면역형광을 이용한 쥐 뇌의 시냅스전 단백질 분포 정량화(Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence)

조직 포매 배지에 포매된 화학적으로 고정된 마우스 뇌 조각을 가져 가십시오.

배지를 제거하기 위해 완충액으로 슬라이스를 세척합니다.

멤브레인을 투과화하고 비특이적 결합 부위를 차단하는 용액을 추가합니다.

용액을 제거합니다.

신경 시냅스 단백질을 시각화하려면 슬라이스를 1차 항체와 함께 배양합니다.

이 항체는 특정 뇌 영역의 시냅스에서 발현되는 시냅스 전 단백질과 참조 마커로서 유비쿼터스 발현 시냅스 단백질을 표적으로 삼습니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

1차 항체를 표적으로 하는 형광단 표지 2차 항체를 도입합니다.

결합되지 않은 2차 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

DNA 결합 염료로 핵을 대조염색합니다.

완충액으로 세척하고 적절한 마운팅 매체를 사용하여 슬라이스를 마운팅합니다.

공초점 현미경으로 슬라이스를 시각화합니다.

표적 단백질과 참조 마커의 평균 형광 강도 비율을 계산하여 다양한 뇌 영역에 걸친 표적 단백질의 분포를 분석합니다.

면역염색을 위해 슬라이스를 준비하려면 플라스틱 피펫을 사용하여 뇌 슬라이스를 끌어당기지 않고 하나의 웰에서 PB 용액을 제거합니다. 그런 다음 1,000마이크로리터 피펫을 사용하여 250마이크로리터의 신선한 PB를 추가하여 과도한 OCT를 세척합니다. 슬라이스가 건조되지 않도록 각 웰에 대해 이 세척을 반복합니다.

그런 다음 플라스틱 피펫을 사용하여 첫 번째 웰에서 PB 용액을 제거합니다. 1,000마이크로리터 피펫을 사용하여 웰당 250마이크로리터의 차단 완충액을 추가하여 다시 웰별로 잘 작동합니다. 플레이트를 셰이커에서 실온에서 3시간 동안 배양합니다. 반응 튜브에 대한 웰당 250마이크로리터의 항체 완충액에서 배양하는 동안.

그런 다음 2마이크로리터 피펫을 사용하여 적당량의 항체를 첨가하여 용액에 직접 피펫팅한 후 부드럽게 위아래로 여러 번 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 이 희석된 항체를 소용돌이치어 적절한 혼합을 보장합니다.

잘 작동하면 플라스틱 피펫으로 차단 완충액을 제거하고 웰당 250마이크로리터의 1차 항체 용액을 추가합니다. 밤새 섭씨 4도의 셰이커에서 플레이트를 배양합니다.

다음날 플라스틱 피펫으로 항체 용액을 제거합니다. 웰당 300마이크로리터의 세척 완충액 1로 슬라이스를 실온의 셰이커에서 10분씩 세 번 세척합니다. 세척하는 동안 어둠 속에서 작업하면서 이전에 1차 항체로 수행한 것과 동일한 방식으로 반응 튜브에서 형광단 결합 2차 항체를 희석합니다.

세척이 완료된 후 플라스틱 피펫으로 세척 완충액을 제거하고 웰당 250마이크로리터의 2차 항체 용액을 추가합니다. 실온에서 어두운 곳에서 90분 동안 배양합니다. 배양이 완료된 후 플라스틱 피펫으로 항체 용액을 제거합니다. 세척 완충액 1과 동일한 방법으로 세척 완충액 2로 절편을 세 번 세척합니다.

이 세척 중에 DAPI 염색을 0.1몰 PB로 희석하여 1-2000 농도를 달성합니다. 플레이트에서 세척 완충액을 제거한 후 250마이크로리터의 DAPI 용액을 넣고 셰이커에서 실온에서 5분 동안 배양합니다.

플라스틱 피펫으로 DAPI 용액을 제거한 후 1,000마이크로리터 피펫을 사용하여 웰당 500마이크로리터의 0.1몰 PB를 추가합니다. 현미경 슬라이드를 입체 스코프 아래에 놓습니다. 가는 브러시를 사용하여 슬라이드에 0.1몰 PB를 세 방울 떨어뜨립니다. 브러시를 사용하여 슬라이드에 한 방울당 한 조각씩 놓은 다음 조각을 평평하게 펴고 방향을 잡습니다.

모든 슬라이스가 올바르게 배치된 후 종이 티슈를 사용하여 과도한 PB를 제거하고 슬라이스를 완전히 건조시키지 않고 조심스럽게 건조시킵니다. 그런 다음 슬라이드에 80마이크로리터의 포매 배지를 추가하고 커버슬립으로 조심스럽게 덮어 뇌 조각을 포립합니다.

빛 노출을 피하기 위해 슬라이드를 덮고 퓨머 후드에서 1-2시간 동안 건조시킨 다음 공초점 현미경 검사가 준비될 때까지 섭씨 4도의 현미경 슬라이드 상자에 보관합니다.

원고에 설명된 대로 다른 채널에 대한 전체 뇌 슬라이스의 가상 조직을 획득한 후 파일(File)을 클릭한 다음 열기(Open)를 클릭하여 하나의 이미지에 대한 모든 단일 채널을 피지로 로드합니다. 그런 다음 자유형 선택 도구를 사용하여 DAPI 채널에서 하나의 반구를 묘사합니다. 편집을 클릭한 다음 선택을 클릭한 다음 마스크 생성을 클릭하여 선택한 영역의 마스크를 만듭니다.

그런 다음 분석(Analyze)을 클릭한 다음 입자 측정(Measure Particles)을 클릭하여 단일 채널의 평균 형광 강도를 결정하고 다른 채널을 선택하여 각 채널의 평균 형광 강도 값을 결정해야 합니다.

그런 다음 단일 채널의 평균 형광 강도를 스프레드시트에 복사합니다. 관심 영역의 단일 채널에 대한 평균 형광 강도를 결정하려면 자유형 선택 도구를 사용하여 영역을 묘사합니다.