브를 사용하여 체벽 플랩을 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 슬라이드 위에서 텅스텐 바늘을 사용하여 내부 장기를 측면으로 밀어 제거합니다. 텅스텐 바늘을 고정하고 손상을 방지하려면, 중공 바늘(hollow needle) 내부에 프로브를 삽입한 상태를 유지하고, 텅스텐 바늘을 조작하는 동안 바늘이 유리 슬라이드 표면에 밀착되어 지지되도록 잡으십시오.

이제 준비된 시료를 8 µL의 마운팅 용액과 함께 새로운 유리 슬라이드 위에 마운팅합니다. 커버 슬립을 덮고 가장자리를 일반 매니큐어로 밀봉합니다. 그 후, DIC 광학계를 사용하여 고해상도 이미지를 캡처합니다.

설명된 방법을 사용하여 16단계 배아를 Fas2 항체로 염색하고, 운동 신경세포와 복부 반분절 A3 및 A4의 시각화를 위해 준비했습니다. 일반적으로 최소 7개의 운동 신경세포가 축삭을 뻗어 다발을 형성함으로써 ISNb 신경 분지를 구성합니다. 본 표본에서는 주변의 많은 신경 다발 또한 식별 가능했습니다. 절간 신경 다발이 근육 6과 7의 분기점에 도달하면, 두 개의 축삭이 선택적으로 다발에서 벗어나 근육 6과 7에 분포합니다.

신경다발이 등쪽으로 뻗어 나감에 따라 다른 선택 지점에서도 동일한 현상이 발생합니다. 이후 마지막 선택 지점에서 두 개의 축삭이 근육 12를 지배하게 됩니다. 이와 대조적으로, Sema-1a 돌연변이 배아에서는 동일한 축삭들이 선택 지점에서 다발 풀림(defasciculate)에 실패합니다.

Sema-1 aegean 산물이 신경 발달 과정에서 운동 축삭과 표적 근육 사이의 연결 형성을 돕는 것으로 알려져 있으므로 이는 예상 가능한 결과입니다. 따라서 설명된 방법을 사용하여 돌연변이 표현형을 분석할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 원하는 돌연변이 배아를 분류하는 방법, 운동 뉴런의 축삭 투사 패턴을 면역 염색하는 방법, 그리고 평면 표본 제작을 위해 고정된 배아를 해부하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.