면역형광을 이용한 쥐 뇌의 시냅스전 단백질 분포 정량화(Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence)

조직 포매 배지에 포매된 화학적으로 고정된 마우스 뇌 조각을 가져 가십시오.

배지를 제거하기 위해 완충액으로 슬라이스를 세척합니다.

멤브레인을 투과화하고 비특이적 결합 부위를 차단하는 용액을 추가합니다.

용액을 제거합니다.

신경 시냅스 단백질을 시각화하려면 슬라이스를 1차 항체와 함께 배양합니다.

이 항체는 특정 뇌 영역의 시냅스에서 발현되는 시냅스 전 단백질과 참조 마커로서 유비쿼터스 발현 시냅스 단백질을 표적으로 삼습니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

1차 항체를 표적으로 하는 형광단 표지 2차 항체를 도입합니다.

결합되지 않은 2차 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

DNA 결합 염료로 핵을 대조염색합니다.

완충액으로 세척하고 적절한 마운팅 매체를 사용하여 슬라이스를 마운팅합니다.

공초점 현미경으로 슬라이스를 시각화합니다.

표적 단백질과 참조 마커의 평균 형광 강도 비율을 계산하여 다양한 뇌 영역에 걸친 표적 단백질의 분포를 분석합니다.

면역염색을 위해 슬라이스를 준비하려면 플라스틱 피펫을 사용하여 뇌 슬라이스를 끌어당기지 않고 하나의 웰에서 PB 용액을 제거합니다. 그런 다음 1,000마이크로리터 피펫을 사용하여 250마이크로리터의 신선한 PB를 추가하여 과도한 OCT를 세척합니다. 슬라이스가 건조되지 않도록 각 웰에 대해 이 세척을 반복합니다.

그런 다음 플라스틱 피펫을 사용하여 첫 번째 웰에서 PB 용액을 제거합니다. 1,000마이크로리터 피펫을 사용하여 웰당 250마이크로리터의 차단 완충액을 추가하여 다시 웰별로 잘 작동합니다. 플레이트를 셰이커에서 실온에서 3시간 동안 배양합니다. 반응 튜브에 대한 웰당 250마이크로리터의 항체 완충액에서 배양하는 동안.

그런 다음 2마이크로리터 피펫을 사용하여 적당량의 항체를 첨가하여 용액에 직접 피펫팅한 후 부드럽게 위아래로 여러 번 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 이 희석된 항체를 소용돌이치어 적절한 혼합을 보장합니다.

잘 작동하면 플라스틱 피펫으로 차단 완충액을 제거하고 웰당 250마이크로리터의 1차 항체 용액을 추가합니다. 밤새 섭씨 4도의 셰이커에서 플레이트를 배양합니다.

다음날 플라스틱 피펫으로 항체 용액을 제거합니다. 웰당 300마이크로리터의 세척 완충액 1로 슬라이스를 실온의 셰이커에서 10분씩 세 번 세척합니다. 세척하는 동안 어둠 속에서 작업하면서 이전에 1차 항체로 수행한 것과 동일한 방식으로 반응 튜