에탄올 고정 및 DAPI 염색: 예쁜꼬마선충에서 DNA를 시각화하는 방법

0 views • 3:32 min • April 30th, 2023

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- 현미경 슬라이드에 완충 용액을 한 방울 떨어뜨리는 것으로 시작하여 손상되지 않은 벌레를 방울로 옮깁니다. 벌레가 제자리에 놓이면 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 완충액을 흡수하고 제거합니다. 90% 에탄올로 표본을 여러 번 목욕시켜 시료를 고정하고 각 적용 후에 증발하도록 합니다.

최종 헹굼 후 에탄올이 증발하면 핵산 염료인 DAPI가 포함된 용액을 샘플에 추가합니다. DAPI는 DNA의 작은 홈에 있는 아데닌 및 티민 염기에 우선적으로 결합합니다. 결합하면 DAPI-DNA 복합체는 자외선을 흡수하고 가시광선 청색광을 방출합니다.

다음으로, 변색 방지 방부제를 첨가하여 샘플의 유통 기한을 연장합니다. 커버 슬립을 적용하고 슬라이드에 밀봉합니다. 그런 다음 파란색 필터가 있는 형광 현미경을 사용하여 세포 및 주기 상태에 따라 단일 염색체, 자매 염색체 쌍 또는 전체 핵을 나타낼 수 있는 DAPI 본체를 시각화합니다. 이 실험에서는 난모세포에서 DAPI 염색된 자매 염색체 쌍을 계산하여 Caenorhabditis elegans의 사배체 균주를 식별합니다.

- 사배체 균주에는 12개의 염색체 쌍이 있으며, 이는 수정되지 않은 난모세포에서 DAPI 염색체를 계수하여 검증할 수 있습니다. 이렇게 하려면 5-10마이크로리터의 M9 버퍼를 슬라이드에 떨어뜨리고 6-10개의 추정 사배체를 드롭으로 옮깁니다. 해부 현미경으로 대부분의 M9를 보푸라기가 없는 세척 티슈에 조심스럽게 흡수합니다.

그런 다음 10마이크로리터의 90% 에탄올을 웜에 떨어뜨리고 에탄올이 완전히 증발하는 것을 지켜보십시오. 증발이 끝나자마자 에탄올을 첨가하는 과정을 반복하고 증발하는 것을 관찰하십시오. 총 4가지 응용 분야에서 10마이크로리터를 추가합니다. 마지막 한 방울이 증발한 후 마이크로리터당 2나노그램 또는 유사한 염색으로 6마이크로리터의 DAPI를 첨가합니다.

슬라이드를 장기간 보관하려면 시중에서 판매되는 또는 수제 페이드 방지 장치에 웜을 장착하십시오. 그런 다음 커버슬립을 추가하고 매니큐어로 가장자리를 밀봉합니다. 매니큐어가 건조된 후 슬라이드를 득점할 수 있습니다. 형광 현미경을 사용하여 100배 배율을 조절합니다.

먼저, 정자(spermatheca)에 바로 인접해 있고 아직 정자나 자궁에 들어가지 않은 가장 성숙한 수정되지 않은 난모세포를 찾습니다. 여기서 DAPI 몸체는 아마도 단일 염색체 쌍일 것입니다. 다음으로, 난모세포의 핵에 초점을 맞추고 현미경의 미세한 초점을 사용하여 DAPI 본체를 세면서 위에서 아래로 천천히 스캔합니다. 그런 다음 초점을 아래에서 위로 이동하여 동일한 핵에 있는 DAPI 본체를 자세히 계산합니다.

야생형 난모세포는 평균적으로 6개의 DAPI 바디를 가지고 있습니다. 12 개의 DAPI 시체가 존재한다는 것은이 균주의 동물이 부분 또는 완전한 사배체임을 나타냅니다. 균주당 최소 10마리의 동물을 분석합니다. 종종 염색체 쌍은 매우 가깝거나 접촉하기 때문에 DAPI 본체의 수는 종종 실제 염색체 쌍의 수보다 작습니다.

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Last updated: 4 July 2026