마우스 모델의 신경 활동과 연결성을 연구하기 위한 이광자 홀로그램 현미경 검사

공간 광 변조기 또는 SLM과 통합된 2광자 홀로그램 현미경 아래에 각성 있는 마우스로 시작합니다.

마우스는 사전 이식된 헤드 플레이트를 고정합니다.

마우스 뇌에서 뉴런은 칼슘 이온에 결합하는 적색광에 민감한 채널과 녹색 형광 칼슘 지표를 발현합니다.

신경 활동 및 연결성을 연구하려면 이미징 매개변수를 설정합니다.

920나노미터 레이저를 사용하여 뉴런 내의 칼슘 결합 지표를 흥분시킵니다. 최소한의 광손상으로 뉴런의 형광 이미지를 캡처합니다.

이미징 매개변수를 재설정하고 근적외선 레이저 빔에 초점을 맞춥니다.

SLM은 레이저 빔을 여러 지점에서 표적 뉴런에 선택적으로 초점을 맞출 수 있는 정밀한 홀로그램 패턴으로 성형합니다.

이는 빛에 민감한 채널을 자극하고 칼슘 이온 유입을 유발하며 표적 뉴런의 형광을 향상시킵니다.

활성화된 표적 뉴런은 연결된 뉴런에 신호를 전달하고 연결된 뉴런의 형광을 증가시킵니다.

다시 2광자 이미지를 캡처합니다. 표적 및 연결된 뉴런의 형광 증가는 신경 활동과 연결성을 확인합니다.

마우스를 현미경 아래에 놓고 2광자 이미징을 수행한 후 상용 이미징 소프트웨어를 엽니다. 라이브 이미징 모드에서 이미지 검출기의 전압과 이미징 레이저의 출력을 조정하여 GCaMP6m-P2A-ChRmine을 발현하는 뉴런의 밝기를 최적화합니다. 이러한 단백질을 발현하는 뉴런의 이미지를 캡처한 다음 앞서 설명한 절차에 따라 특정 뉴런을 비춥니다.

레이어 2 및 3 뉴런 내의 기능적 연결성을 조사하려면 공간 광 변조기를 사용하여 광유전학적 자극의 홀로그램 패턴을 생성합니다. 그리고 이를 2광자 칼슘 이미징과 결합하십시오. 이미징 레이저의 강도를 10-20밀리와트에서 920나노미터로 설정하고 시야를 256마이크로미터 x 256마이크로미터로 설정합니다. 피질 표면에서 100-150마이크로미터 깊이에서 측정됩니다.

픽셀 체류 시간을 2헤르츠의 경우 1.5마이크로초, 30헤르츠의 경우 100나노초로 설정합니다. 2헤르츠와 30헤르츠를 모두 이미징 프레임 속도로 사용하여 단일 홀로그램 자극이 뉴런에서 칼슘 반응을 유발하는지 확인합니다. 단일 뉴런을 자극하는 홀로그램 자극 레이저의 강도를 신경 활동을 유도하기에 충분한 10밀리와트로 설정합니다.

동시에, 10초의 기준선 기간 이후 50밀리초 동안 1,040나노미터와 8초 간격에서 10개의 홀로그램 자극을 사용하여 920나노미터에서 칼슘 이온 반응을 이미지