Name: 대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 마우스 배아 줄기 세포에서 수정된 배아체-단층 배양법을 이용해 대뇌 피질 인터뉴런 선구자를 효율적으로 분화시키는 방법을. Nkx2.1 발현 세포 생성 및 신경 발달 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는이 프로토콜을 개발 하는 데 도움에 그들의 초기 작업에 대 한 Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP 듀얼 기자 mESC 라인으로 제니퍼 타이슨, Asif Maroof 및 팀 페트 로스를 개발 하기 위한 청나라 Xu에 감사. 우리는 또한 빨리 흐름 cytometry 핵심을 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 MH066912 (SA)와 F30 MH105045-02 (DT)에 의해 지원 되었다.

참고:이 프로토콜에서 설명 하는 듀얼 기자 mESC 라인은 요청 (sande@mail.med.upenn.edu).
1. 미디어 준비
참고: 모든 미디어 세포 배양에 사용 하기 전에 37 ° C를 따뜻하게.
<ol><li>
마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 미디어 (500 mL를 준비)
	<ol>
<li>Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 및 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터 449 ml 50 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 추가 합니다.</li>
		<li>여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 달 또는 약 수 ≤에 저장소에 대 한 4 ° C에서 미디어를 저장-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
N2 미디어 (500 mL를 준비)
	<ol>
<li>5 mL L-알라닌-L-글루타민 추가 (100 x) 및 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 489.5 ml DMEM: 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12), 그리고 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터.</li>
		<li>여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)와 5 mL n 2 보충-B를 추가 합니다. 최대 1 달 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 미디어를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈 청 무료 성장 매체 (KSR) (500 mL를 준비)
	<ol>
<li>추가 75 mL 혈 청 무료 중간 보충, 5 mL L-글루타민 (100 배), 5 mL MEM 비 필수 아미노산 (MEM-NEAA) (100 x), 그리고 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 413.5 mL 비-글루타민을 포함 된 DMEM, 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터링.</li>
		<li>여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 개월 4 ° C에서 미디어를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 배아 줄기 세포 미디어 (500 mL를 준비)
	<ol>
<li>75 mL 줄기 세포 학년 FBS, 5 mL MEM NEAA 추가 (100 배) 5 mL L-글루타민 (100 x), 그리고 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 413.5 mL 비-글루타민을 포함 된 DMEM, 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터링.</li>
		<li>여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 달 또는 약 수 ≤에 저장소에 대 한 어둠 속에서 4 ° C에서 미디어를 저장-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 경작 mESCs
<ol><li>플레이트 mitotically 비활성 MEF 피더 세포 조직 문화에 MEF 미디어에 3-4 x 104 셀/cm2접시를 취급. 적어도 12 h는 mESCs를 도금 하기 전에 ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 정착 하도록 허용 합니다. 즉시 사용 하지, MEF 미디어 3 일 마다 교체 합니다. 도금의 7 일 이내 사용 하지 않을 경우 MEFs의 처분.</li>
	<li>마우스 백혈병 금지 요인 (mLIF) (1000 U/mL)를 포함 하는 mESC 미디어에서 MEF 번호판 mESCs (밀도 범위 1-4 x 104 셀/cm2)를 추가 합니다. ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>트립 신-EDTA (0.05 %trypsin)를 사용 하 여 mESCs 통로 (1:5-1:10)는 요리 되 ~ 70-80% 합칠 또는 식민지 터치 하기 시작 하는 경우. 이 일반적으로 2 일 마다 발생 하지만 초기 도금 밀도 따라 4 ~ 5 일이 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>Pluripotency를 유지 mESC 매체에서 MEF 급지대 레이어에 mESCs을 유지 관리 합니다.</li>
	<li>
차별화를 시작 하기 전에 적어도 한 번 MEFs MEFs 밖으로 희석 없이 젤라틴 코팅 접시에 셀 통로.
