Name: 의 활동을 Quantifying CIS - 규제 요소 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 학습하세요 마우스 망막에서 explant electroporation을 이용한 cis-조절 요소 활성 정량화 방법을. 형광 리포터를 사용하여 망막 세포의 유전자 발현을 시각화하고 분석하는 이 기술은 신경과학 및 유전학 연구에 필수적입니다.

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저자 electroporation 챔버의 섹션에 대해 설명 건설과 그녀의 도움 카렌 로렌스 감사하고 싶습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Explant의 electroporation은 개발 마우스 망막에서 CIS - 규제 활동을 quantifying의 간단한 수단입니다. 마우스 transgenesis 통해 CIS - 규제 분석에 비해, electroporation은 신생아 마우스 새끼, DNA, 해부 악기, 그리고 electroporation / 조직 문화 장비를 필요로하는 많은 저렴합니다. 그것은 훨씬 적은 시간 또한 많이 소요 : 한 실험 영상 및 데이터 분석을위한 실험의 끝에 유일한 준비 시간이 몇 시간에 대한 팔일의 문화 시대, 그리고 몇 시간이 필요합니다. 실제 망막 조직이 활용되기 때문에 Explant의 electroporation은 또한 세포 문화 기반 CIS - 규제 분석 우수합니다. 망막은 explant에서 매우 일반적으로 개발 문화는 photoreceptors은 외부 세그먼트를 정교하지 있지만, 세 개의 서로 다른 세포 레이어를 (외부 핵 계층 내부 핵 층과 신경절 세포 층) 양식. 추가 장점은 explant의 electroporation 높은 재현성입니다. 심지어 다른 일에 다른 망막에 electroporated 동일한 구조, 동일한 상대 표현 수준에서 일반적으로 발생합니다. 또한, electroporated plasmids이 핵에 episomally 유지 생각하고 염색체에 포함되지 않습니다 때문에, 그들은 유전자 변형 생쥐에서 수행 CIS - 규제 분석을 현혹하는 동일한 통합 사이트 효과를 적용하지 않습니다. Explant의 electroporation 몇 가지 제한이 없습니다. 첫째, 세포주기에 여전히에만 세포가 효율적으로 electroporation 15 일까지 transduced 수 있습니다. P0에서 막대 및 기타 나중에 태어난 망막 세포 유형 (바이폴라 세포, amacrine 세포, M ller의 glia)이 방법에 의해 대상의 주요 세포 집단입니다. P0 electroporation에 의해 원뿔 photoreceptors의 Electroporation은 16을보고하지만 효율이 낮은 것으로 나타납니다되었습니다. 두 번째 제한은 망막의 진보보기 흉한 것 2 주 결과 너머 그 explant 문화이므로 권장하지 않습니다. 제 9에서 설명한대로 발기인의 부량 늦게 timepoints에 필요한 경우 단, 생체내의 electroporation 9가 원하는 timepoint에서 망막 절개로 뒤를 수행할 수 있습니다 해부하는 망막의 평면 장착하고, 부량. 세 번째 제한은이 분석은 적당히 높은 처리량있다는 것입니다. 한 실험에 구조의 수백을 테스트할 수 세포 배양 기반 assays과는 달리,이 프로토콜에 설명된 기술은 구성 당 하나의 전체를 마우스 망막의 최소 필요합니다. 따라서, 전용 핀셋으로 구성이 합리적 하루에 electroporated 수 있습니다. 현재 접근법을 사용 발기인 활동의 부량과 관련하여 한 추가 주의해야 할 점은 매우 강력한 발기인을 시금 때 특히, GFP의 채널로 DsRed 형광의 &#39;출혈을 통한&#39;에 대한 가능성이있다는 것입니다. 그 이유는의 방출 스펙트럼 그 GFP의 일부 중복을 DsRed 것입니다. 이 문제를 회피하기 위해 최적화된 방출 필터는 DsRed와 GFP 사이의 스펙트럼 중복을 최소화 것을 사용해야합니다. 이러한 최적화된 필터 설정을 사용할 수없는 경우, 다른 잠재적인 솔루션은 GFP 대신 푸른 이동 형광 단백질 (예, BFP 또는 CFP)를 사용하는 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Electroporation 요리, Microslide 453 </td><td> BTX 하버드 장치 </td><td> 45-0105 </td><td> 수정에 대한 프로토콜 섹션 1을 참조 </td></tr><tr><td> 100 % 실리콘 고무 수족관 시멘트 </td><td> 퍼펙토 제조 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 microtube 걸이 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 05-541 </td><td> 전용 랙 손잡이가 사용됩니다 </td></tr><tr><td> Dremel 도구 </td><td></td><td></td><td> 플라스틱 튜브 대뿐이야 핸들을 절단 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11,965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11,765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100X 농도 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> I - 6634 </td><td> 1000X 주식, 5mM HCL 및 필터 - 소독의 5mg/ml에 resuspend </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 스퀘어 - 웨이브 electroporator </td><td> BTX 하버드 장치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore 필터 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0.2μm </td></tr><tr><td> 조직 문화의 인큐베이터 </td><td></td><td></td><td> 37 ° C 5 % CO 2 </td></tr><tr><td> 유리 coverslips # 1.5 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 12 - 544E </td><td> 두께 0.16mm </td></tr><tr><td> 카메라가 장착된 형광등 복합 현미경 </td><td></td><td></td><td> 카메라 단색 (하마 마츠에 의해 예, 오르카 - ER 카메라)되어야합니다 </td></tr><tr><td> EGFP / 복합 현미경에 대한 DsRed 필터 세트 </td><td> 채도 기술 주식 회사 </td><td> 86,007 </td><td> 빨간색과 초록색 chanenels 사이에이 필터 세트 최소화 bleedthrough </td></tr><tr><td> ImageJ 소프트웨어 </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

