Name: 의 양적 비교 CIS - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster에서 cis-regulatory element 활성을 정량 분석하는 방법입니다. 형광 리포터 단백질 발현을 공초점 현미경으로 측정하고 ImageJ로 정량화하여 유전자 조절 메커니즘을 연구합니다.

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우리는 감사 : 니콜라 Gompel이 프로토콜의 발전에 그들의 공헌에 대해 벤자민 Prud&#39;homme, 멜리사 윌리엄스와 원고에 대한 덧글에 대한 네 익명으로 검토, 전쟁 연구 장학금을위한 데이튼 대학원 대학, 그리고 데이턴 생물의 대학 부서 및 TMW에 대한 연구 지원을위한 연구소 (UDRI). 이 작품은 TMW로 미국 심장 협회 부여 11BGIA7280000에 의해 지원되었다.

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우리는 공개 아무것도 없어.

CIS - 규제 요소는 유전자 발현 패턴 및함으로써 개발 1의 프로세스를 지정 게놈 프로그램을 인코딩하고, 인간의 특징 5,6,19에 대한 형태학의 진화 2-4과 phenotypic 변화를 기본 두 변이에 대한 눈에 띄는 위치하고 있습니다. 이 중요성에도 불구하고, CREs에 대한 규제 논리가 제대로 이해 남아있다. 이 이해 적자에 대한 유명한 이유는 양적 CREs의 기능 시퀀스를 비교하는 적절한 방법의 부족했습니다. 여기 D. melanogaster이 CREs의 연구에 양적 측면을 추가할 수 있도록 개선 transgenesis 방법에 capitalizes 프로토콜을 제시한다. 복제가 (1) 동일한 발달 단계 및 (2) 기자의 transgene이 때 우리의 경험에서 CRE의 규제 활동을 quantifying 때, 복제 표본 사이의 편차는 조정 의미 픽셀 값의 10 % 이하입니다동일한 게...

의 양적 비교 cis</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (cre) 활동 drosophila melanogaster</em

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

유전자 발현 패턴도 강화 또는 CIS - 규제 모듈이라고 CIS - 규제 요소 (CRE) 시퀀스에 의해 지정됩니다. 전형적인 CRE 어디에, 어떤 수준에서 규제 유전자 (S)가 표시됩니다 때, 지정 규제 논리를 부여하는 몇 가지 전사 인자 단백질에 대한 구속력이 사이트의 배열을 가지고 있습니다. 동물의 게놈 내에서 CREs의 전체 집합은 유기체의 발전 1, 경험적위한 프로그램뿐만 아니라 이론 연구 CREs에 변이가 형태학의 진화 2-4 두드러진 역할을 나타냅니다를 인코딩합니다. 또한, 인간 게놈 넓은 협회 연구 CREs에 유전자 변이가 phenotypic 변화에 크게 기여 5,6 나타냅니다. 따라서, 규제 논리를 이해하고 방법을 돌연변이 같은 논리에 영향을 미칠 것은 유전학의 중심 목표이다. 기자 transgenes은 생체내 FUNC에서 공부하는 강력한 방법을 제공CREs의 기. 여기 알려진 또는 의심되는 CRE 시퀀스는 heterologous 발기인하고 쉽게 관찰할 단백질 제품을 인코딩 리포터 유전자에 대한 코딩 시퀀스로 결합합니다. 기자의 transgene이 숙주에 삽입되면, CRE의 활동은 인코딩된 기자 단백질의 형태로 표시됩니다. transgenes의 게놈 배치가 랜덤입니다하지만 과일 파리 종의 Drosophila (D.) melanogaster 7 P - 요소 중재의 transgenesis,이 모델 생물로 기자 transgenes을 소개하는 수십 년 동안 사용되었습니다. 따라서 리포터 유전자 활동은 강력하고 질적으로 CRE 비교 제한, 지역 염색질 및 유전자 환경에 의해 영향을받습니다. 최근에는 phiC31 기반의 통합 시스템은 특정 게놈의 방문 사이트 8-10에 transgenes를 삽입 D. melanogaster에서 사용하기 위해 적응되었다. 이 기능은 CRE 활동 11-13 FE에게 유전자의 양적 측정을 시도했고, 관련 여기에있다asible. 유전자 변형 과일 파리의 생산이 고가의 장비와 /를 구입하거나 전문 transgene 분사 프로토콜에서 실력을하지 않아도 phiC31 기반의 통합을 포함하여 외주 수 있습니다. 여기서는 일반적인 프로토콜 양적 CRE의 활동을 평가하고,이 접근법은 CRE의 활동에 도입 돌연변이의 효과를 측정하고 orthologous CREs의 활동을 비교하는 데 사용할 수있는 방법을 보여주기를 제시한다. 주어진 예제는 과일 파리 변태 동안 CRE 활성화를위한 있지만, 그 접근 방식은 다른 발달 단계, 과일 파리 종, 또는 모델 생물에 적용할 수 있습니다. 결국, 학습 CREs이 접근 방식보다 널리 사용 규제 논리의 이해를 사전에해야하고 어떻게 논리는 다양하고 진화하실 수 있습니다.

