Name: 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 마우스 배아 줄기 세포를 모터 뉴런으로 효율적으로 분화하는 새로운 프로토콜을. 면역형광 현미경으로 특이적 마커 발현을 확인하고, 척수성 근위축증과 같은 모터 뉴런 질환 연구에 활용하세요.

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본 원고는 2011년 5월 26일 일에 돌아가셨 박사 Wenlan 왕의 기억에 전념하고 있습니다. 우리는 넉넉한 본 연구에 사용된 HBG3 MES 세포를 제공해 주셔서 박사 더글러스 A. 커 감사드립니다. 이 작품은 Nemours 추진하는 사업, 연구 자원을위한 국립 센터 (NCRR)을 위해 센터를 지원하는 NCRR에서 코브레 기금 수상 (5 P20 RR020173-05)의 INBRE 프로그램하에 부여 (2 RR016472-10) 어린이, 윌밍턴, 델라웨어, 미국의 알프레드 나 듀폰 병원 소아 연구.

1. 1 단계 : 마우스 배아 줄기 (MES) 세포 배양 (타이밍 : 3 일) 1. 도금 주 태아의 마우스 섬유아 세포 (PMEF) <ol><li> PMEF 부착을위한 젤라틴과 코트 넷 100-mm 조직 문화 요리. 각각의 접시에 0.1 % 젤라틴 용액 (StemCell 기술) 8 ML을 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. </li><li> 요리에서 젤라틴 초과를 제거합니다. 요리 린스하지 마십시오. </li><li> 약 포함되어 있습니다 Mitomycin C-inactivated PMEF (Millipore) 중 하나 병을 희석. 5 X 10 6 PMEF 미디어의 40 ML로 셀 (표 1의 제조법 참조)과 네 개의 100 mm 조직 배양 요리 진입 판. PMEF는 MES 전지 피더 레이어를 제공합니다. </li><li> PMEF는 MES 셀 문화를 추가하기 전에 적어도 하루 도금해야한다. PMEF은 도금 후 1 주일까지 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. 도금 MES 셀 모터 뉴런으로 MES 세포 분화의 효율성을 모니터링하려면우리는 HBG3, 모터 뉴런 특정 발기인 Hb9의 통제하에 eGFP을 표현 형질 전환 생쥐에서 파생 ES 세포주를 사용했습니다. <ol><li> 서리를 없애다 37 ° C 물 목욕에 HBG3 MES 세포 중 1 개의 유리병 (약 1 × 10 7, 박사 더글라스 커, 존스 홉킨스 대학에 의해 기여). 15 ML 관에서 ES 미디어 (표 1에서 제조법 참조) 5 ML을 추가하고 5 분 800 rpm으로 세포를 다운 스핀. </li><li> 10 NG / ML의 최종 농도에서 갓 추가한 백혈병 억제 인자 (난생)와 ES 미디어 20 ML의 대기음 뜨는 및 resuspend MES 세포. 참고 : 난생는 이용 당일에 추가되어야하며 undifferentiated 상태에서 MES의 세포를 유지하기 위해 필요합니다. </li><li> 각 접시에 PMEF에서 10 ML PMEF 미디어를 제거하고 각 접시에 HBG3 ES 세포 현탁액의 10 ML에 추가합니다. </li><li> 24 H 도금 후, MES 세포의 크기는 그림 1B에 화살촉으로 표시 식민지와 비슷한 작은 식민지를 형성하고 있습니다. 도금 후 72 H, coloni크기 일이야 증가, 많은 지름이 약 100 μm의 (그림 1B, 화살표로 표시)되고. 이러한 세포는 차별 화를위한 준비가되어 있습니다. 미디어는 세포 증식을 유지하기 위해 매일 교체해야합니다. </li></ol> 2. 2 단계 : 신경 유도 (타이밍 : 2 일) 모터 뉴런으로 MES 세포의 분화를 유도하기 위해 MES 전지 PMEF에서 분리 및 서스펜션 환경에서 재배해야합니다. 젤라틴 코팅 flasks는 MES 세포에서 PMEF를 구분하는 데 사용됩니다. <ol><li> MES의 식민지가 신경 유도 (차별화 당일 0으로 정의), 실온에서 30 분에 대해 0.1 % 젤라틴 (18 ML / 술병)와 코트 2 T150 flasks을위한 준비 후 초과 젤라틴을 제거하고 1X PBS 세 번 함께 씻어 때. 