의 활동을 quantifying cis</emexplant electroporation하여 마우스 망막에서> - 규제 요소

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

세포 유전자 네트워크 내에서 전사 요소 짧은 CIS - 규제 요소 (CRES)에 바인딩하여 spatiotemporal 패턴과 목표 유전자의 표현 수준을 제어 (~ 300-600 BP) 상류 거짓말을 할 수 게놈의 DNA 뻗어, 하류, 또는 시간 그들이 제어 유전자의 introns. 크르 (즉, 강화 / 발기인)은 일반적으로 1-3 transcriptional activators 및 repressors 모두에 대해 여러 개의 클러스터 바인딩 사이트로 이루어져 있습니다. 그들은 transcriptional 입력 논리적으로 통합이 spatiotemporally 정확하고 양적 정확한 발기인 활동의 형태로 하나의 출력을 제공 역할을합니다. 최신 CIS 규제 포유류의 대부분의 연구 4-5 CRES의 확장기 기능을 시금의 수단으로 마우스 transgenesis에 의존합니다. 이 기술은 주로 비 양적, 삽입 사이트 효과를 계정에 시간이 걸리는 비용과입니다. 한편, 포유 동물 CRE 기능에 대한 정량 assays는 조직 문화 시스템 (예를 들어, 듀얼 루시페라제 assays)에서 개발하지만, 이러한 결과의 생체내 관련성에서 종종 확실치되었습니다. Electroporation은 포유류의 조직 생활에서 CIS - 규제 활동 spatiotemporal와 양적 평가 모두를 허용한다는 점에서 전통적인 마우스 transgenesis에 훌륭한 대안을 제공합니다. 이 기술은 특히 대뇌 피질과 망막 6-8에서, 중추 신경 시스템에서 CIS 규제의 분석에 특히 유용했습니다. 생체내 및 전직 생체내 마우스 모두에서 망막 electroporation은, 개발 광범위하게 쓰다 및 Cepko 6-7,9에 의해 설명하고있는 동안, 우리는 최근 electroporated 마우스 망막 10 photoreceptor 특정 CRES의 활동을 계량하는 간단한 방법을 개발했습니다. electroporation에 의해 망막에 도입 DNA의 양이 실험에서 실험에 따라 다를 수 있습니다 감안할 때, 그것은 모든 실험에서 공동 electroporated &#39;로딩 제어&#39;를 포함하는 것이 필요합니다. 이러한 측면에서 기술 교양 세포에서 발기인 활동을 계량하는 데 사용되는 듀얼 루시페라제 분석과 매우 비슷합니다. photoreceptor CIS - 규제 활동을 시금 때, electroporation은 일반적으로 최고 막대 생산 11-12의 시간 신생아 생쥐 (출생 후의 일 0, P0)에서 수행됩니다. 일단 망막 세포 유형 사후 mitotic되고, electroporation들은 훨씬 더 효율적입니다. 신생아 마우스 및 막대는 성인 마우스 망막에있는 세포의 이상이 70 %를 구성한다는 사실에 막대의 출생의 높은 비율을 감안할 때, P0에서 electroporated 아르 세포의 대부분은 막대합니다. 이러한 이유로, 막대의 photoreceptors은 electroporation을 통해 공부하는 가장 쉬운 망막 세포 유형입니다. 우리가 여기서 설명하는 기술은 photoreceptor 크르의 활동을 quantifying 주로 유용합니다.

