Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

다음 실험의 전반적인 목표는 단백질에 대한 stoia 메트릭 및 구조 정보를 결정하는 것입니다. 살아있는 생물학적 세포를 발현하는 모든 인대 복합체인 효모 세포는 공여자 또는 수용체 형광 프로브에 부착된 관심 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작되었습니다. 공여체 프로브는 레이저에 의해 직접 여기될 수 있습니다.

수용체는 근처의 흥분된 기증자로부터의 에너지 전달을 통해서만 여기될 수 있지만, 세포는 펄스 근적외선 레이저의 빛에 노출됩니다. 프로브에서 수정되는 형광은 투과 격자에 의해 스펙트럼 구성 요소로 분리되고 전자 증식 CCD 어레이의 표면에 투사됩니다. 따라서 개별의 완전한 형광 스펙트럼, 모든 인대는 샘플의 각 위치에 대해 얻어집니다.

검출된 형광의 스펙트럼 프로파일은 관심 단백질의 특정 상호 작용에 따라 달라집니다. 데이터를 분석하여 스캔 셀의 각 이미지 픽셀에 대해 공여체 및 수용체 프로브의 별도 방출을 결정합니다. 에너지 전달의 효율성은 각 이미지 픽셀에서 결정된 다음 픽셀은 프렛 효율성과 히스토그램에 따라 구부러집니다.

히스토그램 해석을 통해 단백질, 복잡한 크기 및 구성을 vivo 방식으로 결정할 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 위스콘신 대학교 밀워키 캠퍼스의 리쿠 연구 그룹의 마이클 스톤맨입니다. 제 이름은 싱입니다.

저는 위스콘신주 밀워키에 있는 리쿠스 랩(Rikus Lab)에서 왔습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 내의 수백 개의 모든 인대 복합체에서 완전한 방출 프로파일을 한 번의 완전한 스캔으로 얻을 수 있다는 것입니다. 일반적으로 대부분의 형광 현미경 검사 방법은 세포 내의 다양한 관심 영역에서 프렛 효율을 결정하기 위해 충분한 스펙트럼 정보를 축적하기 위해 관심 세포를 여러 번 스캔해야 합니다.

그러나 확산 생화학 반응은 이러한 관심 영역의 분자 구성을 변화시켜 이미지 스캔에서 얻은 정보를 제한할 수 있습니다. 이 방법은 단백질, 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 연구에서 올리고머의 크기는 얼마입니까? 올리고머는 단백질 수명 주기의 어느 단계에서 파밍하며, 세포 기능에서 이 단백질의 올리고머의 역할은 무엇입니까?

스펙트럼으로 분해된 두 개의 광 현미경은 여러 위치에서 관심 샘플에 걸쳐 여기 빔의 초점을 스캔하여 이미지 셀의 올리마 복합체에 대한 스펙트럼 정보를 축적합니다. 한 쌍의 직교 스캐닝 미러는 샘플을 가로지르는 레이저 빔의 초점을 두 가지 다른 방향으로 변환하는 데 사용됩니다. 스캐닝 미러의 움직임은 컴퓨터로 제어되고 동기화되며, 라인에서 CCD 카메라의 형광 강도 데이터 추출, 형광 강도, 특정 파장의 빛에 해당하는 공간 맵을 재구성 할 수 있습니다.

X선 형광 강도 공간 맵을 정확하게 재구성하고 이러한 각 맵에 해당하는 실제 파장을 계산하려면 플루오레세인 용액을 사용하여 라인 스캐닝 프로토콜을 보정해야 합니다. 보정 절차를 시작하려면 여기 스펙트럼으로 보내기 위해 도너 태그 GFP 2 2의 최대 여기 파장의 2배인 800나노미터의 파장에서 여기 스펙트럼으로 보내고 레이저 캐비티 내에 위치한 프리즘을 번역하여 카메라가 인터페이스되는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 그룹 속도 분산을 수정합니다. CCD 칩에 명령을 보내 CCD 칩의 온도를 달성 가능한 가장 낮은 온도로 낮춥니다.