참고 : 각 100 mm 음식 문화는 PMEF을 분리 하나 T150-젤라틴 코팅 플라스크가 필요합니다. </li><li> 조심스럽게 느슨하게 연결된 식민지를 이동시키다 않도록하고, 열망하여 미디어를 제거합니다. 10 ML PBS의 간단한 추가기껏해야 그리고 세차 단계를 완료하기 위해 흡인하여 제거합니다. </li><li> PMEF에서 MES 전지를 분리하려면, 0.25 %를 추가 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (3 ML / 요리 StemCell 기술)와 37에서 3-5 분 동안 품어 ° C를 줄기 세포와 PMEF는 접시에서 분리까지. 식민지를 (15-20 번) 부수 다운 난생와 pipet 전지없이 15 ML 신선한 ES 미디어를 추가합니다. 그런 다음, 0.1 % 젤라틴 코팅 T150 플라스크에 추가할 37시 30 분 동안 품어 ° C. ES 세포가 떠 있어야하면서 부화 후 PMEF는 gelatinized 표면에 부착해야합니다. 50 ML 튜브에 떠있는 MES 세포를 수집합니다. </li><li> (표 1에서 제조법 참조) 신경 분화 매체의 10 ML 800 RPM과 resuspend 세포에서 내려 봐. </li><li> 100 mm 세균이나 서스펜션 배양 접시에 hemocytometer 후 접시에 약 2 × 10 6 MES 세포를 사용하여 세포를 세어보세요. 이 번호판은 서스펜션 문화의 성장을 허용하고 embryoid 기관 (EBS)의 형성을 촉진. </li><li> differentia에서기 하루 1, MES 전지는 빛을 현미경으로 볼 수있는 작은 부동 집계 (EBS)를 형성하고 있습니다. 모든 carryover PMEF는 요리에 첨부해 주시기 바랍니다. 3 분위한 저속 (500 RPM)에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 현탁액 세포와 미디어를 전송합니다. 신중하게 미디어를 대기음, 새로운 세균 접시에 접시에 세포 후 pelleted EBS에 신선한 신경 분화 매체의 10 ML을 추가합니다. 미디어를 replenishing 이외에이 단계는 이전 단계에서 이월 어떠한 PMEF를 제거합니다. </li><li> 차별 하루 2, EBS는 운동 뉴런에 시달릴 수도 준비가 된 것입니다. </li></ol> 3. 3 단계 : 모터 뉴런 사양 (타이밍 : 5 일) <ol><li> 차별 하루 2, 소용돌이 문화 접시를하고 15 ML 관으로 미디어와 EBS를 전송에. EBS 중력 (~ 10 분)에 의해 또는 3 분 저속 (500 RPM)에서 원심 분리하여 정착하자. </li><li> (제조법을 볼에서 모터 신경 세포의 분화의 10 ML (국방부) 중간에 신중하고 resuspend EBS 미디어를 기음 <strong&gt; 표 1). 플레이트 새로운 세균 접시에있는 EBS와 5 일 동안 매일 미디어를 변경합니다. </li><li> 직경 200 μm의 강력한 GFP 신호 (그림 1C)을 표현한다 - 차별화의 날 7 일에 EBS가 약 150이어야합니다. 이러한 EBS는 코팅 요리 또는 coverslips을 poly-DL-ornithine/laminin에 dissociated 및 도금이 될 준비가 된 것입니다. </li></ol> 4. 4 단계 : Poly-DL-ornithine/laminin 코팅 Coverslips의 작성 (타이밍 : 2 일) 이틀 EBS를 dissociating 전에 (차별화의 날 5 예), poly-DL-ornithine/laminin-coated coverslips를 준비합니다. <ol><li> 24 잘 접시의 바닥에 장소 12 mm 원형 coverslips (워너 인 스트 루먼트). 10X 주식 솔루션 (1 밀리그램 / ML)을 구하는 25 MG 25 ML의 폴리-DL-ornithine (시그마 - 올드 리치) 멸균, 이중 증류수 (D 2 H 2 O)를 해산. 때 사용할 준비 concent를 얻을 D 2 H 2 O와 폴리-DL-ornithine의 10분의 1 희석하다100 μg / ML의 배급. 