두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

이 영화의 전반적인 목표는 칼슘에 민감한 형광 지표를 사용하여 피질 뇌 절편 발달로부터 네트워크 활동을 측정하는 방법을 보여주는 것입니다. DY 뇌 절편은 어린 쥐의 발달 중인 장 피질로 만들어집니다. 뉴런과 성상세포는 모두 칼슘 의존성 마커로 가득 차 있습니다.

칼슘 의존성 염료의 형광 변화는 세포 활동의 변화를 반영합니다. 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia) 및 내피 세포(endothelial cell)를 포함한 비신경 세포는 특정 마커 염료를 사용하여 염색할 수 있습니다. 피질 네트워크 활동은 타임 랩스를 사용하여 기록되며, 다광자 이미징 셀은 관심 영역을 통해 이미지의 3D 스택을 만들어 네트워크 내에서 감지됩니다.

그런 다음 여러 세포에 걸친 세포 형광의 변화를 분석하여 발달 중인 피질 네트워크의 활동을 판독할 수 있습니다. 발달 중인 신경계의 활동 패턴은 자발적인 동기화된 네트워크 활동입니다. 동기화된 활성은 온전한 척수 피질 및 자발적 활동 뉴런 기간 동안 해리된 뉴런 배양 준비를 포함하여 다양한 개발 중인 뉴런 영역에서 관찰되었으며, 칼슘 유입으로 이어지는 전압 의존성 칼슘 채널을 포함하여 많은 철 채널을 활성화하는 단일 스파이크 또는 활동 전위의 폭발로 탈분극되었습니다.

고도로 동기화된 활동은 필드 전극 또는 다중 전극 어레이를 사용하여 로컬 네트워크에서 측정되었습니다. 이를 통해 높은 시간 샘플링 속도를 얻을 수 있지만 세포 활성의 통합 판독으로 인해 공간 해상도가 낮아집니다. 신경 활동의 단일 세포 분해능은 발사 속도를 측정하기 위해 단일 뉴런의 패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 가능합니다.

그러나 네트워크에서 측정할 수 있는 기능은 동시에 패치된 뉴런의 수로 제한되며 일반적으로 하나 또는 두 개의 뉴런에 불과합니다. 칼슘 의존성 형광 지표 염료를 사용하면 세포 네트워크 전반에 걸쳐 동기화된 활동을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 높은 공간 해상도와 개발 네트워크의 자발적인 활동을 기록하기에 충분한 시간 샘플링을 제공합니다.

URA 2:00 AM 에스테르와 같은 형광 칼슘 민감성 지표에는 칼슘 광산과 결합할 수 있는 카르복실산기가 포함되어 있습니다. 이러한 형광 염료는 1개의 광자 또는 2개의 광자 현미경을 사용하여 특정 광 파장에 의해 활성화됩니다. 염료에서 방출되는 광자의 수는 칼슘의 결합에 따라 일시적으로 변경됩니다.

이러한 광자 수 또는 형광의 변화는 델타 FF 신호로 보고되며 뉴런 내 칼슘 수치의 변화에 해당합니다. 칼슘에 민감한 지표의 변화 측정은 발달 중인 세포의 네트워크 활동 패턴을 판독하는 데 유용한 측정값입니다. 안녕하세요, 저는 리아나 모티(Rianna Morty)이고, 제 이름은 줄리 애버츠(Julie Abbots)입니다.

우리는 암스테르담에 있는 해석 신경생리학과와 대학에서 왔습니다. 우리는 칼슘 이미징을 사용하여 다초점 이미징에서 칼슘 민감성 지표를 사용하여 마우스 피질의 조직 발달 시 기능적 활동을 연구해 왔습니다. 이 짧은 영화의 목적은 이러한 방법을 사용하여 신경계의 네트워크를 개발할 때 자발적인 활동 패턴과 유발 활동 패턴을 모두 측정하는 방법을 보여주는 것입니다.

