의 활동을 Quantifying CIS - 규제 요소

이 프로토콜은 explant의 electroporation을 통해 마우스 망막 생활 CIS - 규제 요소의 활동 (즉, 확장기 / 발기인)를 수치 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. DNA의 준비, 망막 절개, electroporation, 망막 explant의 문화, 포스트 고정 분석과 부량이 설명되어 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 형광 전사 리포터를 사용하여 마우스 망막 임플란트를 전기 정화하고 발현 수준을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 해부를 통해 신생아 마우스의 망막 조직을 분리함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 형광 DNA 리포터 구조체로 망막을 전기로 연결하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 전기천공된 망막을 8일 동안 임플란트로 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 망막 추출물을 채취하여 형광 리포터의 발현 수준을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, x explan electroporation을 통해 발달 중인 마우스 망막에서 서로 다른 프로모터 리포터 구조체의 상대적 발현 수준을 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이어서 정량적 데이터 분석이 수행됩니다.

제 이름은 조 코보(Joe Corbo)이고, 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학교 의과대학의 병리학 및 면역학과 교수입니다. 그리고 오늘 우리는 광수용체 특이적 CYS 조절 요소의 활성을 정량화하기 위해 신생아 쥐 망막에 X 엑스플랜 전기천공법을 시연하는 비디오 프로토콜을 발표할 예정이며, 이 프로토콜을 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생인 Cindy Montana가 될 것입니다. 먼저 electroporation 챔버와 모든 기구를 70% 에탄올로 멸균하여 안구 채취를 준비합니다.

장갑과 탁상용을 모두 에탄올로 소독하고 시술 내내 멸균 상태를 유지하십시오. 다음으로, 조직 배양 후드에서 6ml의 해부 배지를 하나의 멸균 60mm 페트리 접시에 넣고 3ml의 배지를 2개의 멸균 35mm 접시에 피펫으로 넣습니다. 벤치 탑으로 돌아가서 갓 태어난 새끼 쥐의 머리와 목을 70 % 에탄올로 소독하십시오.

가위를 사용하여 머리를 빠르게 참수한 후 머리를 멸균 100mm 접시에 옮기고 작은 가위로 두피를 잘라내어 해부 현미경으로 눈을 노출시킵니다. 구부러진 집게를 사용하여 안와에서 눈을 부드럽게 퍼낸 다음 해부가 포함된 35mm 접시에 눈을 놓습니다. 보통. 전기천공할 DNA 분취액당 3-4개의 눈이 있도록 눈을 계속 수집하고, 완료될 때까지 눈과 해부 매체를 실온에서 유지합니다.

면도날과 70% 에탄올이 함유된 멸균 플라스틱 전사 피펫의 포장지를 모두 소독한 다음 면도날을 사용하여 눈 전체를 피펫으로 만들 수 있도록 피펫 끝을 충분히 높게 자릅니다. 넓어진 피펫을 사용하여 고배율의 해부 현미경으로 35mm 접시에서 60mm 접시로 한쪽 눈을 옮깁니다. 가는 집게를 사용하여 눈 표면에서 안구 외 근육 및 지방과 같은 조직을 제거합니다.

그런 다음 시신경의 기저부를 꼬집어 제거합니다. 망막을 분리하기 위해 공막의 가장자리에 작은 구멍을 뚫으면 공막과 망막 색소 상피가 망막 조직인 Matt Gray에 비해 광택이 나는 것처럼 보입니다. 두 쌍의 집게에서 한 갈래를 구멍에 삽입하고 공막과 RPE를 부드럽게 뜯습니다.

렌즈는 제자리에 두십시오. 넓어진 피펫을 사용하여 절개된 망막을 배지가 들어 있는 두 번째 35mm 접시로 이동합니다. 모든 망막을 수집하여 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에 보관합니다.

각 DNA Eloqua가 전기천공될 수 있도록 조직 배양 후드에서 전기천공이 작동할 때까지 멸균 35mm 접시 하나를 해부 배지로 채우고 두 번째 접시를 배양 배지로 채웁니다. P 200 피펫을 사용하여 멸균 XPB S3 1회를 사용하여 전기천공레이션 접시의 챔버를 세척합니다. 챔버를 60마이크로리터 DNA 부분 표본으로 채우고 사용하지 않은 챔버는 60마이크로리터의 XPBS로 채웁니다.

전극을 electroporation 접시에 연결하고 전기에 적절한 설정을 입력합니다. 가는 집게를 사용하여 수정체로 망막을 잡고 전기천공실로 옮깁니다. 각 챔버에 최대 4개의 망막을 배치합니다.

수정체가 양극에 부착된 금속 막대에 기대도록 망막을 배열합니다. DNA가 한 챔버에서 다음 챔버로 옮겨가는 것을 방지하기 위해 각 챔버 사이의 겸자를 닦습니다. 모든 망막이 정렬되면 전기에서 시작을 누릅니다.

음극에 부착된 금속 막대에 작은 기포가 형성되어야 합니다. 전극을 분리하고 집게를 사용하여 전기를 끕니다. 망막을 챔버 벽에서 부드럽게 멀리 옮깁니다.

방에서 망막을 해부 배지가 들어 있는 35mm 접시로 옮깁니다. 멸균 이송 피펫을 사용하여 박리 배지에서 배양 배지가 들어 있는 35mm 접시로 망막을 옮깁니다. 멸균 6웰 배양 플레이트의 웰에 라벨을 붙이고 각 웰을 3밀리리터의 배양물로 채웁니다. 보통.

멸균 집게를 사용하여 필터의 반짝이는 면이 위쪽을 향하도록 하여 각 웰의 매체 위에 있는 watman nucleo 필터를 둥글게 띄웁니다. 해부 내시경을 사용하여 멸균 전사 피펫 렌즈 면이 아래로 향하게 하여 단일 망막을 필터로 옮깁니다. 망막이 렌즈 면이 위로 향하게 떨어지면 렌즈를 다시 피펫에 밀어 넣고 다시 시도하십시오.

각 웰에 4개 이하의 망막을 배치하고 별도의 물방울에 보관하십시오. 망막이 웰에 배치되면 배양 플레이트를 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터로 옮기고 원하는 시간 동안 성장합니다. 보통 8일 동안 볼 수 있으며, 성공적인 전기천공법은 망막 표면의 1/4에서 1/3에 걸쳐 DNA 구조체의 발현을 초래합니다.

형광 수준은 CRE 구조체를 발현하는 균일하게 전기천공된 영역을 망막 외부 영역과 비교한 다음 GFP 발현을 제어하기 위해 정규화하여 정량화합니다. 특히 간상 광수용체(rod photoreceptor)는 효율적으로 형질전환되어 보여지고 있습니다. 다음은 두 개의 막대 특이적 프로모터가 외부 핵층에서 GFP와 DS red의 발현을 유도하는 electroporation의 결과입니다.

여기에 파란색으로 표시된 DPI 염색으로 두 가지 발현 패턴을 오버레이하면 광 수용체 특이적 발현이 분명합니다. interclear layer 또는 ganglion cell layer에서 발현이 관찰되지 않습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 망막 낭종 조절 요소의 활성을 정량화하기 위해 마우스 망막 외식의 전기 및 배양을 어떻게 해부하는지 잘 알 수 있어야 합니다.

지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.