하룻밤 동안 4에 24 잘 판과 부화 각각 잘 ° C에서 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 다음날 (차별화의 날 6), 기음 폴리-DL-ornithine하고 조직 문화 후드에 접시와 건조 커버 전표 공기 봅시다. D 2 H 2 O를 세 번 같이 판 우물을 씻어. 한 시간 동안 공기 건조 구. </li><li> 100x 주식 용액 (200 μg / ML)를 만들기 위해 아이스처럼 차가운 1X PBS의 5 ML에 1 밀리그램 마우스 laminin (Millipore)를 해산. 때 사용할 준비 아이스처럼 차가운 1X PBS (2 μg laminin / ML)의 100분의 1 희석을합니다. 0.5 ML 추가 / 음 4 24 잘 판과 부화에 ° C에서 하룻밤을위한. 시딩 세포하기 전에 과잉 laminin은 제거하고 우​​물은 1X PBS로 두 번 씻어서해야합니다. Coverslips은 국방부 중형 (0.5 ML / 음)에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. 5 단계 : 축삭의 신장 (타이밍 : 2 일) <ol><li> 차별화의 날 7 일에 15 ML 관으로 EBS를 수집하고 EBS가 (약 3 분) 정착하실 수 있습니다. 기음 미디어와 다시의PBS의 uspend EBS. EBS가 정착 후 PBS를 대기음하도록 허용합니다. 이 단계를 3 번​​씩 반복합니다. 부드럽게 믹스 앤 실온에서 5 분 동안 품어, EBS에 Accumax (Millipore) 1 ML을 추가합니다. 그렇다면 EBS를 덮고 초과 Accumax을 기음. </li><li> EBS를 떼어 놓다하려면 국방부 매체 3 ML을 추가합니다. EBS를 방해하는 한 ML Eppendorf micropipette (파란색 팁)을 사용 Pipet 위아래로 20 회. 상온에서 2 분 동안 품어. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 셀 스트레이너 뚜껑 (BD 팔콘)로 12x75 mm 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 단일 세포의 수율을 풍요롭게하는만큼 필터에 의해 보관 남은 대단히 짧은 시간과 세포이 분리 단계를 반복합니다. 최종 단일 세포 현탁액 6 ML 될 것입니다. </li><li> 살살이 단일 세포 현탁액을 혼합하고 hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. ML 당 2x10 5 세포 밀도에 국방부 매체 (10 각 BDNF의 NG / ML, GDNF, CNTF, 및 NT-3과 보충)로 세포를 희석. PO를 포함하는 24도 접시에 세포 현탁액을 (0.5 ML / 잘) 추가ly-DL-ornithine/laminin 코팅 coverslips (위에서 설명한대로 이전 준비). 차별화된 세포는 문화 2 일 (그림 1D) 이후 오랜 neurites을 확장. </li></ol> 6. 대표 결과 그림 1A는 프로토콜의 개요를 보여줍니다. 1 단계에서 MES 전지 PMEF에서 재배되며 자발적인 차별을 방지하기 위해 난생으로 보충. 일반적으로 undifferentiated MES의 식민지는 원형 및 소형이고, 명확하게 가장자리를 정의했습니다. 식민지는 서로 연락을하지 않습니다. 일반적으로, MES 세포는 매 2 ~ 3 일 1시 4분 비율로 분할해야합니다. 그러나 각 개별 셀 라인은 서로 다른 속도로 성장할 것이며, 분할 비율은 경험적으로 결정되어야합니다. 그림 1B에있는 화살표는 3 일 동안 PMEF 피더 계층에 culturing 후 MES 세포의 전형적인 모양을 나타냅니다. 이러한 식민지가 큰 (직경 50-100 μm의)하지만, 여전히 원형과 정의 우위를 유지의. 이 단계에서는 식민지는 차별이나 subculture에 대한 준비가되어 있습니다. 그림 1B의 화살촉은 일반적으로 도금 후 24 H를 찾을 수있는 작은 MES들의 서식지를 보여줍니다. 도금 후 4 일이, MES 전지는 크게 자란된다. 