신경 회로의 손상을 줄이기 위해 어린 쥐의 두개골에서 뇌를 빠르게 제거합니다. 얼음 차가운 슬라이스 용액에서 뇌를 해부합니다. 슬라이스 용액에는 신경 세포 기록을 위해 A TSF에서 일반적으로 사용되는 나트륨 대신 염화 일계가 포함되어 있습니다.

이 실험에서 우리는 발달 중인 쥐 뇌의 경장 피질에서 뇌 조각을 만들고 있습니다. 석유 접시 위에 여과지 한 조각을 놓고 A TSF 몇 밀리리터로 적십니다. 뇌를 여과지 조각으로 옮깁니다.

단일 가장자리 면도날을 사용하여 반구를 이등분합니다. 두 반구를 분리합니다. 나머지 반구와 함께 얼음 슬라이스 용액에 하나를 다시 놓습니다.

면도날로 소뇌를 제거합니다. 한쪽 반구를 정중선으로 뒤집고 등쪽 표면에서 약 1mm를 자르고 잎이 위쪽 끝을 향해 약간 각도를 이루도록 합니다. 뇌를 뒤집으십시오.

최근에 면화새와 금속 주걱을 사용하여 표면을 자릅니다. 뇌를 금속 절단 블록으로 옮깁니다. 목화봉으로 주걱에서 뇌를 접착된 표면 위로 부드럽게 밀어 넣습니다.

300마이크로미터의 뇌 절편은 젊은 조직을 위해 절단되며, 절단 속도는 일반적으로 성숙한 조직에 사용되는 것보다 느립니다. 절단이 완료되면 유리 피펫을 사용하여 각 슬라이스를 실온에서 산소화된 A TSF가 포함된 홀딩 챔버로 옮깁니다. A CSF는 A CSF 용액보다 마그네슘 대 칼슘의 비율이 더 높습니다.

슬라이스를 기록하는 데 사용되며 복구를 위해 1시간 동안 방치됩니다. 세포에 칼슘 의존성 지표 또는 세포 특이적 마커를 로드하려면 염색 절차를 위해 슬라이스를 챔버로 옮겨야 합니다. 상업용 챔버를 사용할 수 있지만 매우 적은 비용으로 표준 실험실 장비에서 쉽게 조립할 수 있습니다.

염색 챔버를 만들려면 다음과 같은 기본 실험실 장비, 플라스틱 페트리 접시 2개, 10ml 주사기 1개, 실리카 튜브 섹션, 반투막 초강력 접착제가 있는 세포 배양 인서트, 소형 튜브 커넥터 3개 및 미세한 바늘이 필요합니다. 큰 페트리 접시를 가지고 측벽을 통해 가열된 막대로 작은 구멍을 만듭니다. 작은 페트리 접시를 가지고 실리콘 튜브가 통과할 수 있을 만큼 충분히 큰 비슷한 크기의 구멍을 만듭니다.

구멍을 통해 실리콘 튜브 부분을 통과시키고 작은 접시 내부에 고리를 형성합니다. 슈퍼 접착제를 사용하여 튜브의 열린 끝을 밀봉하십시오. 그런 다음 튜브의 나머지 부분을 작은 페트리 접시의 내벽에 붙입니다.

작은 페트리 접시를 큰 접시의 중앙에 놓고 제자리에 붙입니다. 실리콘 튜브의 나머지 끝을 잡고 페트리 접시 측벽에 있는 작은 구멍으로 통과시킵니다. 가는 바늘을 가지고 페트리 접시 내부의 실리콘 튜브에 작은 구멍을 뚫습니다.

균일한 가스퍼 융합을 위해 균일한 간격으로 구멍을 만드십시오. 가열된 메스를 사용하여 반투막으로 세포 배양을 잘 수행합니다. 우물의 상단 1cm를 잘라내어 부화하는 동안 조각을 담을 수 있는 얕은 접시를 남깁니다.

다공성 실리콘 튜브로 둘러싸인 작은 접시의 중앙에 얕은 접시를 놓습니다. 큰 접시의 뚜껑에 지름 약 1/2에서 1cm의 구멍을 만드십시오. 가열된 메스를 사용하여 10ml 플라스틱 주사기를 가져옵니다.