	<ol>
<li>캘리포니아2 +/Mg2 + 취급 하는 조직 문화 접시에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 젤라틴 0.1% 추가 하 여 젤라틴 코팅 접시를 준비 하 고 적어도 1 헤 x 106 세포/10 c m 플레이트 플레이트 1.5-2에 대 한 37 ° C에서 떠나 (2.7-3.6 10 x4 셀/cm2) 차별화를 시작 하기 전에 2 일에 대 한 확장을 세포 허용.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 차별화 MGE 같은 Telencephalic 창시자 향해 mESCs
<ol><li>
차별화 일 (DD) 0 = "셀 플 로트"
	<ol>
<li>mESCs 성장 후 젤라틴 코팅 판 2 일에 대 한 미디어를 발음 하 고 한번 없이 캘리포니아2 +/Mg2 +PBS 가진 세포를 씻어. 충분 한 트립 신-EDTA (0.05 %trypsin) 4 분 ≥95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 배양 기에 다시 셀을 (일반적으로 4 mL 트립 신-EDTA 한 10cm 조직 문화 접시), 판의 표면을 커버를 추가 합니다.</li>
		<li>4 분 후 트립 신-EDTA mESC 미디어 2 배 볼륨을 사용 하 여 끄다. 적절 한 크기의 원심 분리기 튜브에 세포를 전송 하 고 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심. 5 분 후 튜브를 제거 하 고 미디어는 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 1 ml KSR:N2 미디어 (1:1) 펠 릿 포함 된 BMP 억제제 LDN-193189 resuspend (250 nM) 및 Wnt 억제제 XAV-939 (10 µ M).</li>
		<li>Hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 농도 측정 합니다. LDN-193189를 포함 하는 KSR:N2 미디어 (1:1)에 75, 000 셀/mL을 추가 하 여 셀 embryoid 몸 (EBs)으로 성장 하는 시작 (250 nM) 및 XAV-939 (10 µ M) 비 점착 조직 문화 요리에서. ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD1에 셀에 대 한 "방문" 폴 리-L-리 신 (10 µ g/mL PBS에 캘리포니아2 +/Mg2 +) 코팅 처리 하는 조직 문화 요리에 의해 하룻밤 (O/N) ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에 또는 적어도 1 시간에 대 한 준비.</li>
	<li>DD2, 폴 리-L-리 신을 발음 하 고 laminin (10 µ g/mL PBS에 캘리포니아2 +/Mg2 +)와 플레이트 코트 O/N ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에서. 참고: O/N은 최적의 조금은 2 h 수 있습니다 충분. 다음 날 접시 사용 되지 않는, laminin를 발음 하 고 없이 Ca2 +/Mg2 +, PBS 바꿉니다 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장.</li>
	<li>
DD3 ("토지는 세포")
	<ol>
<li>EB 분리를 시작 하기 전에 laminin 발음 하 고 하 판 조직 문화 후드에 완전히 건조. 나타나는 반짝 또는 가시 젖은 접시를 사용 하지 마십시오. 15 mL 튜브 15 g x 또는 EBs는 수송과 때까지 3-4 분 동안 원심 분리기로 미디어와 EBs를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미디어를 발음 하 고 DNase를 포함 하는 세포 분리 솔루션의 3 개 mL를 추가 (2 U/mL) ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에서 품 어와 15 분의 5% CO2 는 부드럽게 EB 분리에 도움 관 모든 3 분 영화.</li>
	<li>EBs는 더 이상 표시 하거나 15 분 경과, 추가 6 mL KSR:N2 (1:1) 포함 하는 DNase (1 U/mL) 및 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>KSR:N2 (1:1) LDN-193189를 포함 하는 셀을 접시 (250 nM), XAV-939 (10 µ M), 그리고 바위 억제제 Y-27632 (10 µ M) 4.5-5 x 104 셀/c m2에.</li>
</ol>4. SST 풍요롭게 프로토콜: "DD12 GFP 높은 소닉 고슴도치 (쉬)" (단계 3.7에서에서 계속)
<ol><li>DD5, 변경 FGF-2를 포함 하는 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), ssh (50 ng/mL).</li>
	<li>다시 하루 8 (단계 4.4)에 도금을 위한 조직 배양 배지 준비 단계 3.2 3.3에에서 설명 된 지침을 사용 하 여.</li>
	<li>DD7, 변경 FGF-2를 포함 하는 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), 그리고 쉬이 잇 (50 ng/mL).</li>
	<li>
DD8에 다시 셀 접시. 참고:이 단계는 필수, 다시 도금 셀 줄일 수 있습니다, 원치 않는 초기 분화 세포 유형. 다시 도금 다운스트림 immunohistochemical 분석을 어렵게 하는 셀의 공을 휴식 그리고 나중 시간 포인트에서 FACS의 효율을 증가.<ol>
<li>다시 셀을 접시, ≥95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 5 분에 대 한 트립 신-EDTA (0.05 %trypsin)와 플레이트에서 세포를 분리. 트립 신-EDTA와 KSR:N2, 2 배 볼륨을 사용 하 여 담금질 및 5 분에 대 한 200 x g에서 원심 분리기 필터 어떤 덩어리를 제거 하려면 40 µ m 필터 튜브를 통해 셀. FGF-2 포함 된 N2/로켓 (1:1)에서 250, 000 셀/c m2 에서 셀을 다시 접시 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), 및 Y-27632 (10 µ M) 쉬와 (50 ng/mL). 참고: 다시 DD8 셀 접시 않기로 결정 했다 대신, 쉬를 포함 하는 KSR:N2와 미디어 변경 (50 ng/mL) DD7에서 DD12 2 일 마다 계속 IGF-1을 추가 하 고 (20 ng/mL)와 FGF-2 (10 ng/mL) DD9까지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD10에 쉬를 포함 하는 KSR:N2와 미디어 변경 (50 ng/mL).</li>
	<li>
에 DD12, SST 하위 유형에 대 한 풍성 하 게 하는 셀을 얻기 위해을 사용 하 여 FACS Lhx6::GFP-만 셀을 표현.
