의 양적 비교 CIS - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster

이 절차의 전반적인 목표는 초파리 멜란 위장 변성 발달 중 활성화된 CIS 조절 요소 또는 CRE의 유전자 조절 활성을 정량적으로 측정하는 것입니다. 부위 특이적 통합 방법부터 시작하여 reporter transgenes로 Transgenically Incorporated된 CRE 라인을 생성합니다. 실체 현미경을 사용하여 올바른 발달 단계의 형질전환 표본을 얻습니다.

외부 펍에서 표본을 제거하고 유리 현미경에 장착합니다. 슬라이드: 컨포칼 현미경 분석을 통해 전체 마운트 샘플에서 형광 리포터 단백질 발현의 수준과 패턴을 기록합니다. 마지막으로, Image J 소프트웨어 도구를 사용하여 기록된 컨포칼 이미지에 대한 형광 리포터 단백질 발현 수준을 정량화합니다.

이러한 결과는 유전자 조절 활성의 수준을 할당하여 조절 요소를 지원하고 변형된 CRE 버전에 대한 추가 비교 유전자 발현 연구를 촉진합니다. 이 절차는 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 유전자 조절 및 유전자 조절이 인코딩되는 방식에 관심을 가질 수 있습니다. DNA는 발달 생물학과 진화 생물학처럼 느껴집니다.

이 절차는 초파리 멜라노가스터 변성 발달 중에 기능하는 시스 조절 요소에 대한 통찰력을 제공하기 위해 개발되었습니다. 그러나 원칙적으로는 다른 발달 단계 및 다른 초파리 종 또는 다른 모델 유기체에서 기능하는 시스 조절 요소에 적용될 수 있습니다. 형질전환 라인을 확장하기 위해 교대로 여러 마리의 수파리와 암컷 파리가 있는 두 개의 바이알을 설정합니다.

바이알 중 하나에서 파리를 새 바이알로 옮깁니다. 일주일 동안 이것을 반복하십시오. 2주가 끝날 때까지 형질전환 초파리가 유충에서 성체 발달 단계에 이르기까지 다양한지 확인합니다.

ER이 형성되는 세 번째 instar 유충 단계가 끝날 때 표본 스테이징을 시작합니다. 표본은 움직일 수 없습니다. ER은 흰색으로 연화되고 구형은 이 시점을 지정하는 것을 피했습니다.

제로 HAPF로. 수컷과 암컷을 구별하는 것은 변태의 길이에 따라 발기를 위해 반투명 원으로 나타나는 신체의 중간 지점 근처에 양측으로 위치한 생식선의 존재에 의해 구별됩니다. HAPF가 0인 상태에서 물에 적신 붓을 사용하여 표본을 새 바이알로 옮깁니다.

Kim wipe 한 조각을 넣고 물을 적셔 표본이 마르지 않도록 합니다. 이제 원하는 HAPF가 될 때까지 섭씨 25도에서 바이알을 배양합니다. 또는 첨부된 텍스트에 자세히 설명된 대로 여러 형태학적 마커의 존재 및 위치 식별을 기반으로 분류하여 표본을 스테이징합니다.

실험실 테이프를 사용하여 접착 테이프 표면이 위쪽을 향하도록 해부 보드에 포장 테이프 조각을 부착합니다. 페인트 브러시를 적시고 페인트 브러시를 사용하여 표본에 수분을 바르십시오. 표본을 Kim 물티슈로 옮깁니다.

표본을 패킹 테이프에 옮기고 등쪽 표면이 위를 향하도록 부착합니다. 표본을 15분 동안 건조시킵니다. 집게를 사용하여 응급실을 점진적으로 엽니다.

전방 또는 파마에서 시작하여 후방 끝으로 진행합니다. 그런 다음 pui를 현미경 슬라이드의 점성 오일 한 방울로 옮기고 전체 마운트 표본에 대해 표본을 현미경으로 평가합니다. Forex 또는 10 x 대물렌즈를 사용하여 표본에 초점을 맞춥니다.

컨포칼 현미경 소프트웨어를 사용하여 원하는 형광 단백질의 여기 파장을 조정하여 광백화를 방지합니다. 5에서 10%의 레이저 강도로 시작하십시오.신호가 압도적이면 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 필요에 따라 강도를 높입니다. 컨포칼 이미지의 경우, CRE 활성의 정량적 비교를 위한 kalman 평균화와 같은 복제 스캔의 평균 픽셀 측정이 형광이 가장 강하게 나타나는 제왕절개를 사용하는 소프트웨어 설정을 활성화합니다.