어두운 소음을 줄이기 위해. 커버 슬립이 있는 현미경 슬라이드 커버에 10마이크로리터의 플루오레세인 용액을 피펫팅하여 샘플의 얇은 층이 커버 슬립과 현미경 슬라이드 사이의 영역에 균일하게 분산되도록 하고 커버 슬립 표면에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다. 지금 현미경을 걸고, XY의 Z 번역 단계에 활주하고 광축 방향에 있는 활주 그리고 단계를 번역하십시오 선형 액추에이터를 수동으로 조정해서, 현미경 목적이 침수 기름의 하락과 접촉하게 될 때까지 활주를 번역하고, 자료 수집의 영상 형태에 사진기를 전환하십시오 그래서 CCD 배열을 치는 허용한 빛은 컴퓨터 스크린에 즉시에 표시됩니다.

CCD 어레이에서 감지되는 배경 소음을 줄이기 위해 모든 주변 실내 조명을 끕니다. 광축 방향으로 translation stage를 제어하는 마이크로미터를 천천히 조정하여 샘플을 레이저 빔의 초점으로 가져옵니다. 플루오레세인 샘플에 초점이 맞춰지면 방출이 CCD 어레이에 날카로운 선으로 나타납니다.

CCD 어레이에서 픽셀 강도의 판독값을 컴퓨터로 다운로드합니다. 이미지 J에서 다운로드한 강도 값 행렬을 열고 형광 영역을 통해 선을 그려 CCD 어레이의 위치 함수로 픽셀 강도를 측정합니다. 이미지 데이 명령을 사용합니다.

플롯 프로파일을 분석하여 플루오레세인 샘플의 방출 스펙트럼을 보여주는 플롯을 생성합니다. 레이저의 움직임을 제어하는 미러의 증분 매개변수를 조정합니다. Y 방향으로 초점을 맞추고, 샘플 내의 인접한 y 위치가 CCD 어레이의 스펙트럼 차원을 따라 정확히 1픽셀만큼 형광 스펙트럼의 피크가 이동하도록 합니다.

이를 모니터링하려면 샘플의 두 가지 다른 Y 위치에 대한 플루오레세인 스펙트럼 강도를 다운로드하십시오. 그런 다음 영상 J가 있는 강도 이미지를 열고 각 형광 스펙트럼에 대한 피크 픽셀 위치를 찾습니다. 이미지 J 커서를 사용하여 CCD의 셔터를 열어 둔 상태에서 샘플을 가로질러 X 방향으로 레이저 초점을 스캔합니다.

스캔 라인을 따라 각 복셀에서 방출되는 빛은 각 라인 스캔이 끝날 때 CCD 어레이에 입사하여 이 라인 스캔을 위해 얻은 CCD 어레이의 데이터를 저장한 다음 CCD 어레이의 픽셀을 지워야 합니다. 레이저의 위치를 이동합니다. 앞에서 결정한 양만큼 Y 방향으로 초점을 맞춥니다.

그런 다음 샘플을 가로질러 X 방향으로 레이저 빔을 스캔합니다. 다시 한 번, CCD의 셔터를 열어 둔 상태로 데이터를 저장합니다. 단일 생물학적 세포의 크기보다 약 50% 더 큰 물리적 영역이 레이저 광에 의해 비춰질 때까지 이 라인 스캐닝 절차를 반복합니다.

특정 라인 스캔 이미지의 행 번호와 파장 간의 관계는 서로 다른 파장에서 여러 전처 형광 강도 얼굴 지도를 얻기 위해 이미지를 재구성하는 데 사용해야 합니다. 특정 파장에 대한 전처 형광 제출 이미지를 얻으려면 이 파장에 해당하는 첫 번째 라인 스캔에서 얻은 이미지에서 행 번호를 찾으십시오. 그런 다음 후속 라인 스캔 이미지의 인접 행은 형광 방출 이미지의 다음 행에 해당합니다.

특정 파장의 경우 이 파장에 해당하는 모든 이미지 행을 쌓아 해당 파장에서 샘플의 XY 형광 강도 공간 맵을 얻습니다. 얻을 수 있는 다른 모든 파장에 대해 이 절차를 반복하여 샘플에 대한 데이터를 수집합니다. 먼저, 인큐베이터에서 변형된 효모 콜로니가 있는 플레이트를 제거합니다.

적어도 세 가지 유형의 형질전환된 세포가 있어야 합니다. 관심 단백질을 발현하는 세포는 두 가지 유형의 형광 프로브로 태그가 지정되었습니다. 공여자 형광 프로브로 태그된 단백질만 발현하는 세포와 수용체 형광 프로브로 태그된 단백질만 발현하는 세포.