이 프로토콜은 explant의 electroporation을 통해 마우스 망막 생활 CIS - 규제 요소의 활동 (즉, 확장기 / 발기인)를 수치 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. DNA의 준비, 망막 절개, electroporation, 망막 explant의 문화, 포스트 고정 분석과 부량이 설명되어 있습니다.

의 활동을 Quantifying CIS</emExplant Electroporation하여 마우스 망막에서> - 규제 요소

세포 유전자 네트워크 내의 전사 인자는 표적 유전자의 ...에 결합함으로써 표적 유전자의 발현 수준과 시공간적 패턴을 조절합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 형광 전사 리포터를 사용하여 생쥐 망막 이식편을 전기천공하고 그 발현 수준을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 해부를 통해 신생 생쥐 망막 조직을 분리함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 형광 DNA 리포터 구조체로 망막을 전기천공하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 전기천공법이 수행된 망막을 임플란트로 하여 8일 동안 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 망막 외편물을 회수하고 형광 리포터의 발현 수준을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, x 외편물 전기천공법 후 정량적 데이터 분석을 통해 발달 중인 생쥐 망막에서 서로 다른 프로모터 리포터 제작물의 상대적 발현 수준을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.제 이름은 Joe Corbo이며, 세인트루이스의 Washington University School of Medicine 병리학 및 면역학부 교수입니다. 오늘은 광수용체 특이적 CYS 조절 요소의 활성을 정량화하기 위한 신생 쥐 망막의 ex vivo 전기천공법 기술을 시연하는 비디오 프로토콜을 선보이겠습니다. 이 프로토콜을 시연할 사람은 저희 실험실의 대학원생인 Cindy Montana입니다. 먼저 안구 수집을 준비하기 위해 전기천공 챔버와 모든 도구를 70% ethanol로 멸균하십시오.에탄올로 장갑과 벤치탑을 모두 소독하고, 실험 과정 전반에 걸쳐 무균 상태를 유지하십시오. 다음으로, 조직 배양 후드 내에서 멸균된 60 mm 페트리 접시 하나에 해부 배지 6 mL를, 멸균된 35 mm 접시 두 개에 배지 각각 3 mL를 피펫으로 분주합니다. 다시 벤치탑으로 돌아와, 70% 에탄올로 신생 생쥐 새끼의 머리와 목 부위를 소독합니다.가위로 머리를 빠르게 절단한 후, 머리를 멸균된 100 millimeter 디쉬로 옮기고 해부 현미경 하에서 작은 가위로 두피를 잘라내어 눈을 노출시킵니다. 곡선 핀셋을 사용하여 안와에서 눈을 조심스럽게 퍼낸 다음, 해부 배지가 담긴 35 millimeter 디쉬에 눈을 넣습니다. 전기천공법을 적용할 DNA 분취당 3~4개의 눈이 확보될 때까지 계속해서 눈을 수집하며, 수집이 완료될 때까지 눈과 해부 배지를 상온으로 유지합니다.면도날과 멸균 플라스틱 전이 피펫의 포장지를 70% ethanol로 소독한 후, 면도날을 사용하여 눈 전체를 피펫으로 옮길 수 있을 만큼 충분히 높게 피펫의 끝부분을 잘라냅니다. 넓어진 피펫을 사용하여 해부 현미경의 고배율 하에서 35 millimeter 디쉬의 눈 하나를 60 millimeter 디쉬로 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 눈 표면에서 외안근 및 지방과 같은 조직을 제거합니다.그 다음 시신경의 기저부를 집어내어 제거합니다. 망막을 분리하기 위해 각막연 부위의 공막에 작은 구멍을 냅니다. 공막과 망막색소상피는 무광 회색인 망막 조직에 비해 광택이 납니다. 두 쌍의 핀셋 중 각각 하나의 끝을 구멍에 삽입하고 공막과 RPE를 조심스럽게 찢어 엽니다.렌즈가 그대로 유지되도록 주의하십시오. 넓어진 피펫을 사용하여 절개된 망막을 배지가 담긴 두 번째 35 millimeter 디쉬로 옮깁니다. 모든 망막을 수집하여 37 degree Celsius 조직 배양 인큐베이터에 보관하십시오.전기천공법을 실시하기 전, 조직 배양 후드 내에서 전기천공할 각 DNA 분주액을 준비하며, 멸균된 35mm 디쉬 하나에는 해부 배지를, 두 번째 디쉬에는 배양 배지를 채웁니다. P 200 피펫을 사용하여 전기천공 디쉬의 챔버를 멸균된 1X PBS로 3회 세척합니다. 챔버에 60µL의 DNA 분주액을 채우고, 사용하지 않는 나머지 챔버에는 60µL의 1X PBS를 채웁니다.전극을 전기천공 컵에 연결하고 전기천공 장치에 적절한 설정을 입력합니다. 미세 핀셋을 사용하여 수정체 부분을 잡고 망막을 전기천공 챔버로 옮깁니다. 각 챔버에 최대 4개의 망막을 배치합니다.렌즈가 양극에 연결된 금속 바에 기대어 있도록 망막을 배치합니다. 한 챔버에서 다음 챔버로 DNA가 전이되는 것을 방지하기 위해 각 챔버 작업 사이에 포셉을 닦아냅니다. 모든 망막의 정렬이 완료되면 전기천공기의 시작 버튼을 누릅니다.음극에 연결된 금속 막에 작은 기포가 형성되어야 합니다. 핀셋을 사용하여 전극을 분리하고 전원을 끕니다. 망막을 챔버 벽에서 조심스럽게 떼어냅니다.챔버에서 망막을 꺼내 해부 배지가 담긴 35 millimeter 접시로 옮깁니다. 멸균된 전송 피펫을 사용하여 망막을 해부 배지에서 배양 배지가 담긴 35 millimeter 접시로 옮깁니다. 멸균된 6-well 배양 플레이트의 웰에 라벨을 붙이고, 각 웰에 3 milliliters의 배양 배지를 채웁니다.멸균 핀셋을 사용하여 각 웰의 배지 위에 원형 watman nucleo 필터를 띄우되, 필터의 광택이 있는 면이 위를 향하도록 합니다. 해부 현미경의 도움을 받아 멸균 전송 피펫으로 망막 하나를 렌즈 면이 아래로 향하게 하여 필터 위로 옮깁니다. 만약 망막의 렌즈 면이 위로 향한 상태로 놓였다면, 다시 피펫으로 빨아들여 재시도하십시오.각 웰에 망막을 4개 이하로 넣고 각각 별도의 방울 형태로 유지하십시오. 망막을 웰에 배치한 후, 배양 플레이트를 37 °C 조직 배양 인큐베이터로 옮겨 원하는 시간 동안 배양합니다. 일반적으로 여기서 보이는 바와 같이 8일간 배양하면, 망막 표면의 1/4에서 1/3에 걸쳐 DNA 구조체가 발현되는 성공적인 전기천공 결과가 나타납니다.형광 수준은 CRE 컨스트럭트를 발현하는 균일하게 전기천공된 영역을 망막 외부 영역과 비교한 후, 대조군 GFP 발현으로 정규화하여 정량화합니다. 특히 간상 광수용체가 효율적으로 형질도입되었음을 확인하였습니다. 여기 두 개의 간상세포 특이적 프로모터가 외핵층에서 GFP와 DS red의 발현을 유도한 전기천공 결과가 제시되어 있습니다.여기에 파란색으로 표시된 DPI 염색과 두 가지 발현 패턴을 겹쳐 보면, 광수용체 특이적 발현이 분명하게 나타납니다. 중간층이나 신경절 세포층에서는 발현이 관찰되지 않습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 망막 시스트 조절 요소의 활성을 정량화하기 위해 생쥐 망막 절편을 어떻게 분리하고 배양하는지에 대해 잘 이해하시게 될 것입니다.시청해주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기에서 망막 신경절 murine 세포 (RGCs)의 유전자 발현을 조작 두 가지 기법을...