주사기의 끝을 제거하기 위해 비스듬히 자릅니다. 주사기 튜브의 절단면에 슈퍼 접착제를 바르십시오. 이것을 큰 페트리 접시 뚜껑의 구멍 바로 위에 붙입니다.

주사기 팁 끝에 튜브 커넥터를 부착합니다. 얕은 접시를 작은 페트리 접시 중앙에 놓고 다공성 가스 튜브가 접시 주위에 놓이도록 합니다. 그런 다음 이 튜브를 탄수화물 가스 공급 장치에 연결하여 슬라이스에 산소를 공급합니다.

배양하는 동안 주사기 팁을 통해 가스 공급 장치에 직접 연결된 큰 접시의 뚜껑을 교체하십시오. 이렇게 하면 염료의 표백을 방지하기 위해 배양 중에 슬라이스 위로 자동차와 가스가 공급됩니다. 모든 절차는 가능한 한 적은 빛으로 수행되며 염료와 슬라이스는 모두 어두운 곳에 보관됩니다.

슬라이스 홀더에서 약 1.5mL의 A TSF를 염색 챔버에 채웁니다. 인터페이스 챔버를 내부에 놓고 A TSF를 한 번 더 채웁니다. 조직을 건강하게 유지하고 슬라이스를 잘 로드하기 위해 적절한 산소 공급을 유지하는 것이 중요합니다.

염색은 약 35°C에서 발생하여 염색 챔버가 가열되는 동안 염료가 뉴런으로 흡수되는 것을 용이하게 합니다. 피라 2:00 AM 에스테르에 대한 지표 염료를 준비합니다. 50마이크로그램 바이알에 9마이크로리터의 DMSO와 1마이크로리터의 온산을 추가합니다.

DMSO 및 오닉스. 염료가 지질막을 통해 흡수될 수 있도록 하는 퍼메제로서 작용합니다. 염료가 완전히 용해되도록 바이알을 15분 동안 볼텍

염색을 위해 각 슬라이스를 계면으로 옮깁니다. 염색 챔버에 삽입합니다. 염료를 슬라이스 위의 관심 영역에 직접 쓰다듬고 염색 챔버의 뚜껑을 닫습니다.

슬라이스를 사용된 마우스의 나이에 따라 20-40분 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 배양 후 슬라이스를 슬라이스 홀더에 다시 옮겨 남아 있는 여분의 염료를 씻어냅니다. 칼슘 이미징을 위한 염색 프로토콜은 오래된 조직에도 적용할 수 있습니다.

이를 위해서는 사전 배양의 추가 단계가 필요합니다. 오래된 조각을 3 밀리리터의 CSF와 8 마이크로 리터의 크레마 4 용액으로 채워진 얕은 사전 배양 접시에 0.5 % °C로 35 분 동안 가열합니다. 그런 다음 슬라이스를 계면으로 옮기고 염색 챔버에 삽입한 다음 일반적인 염색 절차를 따릅니다.

또한 비신경 세포, 즉 성상세포, 미세아교세포 및 내피 세포에 대해 이러한 슬라이스를 염색하는 것도 가능합니다. Sulfur rumine 1 0 1은 황 도민을 위해 성상세포를 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 10 마이크로 몰 피펫 용액을 만들고 슬라이스의 관심 영역에 보라색 염료를

15분 동안 배양하도록 둡니다. 슬라이스를 홀딩 챔버로 다시 옮겨 과도한 염료를 제거합니다. 토마토 렉틴의 FSE 접합체는 미세아교세포와 내피 세포를 염색할 수 있습니다.

토마토 렉틴의 경우 밀리리터당 20마이크로그램의 용액을 만드십시오. 조각의 관심 영역 위에 염료를 쓰다듬습니다. 슬라이스를 45분 동안 배양하도록 그대로 두십시오.

그런 다음 조각을 다시 한 번 홀딩 챔버로 옮깁니다. 이미징 중 슬라이스는 현미경 아래에서 안정적이어야 합니다. 일반적으로 금속 하프는 조직을 고정하기 위해 배치되지만 슬라이스 표면이 고르지 않게 왜곡되어 이미징이 피할 수 있도록 제한된 시야만 초점이 맞춰질 수 있습니다.