특성에 대한 Phenotypic 변형 CIS - 규제 요소 (CRE) 시퀀스 제어하는​​ 유전자 발현 패턴의 변이에서 발생할 수 있습니다. Drosophila melanogaster에 사용하기 위해 파생된 방법은 양적 수정하거나 자연 발생 CRE 변종으로 인한 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴의 수준을 비교할 수 있습니다.

의 양적 비교 CIS</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster</em

유전자 발현 패턴은 인핸서(enhancer) 또는 시스 조절 모듈(cis-regulatory module)이라고도 불리는 시스 조절 요소(cis-regulatory element, CRE) 서열에 의해 규정됩니다. 전형적인 CRE는...

이 절차의 전체적인 목표는 drosophila melanogaster의 변태 발달 과정 중 활성화되는 CIS 조절 요소 또는 CRE의 유전자 조절 활성을 정량적으로 측정하는 것입니다. 먼저 부위 특이적 통합법을 사용하여 리포터 트랜스진으로 CRE가 형질전환 통합된 라인을 생성합니다. 실체 현미경을 사용하여 적절한 발달 단계의 형질전환 표본을 확보하십시오.외부 튜브에서 표본을 꺼내 유리 현미경 슬라이드에 고정합니다. 공초점 현미경 분석을 통해 전체 마운트 샘플에서 형광 리포터 단백질 발현의 수준과 패턴을 기록합니다. 마지막으로, Image J 소프트웨어 도구를 사용하여 기록된 공초점 이미지의 형광 리포터 단백질 발현 수준을 정량화합니다.이러한 결과는 유전자 조절 활성 수준을 할당하여 조절 요소를 보조하고, 수정된 CRE 버전에 대한 추가적인 비교 유전자 발현 연구를 용이하게 합니다. 이 절차는 유전자 조절 및 해당 유전자 조절의 인코딩 방식에 관심이 있는 분들에게 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. DNA는 발생 및 진화 생물학의 기초가 됩니다.본 절차는 초파리(drosophila melanogaster)의 변태 발달 과정 중 작동하는 cis 조절 요소에 대한 통찰을 제공하기 위해 개발되었습니다. 원칙적으로, 이 방법은 다른 발달 단계나 다른 초파리 종, 또는 다른 모델 생물에서 작동하는 cis 조절 요소에도 적용할 수 있습니다. 형질전환 계통을 확장하려면, 격일로 수컷과 암컷 초파리를 여러 마리씩 넣어 두 개의 바이알을 준비하십시오.파리를 기존 바이알 중 하나에서 새 바이알로 옮깁니다. 이 과정을 일주일 동안 반복합니다. 2주가 지났을 때, 형질전환 초파리가 유충부터 성체까지의 발달 단계에 걸쳐 있는지 확인합니다.ER이 형성되는 3령 유충 단계의 끝에서 표본의 단계별 관찰을 시작하십시오. 표본이 움직이지 않는 상태임을 확인하십시오. ER이 부드러운 흰색을 띠고 구형 구조가 외반된 시점을 이 단계로 지정하십시오.0 HAPF 단계에서, 체중앙 부근에 양측으로 위치한 생식샘의 존재 여부로 수컷과 암컷을 구분합니다. 생식샘은 투명한 원형으로 보이며, 이를 통해 변태 길이에 따른 단계 설정을 수행합니다. 0 HAPF에, 젖은 붓을 사용하여 표본을 새 바이알로 옮깁니다.Kimwipe 조각을 넣고 물로 적셔 표본이 건조되는 것을 방지합니다. 이제 원하는 HAPF가 될 때까지 바이알을 25 °C에서 배양합니다

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Research

연구

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Biology

생물학

이 프로토콜은 explant의 electroporation을 통해 마우스 망막 생활 CIS - 규제 요소의 활동 (즉, 확장기 / 발기인)를 수치 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. DNA의 준비, 망막 절개, electroporation, 망막 explant의 문화, 포스트 고정 분석과 부량이 설명되어 있습니다.

의 활동을 Quantifying CIS</emExplant Electroporation하여 마우스 망막에서> - 규제 요소

Drosophila melanogaster는 선천성 면역 체계와 감염 및 질병의 생리학적 결과를 연구하기 위한 뛰어난 모델 유기체입니다. 이 프로토콜은 강력하고 정량적으로 반복 가능한 박테리아 감염을 D. melanogaster에 전달하는 방법과 이후에 감염 중증도를 측정하고 숙주 면역 반응을 정량화하는 방법을 설명합니다.

전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에<em&gt; 초파리 melanogaster의</em

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그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Chromatin 환경 규칙은 적절 한 유전자 발현에 필요한 필수적인 과정 이다. 우리가 chromatin 수정의 채용을 통해 유전자 발현을 제어 하기 위한 메서드를 설명 하는 여기, 유전자 및 가역 방식 기계.

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