그들은 차별화하기 시작되었는지 나타내는 평평 외관 및 정의된 경계의 손실을 보여줍니다. 이러한 세포의 연결을 세포로 분화에는 최적화되어 있지 않습니다. 모터 뉴런으로 MES 세포를 차별화하기 위해 MES 전지 EB 형성을 허용하도록 서스펜션 조건에서 재배해야합니다. 2 단계에서 ES 세포는 EB 형성을 촉진하기위한 피더 레이어없이 문화 표면에 전송됩니다. 이 단계에서 그들은 신경 혈통에 대한 직접적인 세포 ~ 2 일 동안 소량, bFGF, 그리고 FGF-8과 보충 신경 분화 매체에 incubated됩니다. 작은 EBS는 차별화의 일 1시 현미경으로 관찰할 수있다. 그들은 중간에 떠 있어야합니다. Carryover PMEF는 1 일에서 찾을 수 있습니다분화 및 제거해야합니다. 이러한 세포는 EBS가 새로운 세균 접시에 passaged 때 이렇게 제거되는 세균 요리에 충실. 따라서 분화의 일 2에 의해 몇 없거나 전혀 PMEF가 문화 접시에 볼 수 있습니다. 3 단계에서 새로운 요리에 대한 EBS의 양도 어느 남아 PMEF의 제거를 보장해야 계속했다. EBS가 RA로 보충 모터 신경 세포의 분화 (국방부) 미디어 배양해 및 모터 뉴런으로 세포를 차별화하는 데 5 일째 처짐됩니다. 문화 동안 EBS 크기가 계속해서 성장과 분화의 날 3시 육안으로 볼 수 있습니다 ~ 4. 그림 1C는 차별화 당일 7 EBS의 미세한 모양을 보여줍니다. undifferentiated 세포와는 달리, EBS는 GFP의 표현으로 인해 강한 형광을 보여줍니다. 이러한 EBS는 최적 차별하고 분열을위한 준비가되어 있습니다. 유동세포계측법 51 % ± dissociated EBS에서 세포의 0.8 %는 세포에게 5 표현 GFP로 구분 것을 보여주었다. 단계 5 회 문화에GDNF, CNTF, BDNF, 그리고 긴 axonal 계획안의 확장 NT3 결과의 앞에서 ESE 모터 뉴런 있습니다. 그림 1D 2 일 dissociated EBS의 도금 후 차별화된 세포의 모양을 보여줍니다. 도금 세포 세포 기관에서 연장 긴 neurites를 적어 둡니다. Immunofluorescent 염색법은 GFP + 세포가 팬 -의 연결 마커 (neurofilament - 중간 체인) 두 개의 모터 뉴런 특정 마커 (섬-1과 콜린 acetyltransferase, 그림 2)을 표현하는 것을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> 그림 1. 모터 뉴런 (사진 우 외에서 수정했습니다. 5)으로 MES 세포의 분화. MES 세포에서 모터 뉴런으로 분화 프로토콜의) 제도. B) Undifferentiated MES 세포는 fibroblast 피더 레이어의 상단에 둥근 식민지를 형성하고 있습니다. 그들은 약한 GFP 식을 있습니다. C) MES 전지는 피더 레이어와 cultu에서 분리되었다EBS를 형성 낮은 첨부 요리에 빨강. 분화 과정의 첫 두 일 동안 세포 50 NG / ML의 소량, 20 NG / ML bFGF, 20 NG / ML FGF-8에 노출되었다. 그 후, 그들은 1 μm의 retinoic 산성, 5 일 동안 1 μm의 소닉 고슴도치 작용제의 처지와 차별화하는 유도했다. 차별화된 MES 전지는 강한 GFP의 형광을 표명했다. D) 7 일간 분화 후, EBS는 poly-DL-ornithine/laminin 코팅 접시에 dissociated 및 도금했다. 차별화된 세포는 문화의 2 일 후에 긴 신경 프로세스를 확장. 스케일 막대 = 200 μm의. 미네소타 = 모터 신경 세포. B, C와 D는 명시야 이미지이며, B &#39;, C&#39;와 D &#39;에 해당하는 형광 이미지입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> 그림 2. MES 셀 - 파생 모터 뉴런의 특성화. neurofilament 매체 체인 (NF-M, 빨강), 채팅 (적색), 그리고 섬-1 (빨간색)에 대한 Immunofluorescence 염색법은 GFP (녹색) expr과 일치했습니다ession. DAPI는 (파란색) 핵을 식별하는 데 사용되었다. 스케일 막대 = 50 μm의.