이 슬라이스는 POLYETHALINE 또는 PEI 용액을 사용하여 기록 챔버에 접착됩니다. PEI는 적어도 1시간 동안 표면에 세포의 부착을 향상시키는 데 사용되는 폴리머입니다. 슬라이스를 레코딩 챔버에 넣기 전에 챔버 바닥을 덮을 수 있도록 이 챔버에 몇 밀리리터의 PEI 용액을 채웁니다.

먼저 증류수로 챔버에서 PEI를 헹구어 낸 다음 CSF 용액을 트랜스 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 과도한 A CSF 용액을 제거합니다. 고운 붓을 사용하여 챔버 중앙에 슬라이스를 놓습니다.

작은 흡수성 여과지 조각을 사용하여 A CSF를 모두 제거합니다. 슬라이스의 가장자리 주위에 A CSF가 더 이상 없는지 확인하십시오. 마지막으로, 챔버에서 느슨하게 하지 않고 슬라이스에 CSF 반 밀리리터를 부드럽게 두드려줍니다.

챔버를 산소가 공급되는 큰 계면 용기에 넣고 어둠 속에서 한 시간 더 그대로 두십시오. 칼슘에 민감한 지표 염료의 변화는 하나 또는 두 개의 광자 현미경으로 기록할 수 있습니다. 우리는 Olympus 현미경에 결합된 티타늄 사파이어 레이저를 사용하여 신경 네트워크에서 두 개의 광자 이미징을 가능하게 합니다.

또한 프레임 스캔 속도를 높이기 위해 EM CCD hammer MATSU 카메라와 함께 L Vision 생명공학 트림 스코프 시스템을 사용합니다. 1.6 밀리몰의 칼슘과 1.5 밀리몰의 칼슘을 함유한 산소화된 A-T-S-F-A-T-S-F의 안정적인 흐름으로 슬라이스 챔버를 현미경 아래에 놓습니다. 마그네슘은 백색광을 사용하여 설정에서 약 30°C까지 가열됩니다.

슬라이스에서 관심 영역을 찾고 표면에 초점을 맞춥니다. 조명을 끄고 녹음 캐비닛 도어를 닫습니다. 배경 조명 수준을 줄입니다.

이미지를 기록하고 분석하기 위해 다양한 상용 또는 개방형 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다.우리 실험실에서는 Lavis Biotech의 인수를 위해 검사기 소프트웨어를 사용합니다. 이미징을 시작하려면 감지할 CCD 카메라 모드를 선택합니다. 지표와 관련된 파장을 설정하십시오.

fira 2:00 AM Ester의 경우 트림 스코프 소프트웨어에서 여기를 820나노미터로 설정했습니다. 64B 스캔 모드를 선택합니다. 관심 영역에 대한 최적의 크기, 시야각, 픽셀 해상도를 선택하십시오.

이미지 샘플링에 필요한 경우 적절한 프레임 속도와 픽셀 회전을 선택합니다. 연속 이미징을 위해 레이저 셔터를 엽니다. 연속 이미징 모드 사용.

게인과 레이저 강도를 조정하고 이미지화하려는 뉴런 네트워크에 초점을 맞춥니다. 스캔을 중지합니다. 프레임 속도 및 시퀀스 지속 시간에 대한 타임랩스 설정을 선택합니다.

타임랩스 이미징 후 1미크론 단위로 위로 20미크론, 아래로 20미크론을 표시하는 이미지의 Z 스택을 만듭니다. 이 Z 스택은 분석 중 세포 검출에 사용됩니다. 기록된 파일을 TIFF 이미지 스택으로 내보냅니다.

결론적으로, 우리는 발달 중인 피질에서 동기 자발적 네트워크 활동을 측정하기 위해 칼슘 지표의 사용을 보여주었습니다. 방법론 및 시약에 대한 자세한 내용은 이 동영상과 함께 제공되는 데이터 시트에서 확인할 수 있으므로 자신의 실험실에서 기술을 설정할