대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

이 절차의 전반적인 목표는 변형된 배아체에서 단층 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 유사분열 후 중간뉴런 전구체에서 피질 중간뉴런 전구세포를 생성하는 것입니다. 이 방법은 피질 중간뉴런의 하위 유형이 발달 중에 개별 운명을 달성하는 방법과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 파브알부민 또는 소마토스타틴 중간뉴런 하위 그룹을 농축하는 방법뿐만 아니라 Nkx2.1 발현 중간뉴런 전구세포를 효율적으로 생성할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 MEF 배지의 유사분열 비활성 MEF 공급 세포를 조직 배양 처리된 플레이트에 플레이트화합니다. mESC를 도금하기 전에 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에 정착할 때까지 최소 12시간을 허용합니다. 즉시 사용하지 않는 경우 3일마다 MEF 미디어를 교체합니다.

다음으로, 마우스 백혈병 억제 인자를 포함하는 mESC를 MEF 플레이트에 추가합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다. 접시가 70-80% confluent가 되면 trypsin-EDTA를 사용하여 mESC를 계대측정하고, 다능성을 유지하기 위해 mESC 배지의 MEF 피더 층에서 mESC를 유지합니다.

분화를 시작하기 전에 MEF가 없는 젤라틴 코팅 플레이트에 세포를 한 번 이상 통과시켜 희석합니다. 이를 위해 조직 배양 처리된 접시에 칼슘과 마그네슘이 함유된 0.1%젤라틴과 PBS를 첨가하여 젤라틴 코팅 플레이트를 준비하고 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 1.5-2 배 10 각 10cm 플레이트의 6 번째 세포를 플레이트하고 분화를 시작하기 전에 2 일 동안 팽창하도록합니다.

DD0에서 mESC가 젤라틴 코팅 플레이트에서 2일 동안 자란 후 배지를 흡인하고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 플레이트 표면을 덮을 만큼 충분한 트립신-EDTA를 추가합니다. 그리고 세포를 다시 섭씨 37도의 인큐베이터에 4분 동안 넣습니다.

4분 후, mESC 배지 부피의 2배를 사용하여 트립신-EDTA를 소멸시킵니다. 세포를 적절한 크기의 원심분리 튜브로 옮기고 200배 g으로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 다음으로, 튜브를 제거하고 펠릿을 방해하지 않고 매체를 흡인합니다.

펠릿을 KSR-N2 배지 1밀리리터에 재현탁합니다. 그런 다음 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정합니다. 비부착성 조직 배양 접시에 KSR-N2 배지에 밀리리터당 75, 000개의 세포를 추가하여 세포를 배아체로 성장시키기 시작합니다.

그리고 섭씨 37도에서 배양하십시오. DD1에서 조직 배양 처리된 접시를 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 또는 하룻밤 동안 폴리-L-라이신으로 코팅하여 세포 착륙을 준비합니다. DD2에서 폴리-L-라이신을 흡인하고 섭씨 37도에서 밤새 플레이트에 라미닌을 코팅합니다.

DD3에서 EB 해리를 시작하기 전에 라미닌을 흡입하고 조직 배양 후드에서 플레이트가 완전히 건조되도록 합니다. 그 후, 매체와 함께 EB를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 15 회 g에서 3-4 분 동안 또는 EB가 펠릿 화 될 때까지 원심 분리하십시오. 배지를 흡입하고 DNase가 포함된 세포 분리 용액 3ml를 추가합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. EB 해리를 돕기 위해 3분마다 튜브를 부드럽게 튕깁니다. EB가 더 이상 보이지 않거나 15분이 경과하면 DNase가 포함된 KSR-N2 6ml를 넣고 200배 g에서 5분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 LDN193189, XAV939 및 ROCK 억제제 Y27632를 포함하는 KSR-N2의 세포를 제곱센티미터당 4.5에서 10의 4배로 플레이트합니다. DD5에서 FGF2, IGF1 및 SSH를 포함하는 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. 다음으로, DD1 및 DD2에 대한 절차에 설명된 지침에 따라 8일째에 재생할 조직 배양 플레이트를 준비합니다.