채도 경고 룩업 테이블로 전환하고 채널 전압 게인 및 오프셋을 포화 픽셀이 적은 설정으로 조정합니다. 필요한 경우 컨포칼 조리개를 조정합니다. 최적의 설정이 결정되면 ZS 스캔을 실행하여 Z축을 따라 일련의 이미지를 얻습니다.

스캔이 완료되면 이미지 스택을 프로젝션으로 변환하고 이 이미지 파일을 TIF 형식으로 저장합니다. CRE 활성의 정량적 비교를 위해 모든 복제 검체 및 리포터 전이유전자 라인에 대해 동일한 컨포칼 설정을 사용합니다. Image J 프로그램이 시작된 실험의 경우 평가할 TIFF 이미지를 엽니다.

freehand selection 버튼을 클릭하고 정량 분석이 필요한 시료 영역을 간략하게 표시합니다. 픽셀 값 통계를 얻으려면 Analyze(분석) 탭을 클릭한 다음 measure(측정)를 선택합니다. 결과 상자에서 평균 픽셀 값 점수를 기록합니다.

또한 CRE가 활성화되지 않은 배경 영역으로부터 두 번째 평균 픽셀 값을 수집한다. 조정된 평균 픽셀 값을 도출하려면 반복 표본에 대한 픽셀 값 통계량을 계속 생성합니다. 그런 다음 복제본 조정된 평균 픽셀 값에서 A CRE에 대한 평균 조절 활성을 결정하고 평균의 표준 오차도 계산합니다.

이 실험은 백색 구조 눈 표현형의 강도를 사용하여 형질전환 라인을 동형접합체로 만듭니다. A TTP 랜딩 사이트 염기서열을 가진 백색 유전자 돌연변이 유전자 배경은 부위 특이적 전이유전자 통합에 사용됩니다. 통합 벡터에 대한 형질전환 개체, 반접합 및 동형접합성은 통합된 미니 백색 유전자의 사본 수에 의해 구출된 눈 색깔 표현형의 강도에 의해 구별됩니다.

그런 다음 동형접합 선은 가장 어두운 눈 색깔 표현형을 가진 수컷과 암컷 파리를 교차시켜 설정됩니다. 형태학적 마커는 유충에서 성인 초파리로 변태하는 동안 초파리의 변성 단계를 결정하는 데 사용됩니다. 표본은 성별을 결정하고 발달 단계를 근사화하는 데 사용할 수 있는 일련의 정형화된 형태를 통해 전환됩니다. 여기.

이형성 요소(dimorphic element)라고 하는 CRE의 야생형 버전은 암컷 puy의 ASIC 복부 분절에서 높은 수준의 EGFP 리포터 발현을 유도합니다. 이 CRE 내의 13 염기쌍 서열은 DSX 전사 인자에 대한 결합 부위인 것으로 밝혀졌으며 이 서열의 생체 내 중요성은 이 결합 부위가 돌연변이될 때 CRE에 대한 조절 활성을 정량화함으로써 입증되었습니다. 정량적 분석은 이 DSX 부위의 돌연변이가 여기에 사용된 전이유전자 삽입 부위의 맥락에서 조절 활성을 야생형 발현의 28 플러스 마이너스 3%로 감소시켰음을 나타냅니다.

유사한 비교는 예를 들어, 암컷 세그먼트의 EGFP 수준과 비교하여 특정 내 CRE 대립유전자 또는 개별 종의 자가 CRE 간의 조절 활동을 평가합니다. D Melin, 위, 캐닌 S 균주에 의해 구동되는 6 종에 대한 자가 CREs D 각성제 및 D willi는 각각 75 플러스 또는 마이너스 4 % 및 0 플러스 또는 마이너스 0 %와 같은 조절 활성을 가지고 있습니다. RNA 간섭과 같은 다음 절차 방법을 전사 인자 유전자와 함께 사용하여 이러한 전사 인자 유전자가 CYS 조절 요소와 어떻게 상호 작용하는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이는 개발 후 CIS 조절 요소에 의해 주도되는 형광 리포터 단백질 발현의 증가 및 감소에 의해 표시됩니다. 이 절차는 유전자 조절 분야의 연구자들이 시스 조절 요소 모티프와 진화된 돌연변이가 유전자 발현에 미치는 기능적 중요성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.