모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 배아 줄기 세포를 운동 뉴런으로 분화시키는 것입니다. 첫 번째 배양 마우스, 1차 마우스 배아 섬유아세포의 배아 줄기 세포, 백혈병 억제 인자를 보충합니다. 그런 다음 noggin, BFG F 및 FGF eight를 추가하여 정규화 과정을 강화하고 레티노산과 평활화 작용제로 배양하여 운동 뉴런 사양을 유도한 후 축삭 신장 및 운동 뉴런 성숙

마지막으로, 면역형광 현미경을 사용하여 강력한 GFP 형광을 발현하는 분화된 MES 세포를 검사합니다.많은 양의 운동 뉴런을 생성함으로써 현재의 기존 프로토콜과 비교하여 운동 뉴런 질환에 대한 연구를 촉진했습니다. 쥐 배아 줄기 세포를 운동 뉴런으로 분화시키는 이 접근 방식이 더 효율적입니다. 이 방법은 척수성 근위축증에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

그것은 또한 근위축성 측삭 경화증과 같은 다른 운동 신경 질병에 적용될 수 있습니다, 1 차적인 배아 쥐 섬유아세포를 도금하기 위하여, 0.1%gelatin 해결책의 8 밀리리터를 가진 100개의 밀리미터 조직 문화 접시를 입히십시오. 실온에서 30분 후 여분의 액체를 버리십시오. 이제 활성화된 PMEF의 미토마이신 C 1바이알을 4개의 플레이트에 40ml의 PMEF 미디어 플레이트에 희석하고 최대 1주일 동안 배양합니다.

다음으로, MES 셀 한 바이알을 37도 수조에서 해동합니다. 15ml 튜브에 5ml의 E ES 배지로 세포를 세척합니다. 800RPM에서 5분 동안 원심분리 후.

상층액을 흡인하고 새로 추가된 백혈병 억제 인자로 20ml의 ES 배지에서 MES 세포를 재현탁합니다. PMEF 배양액에서 10mL 배지를 제거하고 10mL의 HBG 3 ES 세포 현탁액으로 교체합니다. 도금 후 24시간의 작은 콜로니에서 직경 약 100마이크로미터의 콜로니(72시간)로 시간이 지남에 따라 MES 세포의 진행을 모니터링합니다.

MES 세포 유도를 위한 세포의 증식을 유지하기 위해 배지를 매일 교체하십시오. 운동 뉴런으로의 분화. 마우스 배아 줄기 세포는 먼저 PMEF 공급 세포에서 분리된 다음 유도 당일 현탁 환경에서 배양해야 합니다.

각 100mm ES 배양에 대해 0.1% 젤라틴으로 코팅된 T one 50 플라스크를 준비하고 실온에서 30분 후 여분의 젤라틴을 제거하고 PBS로 3회 세척합니다. ES 문화에서 미디어를 계속 조심스럽게 흡인하여 느슨하게 부착된 식민지를 제거하지 않도록 합니다. 그런 다음 10 밀리리터 PBS로 한 번 씻으십시오.

이제 PMEF에서 MES 세포를 분리하기 위해 0.25%트립신 EDTA 3ml를 첨가하고 3-5분 동안 배양합니다. 섭씨 37도에서 줄기세포와 PMEF가 플레이트에서 분리되었는지 확인합니다. 그런 다음 15ml의 새로운 ES 배지를 추가하고 피펫팅으로 콜로니를 교란합니다.

세포 현탁액을 준비된 젤라틴으로 코팅된 T 1개 50개 플라스크로 옮기고, PFS가 젤라틴화된 표면에 부착될 수 있도록 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 이제 50ml 튜브에서 부유 MES 세포를 채취하고 중핵화로 펠릿화합니다. 10ml의 신경 분화로 세포를 재현탁합니다.

혈구분석기를 사용하여 매체를 열거한 다음 분화를 위해 100mm 현탁액 배양 접시에 플레이트합니다. 첫째 날, MES 세포가 배아체(embryonic bodies)라고 하는 작은 부유 응집체를 형성했는지 현미경으로 확인합니다. 접시에 부착된 모든 캐리오버 PMEF가 있으면 ES 현탁 셀과 배지를 15ml 튜브로 옮긴 다음 500RPM에서 3분 동안 원심분리합니다.