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</ol>

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MES 세포의 품질은 모터 뉴런의 효율적인 생성을위한 가장 중요한 매개 변수입니다. MES 전지는 자발적인 차별을 방지하기 위해 PMEF에서 재배되어야한다. 난생의 추가가 undifferentiated 상태에서 MES 세포를 유지하는 데 도움이됩니다. MES 세포마다 12-15 H를, 분열적으로 문화 매체가 급속히 고갈되고 매일 교체해야합니다. 쉬 경로의 효율적인 활성화 운동 신경 세포 사양을 유발하는 데 필요한 중요한 매개 변수입니다. 쉬 단백질 (R &amp; D 시스템)와 같은 HH의 작용제 HhAg1.3 (Curis 주식 회사), purmorphamine (Calbiochem) 및 처짐 (EMD 화학) 등의 쉬 신호 agonists는 모든 모터 뉴런 1-3의 형성을 촉진하는 데 사용되었습니다 , 10,11. 우리는 모터의 연결 표현형 다섯 방향으로 세포를 차별의 purmorphamine보다 더 효과적인 분자로 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF 매체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td></td><td></TD&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES 매체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell 기술 </td><td> 36,250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES 세포 - 공인 FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> Nucleosides </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 MM </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 난생 </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 신경 분화 매체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell 기술 </td><td> 36,250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES 컬트 FBS </td><td> StemCell 기술 </td><td> 06,905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 모노-thio의 글리세롤 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> 소량 </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 NG / ML </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 국방부 매체 (차별) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-컬트 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 마네 혈청 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> ITS 보충-B </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,155 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,157 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O의 0.15 % </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,159 </td><td> 5 μg / ML </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H3149 </td><td> D 2 20 μg / ML H 2 O </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 MM </td></tr><tr><td> Retinoic 산성 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> R-2625 </td><td> 1 μm의 </td></tr><tr><td> 처짐 </td><td> EMD 화학 </td><td> 566,660 </td><td> 1 μm의 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 국방부 매체 (모터 뉴런의 문화) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-컬트 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 마네 혈청 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> ITS 보충-B </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,155 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,157 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O의 0.15 % </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> StemC내말이 맞지 기술 </td><td> 07,159 </td><td> 5 μg / ML </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H3149 </td><td> D 2 20 μg / ML H 2 O </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 MM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr></tbody></table> NA = 비 적용됩니다. 표 1. MES의 세포 배양이나 차별에 대한 PMEF와 미디어. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;시약의 강력한&gt; 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 젤라틴 0.1 % </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 폴리-DL-ornithine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P0421 </td><td> D에 0.1 밀리그램 / ML 2 H 2 O </td></tr><tr><td> 마우스 laminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 μg / PBS에서 ML </td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = 비 적용됩니다. 표 2. 코팅 및 분리를위한 시약.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

기능성 모터 뉴런으로 배아 줄기 (ES) 세포의 직접 분화는 질병 메커니즘을 공부하는 신약 화합물을 선별, 그러한 척수 근육 위축증 (SMA)과 루게릭병 (같은 운동 신경 세포 질환에 대한 새로운 치료법을 개발 유망 자원을 나타냅니다 ALS). 많은 현재의 프로토콜은 모터 뉴런 1-4로 마우스 배아 줄기 (MES) 세포를 차별화하는 retinoic 산성 (RA)와 소닉 고슴도치 (쉬)의 조합을 사용합니다. 그러나, 모터 뉴런에 MES 세포의 분화 효율은 어느 정도 성공을 만났다있다. 우리는 크게 현재 설립 프로토콜에 비해 분화 효율을 향상시키는 두 단계의 분화 프로토콜 5 개발했습니다. 첫 번째 단계는 머리와 fibroblast의 성장 요인 (FGFs)를 추가하여 neuralization 과정을 강화하는 것입니다. 소량은 뼈 morphogenetic 단백질 (BMP) 길항제이며 신경 유도에 연루되어neurogenesis와 앞부분은 신경 patterning 6 형성의 결과의 기본 모델 ccording. FGF 신호는 사후 신경 정체성 7-9를 홍보하여 신경 조직 형성을 유도에서 소량으로 synergistically 역할을합니다. 이 단계에서는 MES 세포는 신경 lineages쪽으로 분화를 촉진하기 위해 이틀 동안 소량, bFGF, 그리고 FGF-8로 끝났다되었다. 두 번째 단계는 모터 신경 세포 명세를 유도하는 것입니다. 소량 / MES 세포를 노출 FGFs는 모터 신경 세포 생성을 촉진하기 위하여 앞으로 5 일 동안 RA와 쉬 작용제, Smoothened 작용제 (처짐)로 incubated했다. 모터 뉴런으로 혼란의 분화를 모니터링하기 위해, 우리는 모터 신경 세포 특정 발기인 Hb9 1의 제어하에 유전자 변형 마우스를 표현 eGFP에서 파생 ES 세포주를 사용했습니다. 이 강력한 프로토콜을 사용하여, 우리는 ± 분화 효율 0.8 %를 51 달성 (N = 3, P &lt;0.01, 학생의 T-테스트) 5. immunofluorescent의 결과염색법은 GFP + 세포가 운동 신경 세포 특정 마커, 섬-1과 acetyltransferase 콜린을 (채팅) 표현하는 것으로 나타났다. 우리 두 단계의 차별화 프로토콜은 척추 운동 뉴런으로 MES 세포를 차별화하기위한 효율적인 방법을 제공합니다.