100마이크로리터의 100밀리몰 염화칼륨을 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 그런 다음 마이크로 피펫 팁을 사용하여 공여자와 형광 프로브를 제외한 두 단백질을 발현하는 세포 플레이트에서 3-5개의 효모 콜로니를 긁어내고 100밀리몰의 염화칼륨을 접종합니다. 이 세포를 사용하여 10마이크로리터의 세포 현탁액을 제거하고 새 현미경에 분배합니다. 슬라이드.

커버 슬립으로 물방울을 덮고 커버 슬립 표면에 기름 방울을 놓습니다. 다음으로, 레이저 빔 경로의 셔터를 수동으로 닫아 레이저 광이 현미경 대물렌즈에 도달하는 것을 차단합니다. 현미경 슬라이드를 XY, Z 변환 스테이지에 고정하고 현미경 대물렌즈가 이멀젼 오일 방울과 접촉할 때까지 슬라이드 스테이지를 광축 방향으로 이동합니다.

이제 광시야 조명 조명을 켜고 카메라로 이동합니다. 데이터 수집의 비디오 모드. 샘플의 광시야 이미지는 방출 경로에 투과 격자가 있기 때문에 심하게 흐려집니다.

따라서 전체 너비가 절반인 작은 대역 통과 필터를 전송 격자 앞의 광학 경로에 배치합니다. 세포에 초점이 맞춰질 때까지 카메라 화면에서 세포의 이미지를 보면서 광축 방향으로 번역 단계를 천천히 이동합니다. 단일 셀을 레이저 빔 초점 위치로 가져오기 위해 스테이지를 X 또는 Y 방향으로 이동합니다.

광시야 광원을 끄고 방출 경로에서 대역 경로 필터를 제거합니다. CCD 어레이에서 수신된 신호를 보는 동시에 레이저 빔의 차단을 해제합니다. 레이저 빔이 셀에 입사하는 동안 CCD 어레이에서 형광 신호가 감지되면 이 셀에 대한 전체 형광 데이터 수집 스캔을 수행합니다.

동일한 스캐닝 매개변수, 특히 라인 수와 앞에서 설명한 보정 절차에서 결정된 대로 증가하는 이유를 사용하는 것이 중요합니다. donor tag와 acceptor tag 모두에 부착된 단백질을 발현하는 많은 수의 세포에 대해 cell location 및 fluorescence data acquisition process를 반복합니다. 충분한 형광을 축적한 후, 두 수용체로 태그된 단백질을 발현하는 세포의 이미지는 두 세포에 대해 전체 과정을 반복하여 공여자 형광 프로브로 태그된 단백질만 발현하고 수용체 형광 프로브로 태그된 단백질만 발현하는 세포

마지막으로, 스펙트럼 분해를 얻기 위해 모든 스캔을 재구성합니다. 이 세 그림에서 앞서 설명한 절차를 사용하여 각 데이터 세트에 대한 XY 형광 강도 공간 맵은 무균에서 알파 인자 수용체를 발현하는 효모 세포에서 수행된 스펙트럼 분해된 두 개의 광자 현미경 측정에서 계산된 결과 공간 맵입니다. 공여체 및 수용체 신호의 2차원 지도는 세포의 각 위치에서 얻은 스펙트럼 방출 프로파일을 분석하여 얻었습니다.

형광 농도는 값에 따라 거짓 색상이 할당되고 스케일은 삽입물로 표시됩니다. 그런 다음 KDA 및 KAD 이미지를 사용하여 겉보기 프렛 효율의 2차원 맵을 계산하고, 방금 표시된 셀의 겉보기 프렛 효율 맵에서 추출한 값을 사용하여 히스토그램 플롯을 준비했습니다. 셀의 측정된 EAPP 값은 원으로 표시됩니다.

빨간색 실선은 녹색 실선으로 표시되는 개별 칼슘 함수의 합을 사용하여 측정된 데이터에 가장 적합함을 나타냅니다. 프로토콜 텍스트에 설명된 히스토그램 분석은 무균 2 알파 인자 수용체 모든 인대 복합체가 생체 내에서 RBA 모양의 사량체 형태를 가정한다는 것을 확인합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 12시간 안에 수행할 수 있습니다.

이 실험을 수행하는 동안 여기 소스의 전력을 낮게 유지하는 것이 중요합니다. 단일 펄스에 의한 기증자의 다중 여기를 피하는 것이 중요합니다.