배아체를 채취하기 위해 배지를 흡인하고, 10ml의 새로운 신경 분화를 조심스럽게 추가하고, 펠릿화된 ebs에 배지를 추가한 다음, 분화 시 24시간 동안 새로운 박테리아 접시 배양에서 세포를 플레이트화합니다. 둘째 날, 배양 접시를 휘젓고 배지와 EBS를 15ml 튜브로 옮깁니다. EBS가 중력에 의해 안정되도록한 다음 조심스럽게 매질을 흡인하고 EBS와 10 밀리리터의 운동 뉴런 분화를 중단시킵니다.

분화에 5일 동안 새로운 박테리아 접시에 있는 배지 배양 EBS. 7일차에는 EBS의 직경이 약 150 - 200마이크로미터인지 확인하고 분화 시 강력한 GFP 신호를 발현합니다. 5일차, EBS를 해리하기 이틀 전에 24웰 플레이트의 바닥에 12mm 원형 커버 슬립을 놓습니다.

그런 다음 밀리리터당 100마이크로그램 0.5밀리리터, 폴리 DL 오르니틴을 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 폴리 DL 오르니틴 공기 건조 플레이트를 흡입하고 조직 배양 후드에서 슬립을 덮습니다. 이중 증류수로 플레이트 웰을 세 번 헹굽니다.

커버가 미끄러질 수 있도록 공기 중에서 건조시키십시오. 5밀리리터의 차가운 XPBS에 1밀리리터의 마우스 라미닌 1마이크로그램을 새로 희석합니다. 웰당 0.5ml를 추가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

차별화를 위해 PBS로 두 번 세척합니다. 일곱째 날, EBS를 15ml 튜브에 모으고 EBS가 중력에 의해 정착하도록 합니다. PBS로 4회 세척한 후 EBS에 ACU max 1ml를 넣고 부드럽게 섞어 실온에서 5분 동안 배양한 다음 ebs를 덮고 있는 여분의 ACU max를 흡입합니다.

이제 3ml의 MND 배지를 추가하고 1ml einor 마이크로 피펫을 사용하여 약 20회 피펫팅하여 EBS를 해리한 다음 실온에서 2분 동안 배양한 다음 세포 트레이너 캡을 통해 세포 현탁액을 12 x 75mm 튜브에 통과시킵니다. 필터에 의해 유지되는 나머지 덩어리와 세포에 대해 이 해리 단계를 반복하여 6ml의 최종 단일 세포 현탁액에서 단일 세포의 수율을 농축합니다. 단일 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 혈구 분석기를 사용하여 세포를 계수하고, 세포를 2배의 밀도로 10배의 밀도로 완전한 MND 배지로 희석하여 10배에서 밀리리터 플레이트당 5번째 세포로 만듭니다.

폴리, DL 오르니틴 라미닌 코팅, 커버 슬립을 포함하는 준비된 24웰 플레이트의 웰당 0.5밀리리터 세포 현탁액. 분화된 세포는 이틀 후에 긴 신경돌기를 확장합니다. 배양에서 HBG three는 정의된 분화 프로토콜을 가진 운동 뉴런 특이적 프로모터 HB nine의 제어 하에 EGFP를 발현하는 형질전환 마우스에서 유래한 ES 세포주입니다.

MES 세포는 운동 뉴런을 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 미분화된 MES 세포는 섬유아세포 공급층(fiberblast feeder layer)의 상부에 둥근 군체를 형성합니다. GFP 발현이 약합니다.

이러한 MES 세포는 공급층에서 분리되어 부착성이 낮은 접시에서 배양하여 배아체를 형성했습니다. 분화된 MES 세포는 7일째 이후에 강한 GFP 형광을 발현했습니다. 분화 EBS는 poly DL ornithine laminin 코팅 플레이트에 해리 및 도금되었습니다.

분화된 세포는 배양 2일 후 도금된 세포의 세포체에서 긴 신경돌기를 확장하며, MES 세포 유래 운동 뉴런은 면역형광 염색으로 특성화될 수 있습니다. 이러한 GFP 양성 세포는 범 뉴런 마커인 뉴로필라멘트와 두 개의 운동 뉴런 특이적 마커를 발현합니다. 눈꺼풀 하나와 콜린 아세틸 전이효소 DPI는 함께 취한 핵을 염색합니다.

당사의 2단계 분화 프로토콜은 MES 세포를 척추 운동 뉴런으로 분화하는 효율적인 방법을 제공합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 배아 줄기 세포를 운동 뉴런으로 효율적으로 분화하는 방법을 이해하게 될 것입니다. 결론적으로, 마우스 배아 줄기 세포의 높은 품질은 운동 뉴런을 효율적으로 생성하기 위한 가장 중요한 매개변수임을 기억하십시오.