우리는 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 시험 관내 분화의 효율을 개선하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 차별 ES 전지는 모터 뉴런이 같은 immunohistochemical 기술을 사용의 연결 및 모터 신경 세포 마커의 표현에 의해 입증 기능을 인수했습니다.

배아줄기세포(ES cells)를 기능적인 운동 뉴런으로 직접 분화시키는 것은 질병 메커니즘을 연구하고 스크리닝을 수행하는 데 있어 유망한 자원이 됩니다...

본 실험 절차의 전체적인 목적은 마우스 배아줄기세포를 운동 뉴런으로 분화시키는 것입니다. 먼저 마우스 배아줄기세포를 마우스 일차 배아 섬유아세포 상에서 배양하고, 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor)를 첨가합니다. 그 다음 noggin, bFGF 및 FGF8을 추가하여 신경화 과정을 촉진합니다. 이후 레티노산(retinoic acid) 및 smoothened agonist와 함께 배양하여 운동 뉴런 분화를 유도하며, 이어서 축삭 신장과 운동 뉴런 성숙 단계를 거칩니다.마지막으로, 면역형광현미경을 사용하여 강한 GFP 형광을 발현하는 분화된 MES 세포를 검사합니다. 다량의 운동 신경세포를 생성함으로써 기존의 프로토콜과 비교하여 운동 신경세포 질환 연구가 용이해졌습니다. 마우스 배아줄기세포를 운동 신경세포로 분화시키는 이 접근법은 더욱 효율적입니다. 이 방법은 척수성 근위축증에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.이는 근위축성 측색 경화증과 같은 다른 운동 신경세포 질환에도 적용될 수 있습니다. 일차 배아 생쥐 섬유아세포를 분주하려면, 100mm 조직 배양 접시 4개를 0.1% 젤라틴 용액 8mL로 코팅합니다. 실온에서 30분 후, 과잉 액체를 제거합니다. 이제 활성화된 PMEF 내의 mitomycin C 한 바이알을 PMEF 배지 40mL에 희석하여 4개의 접시에 분주하고 최대 일주일 동안 배양합니다.다음으로, 37°C 항온수조에서 MES 세포 1개 바이알을 해동합니다. 15mL 튜브에 담긴 5mL의 E ES 배지로 세포를 세척합니다. 800 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 흡입하여 제거하고, 신선한 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor)가 첨가된 ES 배지 20 milliliters에 MES 세포를 재부유합니다. PMEF 배양액에서 배지 10 milliliters를 제거한 후, 이를 HBG three ES 세포 현탁액 10 milliliters로 교체합니다. 플레이팅 후 24시간째의 작은 콜로니에서부터 72시간째에 직경 약 100 micrometers 크기의 콜로니가 될 때까지 MES 세포의 진행 과정을 관찰합니다.MES 세포 유도를 위한 세포 증식을 유지하기 위해 배지를 매일 교체합니다. 운동 뉴런으로의 분화 과정입니다. 마우스 배아 줄기세포를 먼저 PMEF 피더 세포로부터 분리한 후, 유도 당일에 부유 배양 환경에서 배양해야 합니다.100 mm ES 배양액 각각에 대해, 0.1% 젤라틴이 코팅된 T25 플라스크를 준비합니다. 상온에서 30분 후, 과잉 젤라틴을 제거하고 PBS로 3회 세척합니다. ES 배양액에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하되, 느슨하게 부착된 콜로니가 떨어지지 않도록 주의합니다. 그런 다음 10 mL PBS로 1회 세척합니다.이제 MES 세포를 PMEF로부터 분리하기 위해 0.25%trypsin EDTA 3mL를 첨가하고 3~5분 동안 배양합니다. 37°C에서 줄기세포와 PMEF가 플레이트에서 떨어져 나왔는지 확인합니다. 그런 다음 신선한 ES 배지 15mL를 첨가하고 피펫팅을 통해 콜로니를 분산시킵니다.세포 현탁액을 준비된 젤라틴 코팅 T one 50 플라스크로 옮기고, PFS가 젤라틴 처리된 표면에 부착될 수 있도록 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이제 부유하는 MES 세포를 50 mL 튜브에 수확하고 원심분리를 통해 펠릿화합니다. 세포를 10 mL의 신경 분화 배지에 재현탁합니다.헤모사이토미터를 사용하여 배지를 계수한 후, 분화 단계에서 100mm 현탁 배양 접시에 도말합니다. 1일 차에 현미경을 통해 MES 세포가 배아체라고 불리는 작은 부유 응집체를 형성했는지 확인합니다. 접시에 부착된 PMEF가 남아 있을 수 있으므로, ES 현탁 세포와 배지를 15mL 튜브로 옮긴 다음 500 RPM에서 3분 동안 원심 분리합니다.배아체(embryonic bodies)를 수확하려면 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 펠렛 형태의 EB에 10 milliliters의 신선한 신경 분화 배지를 첨가한 후, 세포를 새로운 박테리아 배양 접시에 분주하여 분화 상태로 24시간 동안 배양합니다. 