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한...

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

조건부 성인 zebrafish의 망막에서 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법은 intravitreally 안티 센스 morpholinos를 주입하여 망막에 그들을 electroporating 포함하는, 설명되어 있습니다. 그 결과 단백질은 재생이나 그대로 망막에있는 단백질의 역할을 테스트 수 며칠에 대한 무너뜨렸다입니다.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

이 비디오의 전반적인 목표는 타겟 망막 주사를 수행하는 방법을...

배아 칙의 망막에서 비켜 Electroporation에

Midgestation 마우스 태아의 아래쪽 사방 정계 립의 시험 관내 Electroporation에

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

배아 병아리 망막 세포 배양은 광 수용체 생물학의 연구에 유용한 도구를 구성한다. 우리는 이전에 배양 망막의 플라스미드 일렉트로 오보 EX에 기초한 효율적인 유전자 전달 기술을 개발했다. 이 기술은 상당히이 시스템에 대한 가능한 유전자 조작을하고, 현재 사용 가능한 프로토콜을 통해 형질 전환 효율을 증가시킨다.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

학습하세요 마우스 망막에서 explant electroporation을 이용한 cis-조절 요소 활성 정량화 방법을. 형광 리포터를 사용하여 망막 세포의 유전자 발현을 시각화하고 분석하는 이 기술은 신경과학 및 유전학 연구에 필수적입니다.

의 활동을 Quantifying CIS - 규제 요소

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