DD7에서 FGF2, IGF1 및 SHH를 포함하는 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. DD8에서 섭씨 37도에서 5분 동안 트립신-EDTA로 플레이트에서 세포를 분리하여 세포를 다시 플레이팅합니다. KSR-N2로 부피의 2배를 사용하여 트립신-EDTA를 담금질합니다.

그리고 200 곱 g에서 5 분 동안 원심 분리기. 40미크론 필터 튜브를 통해 세포를 필터링하여 덩어리를 제거합니다. 다음, 250, SHH를 가진 FGF2, IGF1 및 Y27632를 포함하는 N2-KSR에서 제곱된 센티미터 당 000의 세포에 세포를 replated.

DD10에서 SHH가 포함된 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 세포를 한 번 세척하고 DNase를 함유한 예열된 비트립신 함유 세포 해리 시약을 세포에 첨가합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에 10-30분 동안 또는 세포가 분리될 때까지 놓습니다.

그런 다음 해리를 돕기 위해 5분마다 플레이트를 부드럽게 두드립니다. DD5에서 FGF2 및 IGF1을 포함하는 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. 다음으로, DD8에 다시 도금하기 위해 조직 배양 플레이트를 준비합니다.

DD7에서 FGF2 및 IGF1이 포함된 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. DD8에서 세포를 평활화된 작용제로 재플레이팅하고 비정형 PKC 억제제를 추가합니다. DD10에서 aPKCi가 포함된 KSR-N2로 미디어를 변경합니다.

DD11에서 FACS용 플레이트에서 셀을 분리합니다. DD11에서 FACS를 위해 셀이 분리되지 않은 경우 aPKCi가 포함된 KSR-N2를 사용하여 DD12에서 미디어를 변경합니다. DD14에서 aPKCi가 포함된 KSR-N2로 미디어를 변경합니다.

그리고 DD16에서 aPKCi가 포함된 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. 그런 다음 DD17에서 Nkx-2.1:mCherry 양성 세포를 수집합니다. 다음은 분화 12일차 배양에서 Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry 및 Lhx6:GFP에 대한 면역염색의 대표적인 이미지입니다.

이러한 이미지는 동일한 시야에서 겹치는 채널입니다. 이 그래프는 배양 중 DD12에서 Nkx2.1을 발현하는 DAPI 양성 핵의 평균 백분율을 정량화한 것입니다. 그리고 이것은 대표적인 FACS 플롯으로, 이중 리포터 mESC 라인을 사용하여 분리할 수 있는 4개의 서로 다른 세포 집단을 보여줍니다.

mCherry는 x축에 있고 GFP는 y축에 있습니다. 따라서 오른쪽 상단 상자는 mCherry-GFP 이중 양성 셀을 나타냅니다. 다음은 Nkx2.1:mCherry 및 Lhx6:GFP가 DD6에서 16으로 유도되는 시간 경과로, mCherry 단독 발현, GFP 단독 발현 또는 mCherry-GFP 동시 발현인 배양 내 세포의 비율로 표시됩니다.

이 프로토콜은 일단 마스터하면 제대로 수행되면 처음부터 끝까지 17일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 흉막화능, 미분화, 건강해 보이는 줄기세포부터 시작해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 신생아 또는 성인 마우스 신피질에 이식하는 것과 같은 다른 방법을 수행하여 인터뉴런 운명 결정 또는 인터뉴런 이식이 회로 기능 및 동물 행동에 미치는 영향에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후, 이 기술은 발달 신경과학 분야의 연구자들이 생쥐, 더 나아가 인터뉴런 관련 장애의 영향을 받는 환자에서 인터뉴런 운명 결정을 주도하는 요인을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 배아 줄기 세포에서 Nkx2.1 발현 전구 세포와 유사 분열 후 자손을 유도하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.