2일째에 배양 접시를 흔들어 섞은 후 배지와 EB를 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. EB가 중력에 의해 가라앉을 때까지 기다린 다음, 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고 10 milliliters의 운동 뉴런 분화 배지로 EB를 재현탁합니다.분화 유도를 위해 새 세균 배양 접시에서 5일 동안 EBS를 배양합니다. 7일 차에 EBS의 직경이 약 150에서 200 µm인지 확인하고, 분화 시 강한 GFP 신호가 발현되는지 확인합니다. EBS를 해리하기 이틀 전인 5일 차에 24웰 플레이트 바닥에 12 mm 원형 커버슬립을 배치합니다.그 다음 100 µg/mL poly DL ornithine 0.5 mL를 추가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 조직 배양 후드 내에서 poly DL ornithine을 흡입하여 플레이트와 커버슬립을 공기 건조시킵니다. 플레이트 웰을 2회 증류수로 세 번 헹굽니다.커버슬립을 코팅하기 위해 공기 중에서 건조시킵니다. 차가운 1X PBS 5 mL에 2 µg/mL 농도의 마우스 laminin을 신선하게 희석합니다. 웰당 0.5 mL씩 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.분화 단계에서 PBS로 2회 세척합니다. 7일째에 EBS를 15 milliliter 튜브에 수집하고 중력에 의해 EBS가 가라앉도록 둡니다. PBS로 4회 세척한 후, ACU max 1 milliliter를 EBS에 첨가하여 부드럽게 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양한 다음, EBS를 덮고 있는 과량의 ACU max를 흡입하여 제거합니다.이제 3 mL의 MND 배지를 추가하고 1 mL 일회용 마이크로 파이펫을 사용하여 약 20회 파이펫팅하여 EBS를 해리한 다음, 상온에서 2분 동안 배양하고 세포 현탁액을 셀 스트레이너 캡을 통해 12 x 75 mm 튜브에 통과시킵니다. 필터에 걸러진 나머지 덩어리와 세포에 대해 이 해리 단계를 반복하여 최종적으로 6 mL의 단일 세포 현탁액 내 단일 세포 수득률을 높입니다. 단일 세포 현탁액을 부드럽게 섞고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정한 후, 세포를 완전 MND 배지로 희석하여 2 x 10⁵ cells/mL 밀도로 플레이팅합니다.poly DL ornithine laminin이 코팅된 커버슬립이 들어 있는 준비된 24웰 플레이트의 각 웰에 0.5 milliliters의 세포 현탁액을 넣습니다. 분화된 세포는 2일 후에 긴 신경돌기를 뻗습니다. 배양 시, HBG three는 운동 신경원 특이적 프로모터인 HB nine의 제어 하에 EGFP를 발현하는 형질전환 생쥐로부터 유래된 ES 세포주이며, 정해진 분화 프로토콜을 따릅니다.MES 세포는 운동 뉴런을 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 미분화된 MES 세포는 섬유아세포 피더 층 상단에 둥근 콜로니를 형성합니다. 이들은 약한 GFP 발현을 나타냅니다.이 MES 세포들을 피더 층에서 분리하여 저부착 디쉬에서 배양함으로써 배아체를 형성하였습니다. 분화된 MES 세포들은 7일 이후에 강한 GFP 형광을 발현하였습니다. 분화된 EBS를 해리하여 poly DL-ornithine laminin이 코팅된 플레이트에 플레이팅하였습니다.분화된 세포들은 배양 2일 후 플레이팅된 세포체로부터 긴 신경 돌기를 뻗으며, MES 세포 유래 운동 신경세포는 면역형광 염색을 통해 특징지어질 수 있습니다. 이러한 GFP 양성 세포들은 범-신경세포 마커인 neurofilament와 두 가지 운동 신경세포 특이적 마커인 Eyelid one 및 choline acetyl transferase를 발현합니다. DPI는 핵을 함께 염색합니다.본 2단계 분화 프로토콜은 MES 세포를 척수 운동 신경세포로 분화시키는 효율적인 방법을 제공합니다. 이 영상을 시청한 후에는 마우스 배아 줄기 세포를 운동 신경세포로 효율적으로 분화시키는 방법에 대해 이해하게 될 것입니다. 결론적으로, 고품질의 마우스 배아 줄기 세포를 확보하는 것이 운동 신경세포를 효율적으로 생성하기 위한 가장 중요한 파라미터임을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 작은 분자 기반 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)에 마우스 배아 줄기 세포의 차별 화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 차별화 후 30 일에 의해 고효율 Olig2 + NG2 + OPCs를 생성합니다. 우리는 또한 행동 잠재력을 불 수있다 "급상승"OPCs를 생성하는 방법을 설명합니다.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

이 동영상은 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 신경전구세포(NPC)를 체외에서 생성하는 방법을 보여줍니다. mESC는 현탁액에서 배양되어 배아체(EB)를 형성한 다음, 부착 배양에서 레티노산 처리를 통해 NPC로 분화하도록 유도됩니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 기술

이 비디오는 척수 신경 전구 세포(NPC)를 운동 뉴런으로 구별하는 방법을 보여줍니다. NPC가 성숙한 운동 뉴런으로 분화하는 것을 촉진하기 위해 특정 억제제가 풍부한 특수 배지를 사용하여 코팅된 배양 플레이트에서 NPC의 배양 과정을 자세히 설명합니다.

Spinal Cord Neural Progenitor Cells를 Motor Neuron으로 분화

이 비디오는 배아 줄기 세포를 기능하는 시냅스를 가진 뉴런의 네트워크 집단으로 분화하는 기술을 보여줍니다. 배아 줄기 세포가 뉴런으로 분화하고, 뉴런 네트워크 형성을 유도하고, 네트워크 뉴런으로 배양을 풍부하게 하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 배아 줄기세포를 네트워크화된 뉴런 집단으로 분화(Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population)

이 비디오는 인간의 iPSC를 운동 뉴런으로 분화하는 과정을 보여줍니다. 그 이유는 특정 전사 인자를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 iPSC를 활용하는 것입니다. 독시사이클린을 함유한 배지에서 배양하면 이 항생제는 전사 인자의 발현을 유발하여 운동 뉴런 전구체로의 iPSC 분화를 촉진합니다. 궁극적으로, 전구 세포는 성숙하고 기능적인 운동 뉴런을 생성하기 위해 뉴런 배지에서 배양됩니다.

공학적 인간 유도 만능 줄기세포를 기능적 운동 뉴런으로 분화시키기

이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포를 유도성 piggyBac 벡터에서 전사 인자의 발현에 의해 척추 또는 두개골 정체성을 가진 모터 뉴런으로 신속 하 고 효율적으로 전환 할 수 있습니다.

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

배우세요 마우스 배아 줄기 세포를 모터 뉴런으로 효율적으로 분화하는 새로운 프로토콜을. 면역형광 현미경으로 특이적 마커 발현을 확인하고, 척수성 근위축증과 같은 모터 뉴런 질환 연구에 활용하세요.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

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