	<ol>
<li>세포를 분리, 트립 신-EDTA 보다는 비 트립 신 포함 휴대-분리 시 약을 사용 합니다. 한 번 없이 Ca2 +/Mg2 +PBS 가진 세포를 씻어. 미리 데워 진된 비 트립 신 포함 하 셀 분리 시 약 DNase를 포함 추가 (2 U/mL)는 세포에. 10-30 분 또는 세포가 분리 될 때까지 ≥95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 배치 합니다. 부드럽게 분리를 돕기 위해 접시 마다 5 분을 누릅니다. 참고: DD11-12 문화에 대 한 10-15 분만 필요할 수 있습니다. DD15-16 문화에 대 일 분 이상 완전 한 분리에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>일단 세포는 접시에서 완전히 해제 됩니다, FACS 절연 표준 프로토콜을 사용 하 여 진행 하거나 다른 다운스트림 분석 셀을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PV 풍요롭게 프로토콜: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (단계 3.7에서에서 계속)
<ol><li>DD5, KSR:N2 (1:1) FGF-2를 포함 하는 미디어 변경 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>DD8에 다시 도금 조직 문화 접시 준비 3.2 3.3 단계 (단계 4.4)에 설명 된 지침을 사용 하 여.</li>
	<li>DD7, 변경 포함 된 FGF-2 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>DD8에 다시 접시 셀 다음 예외 4.4 단계에서 설명한 대로: 다시 셀 도금, 쉬 흐려져 주 작동 근으로 대체 (SAG; 30 nM) 비정형 PKC 억제제 (aPKCi; 2 µ M)를 추가 하 고. 합쳐, 다시 도금 미디어는 지금 N2/로켓 (1:1) 포함 된 FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µ M), 처 짐 (30 nM), 및 aPKCi (2 µ M).</li>
	<li>DD10에 KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경.</li>
	<li>
DD11 참고:이 시점에서, Nkx2.1::mCherry+ 세포는 풍부 하 게 될 태양광 발전 CIns.<ol>
<li>FACS 단계 4.6에서에서 설명 하는 동일한 프로토콜을 사용 하 여에 대 한 접시에서 세포를 분리 합니다. 나중 차별화 하루에 Nkx2.1::mCherry+ 세포를 수집 결정 경우이 단계를 무시 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>에 DD12, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. 에 DD14, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. 에 DD16, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. DD17에서 Nkx2.1::mCherry+ 셀 단계 4.6에서에서 설명 하는 동일한 프로토콜을 사용 하 여 수집 합니다.</li>
</ol>6. 태양광 발전 풍부 프로토콜: "DD17 mCherry 낮은 쉬" (단계 3.7에서에서 계속)
<ol><li>DD5, KSR:N2 (1:1) FGF-2를 포함 하는 미디어 변경 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL). DD7, 변경 포함 된 FGF-2 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>
DD9, KSR:N2 (1:1)와 함께 미디어 변경 합니다. 이 시점에서 앞으로, 아니 추가 성장 요인이 필요 하다.
	<ol>
<li>계속 미디어 DD17에 셀 수확까지 2 일 마다 변경.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 메서드는 J1 파생 된 mESCs (SCRC-1010) 패턴에 매우 효과적인, 우리 다른 mESC 라인과 클론 분리 변수 성공을 경험 했다. 예를 들어, Foxg1::venus mESCs (EB3 파생; Danjo 외. 이 프로토콜을 Foxg1 DD12에 의해 유도 제대로 13) 응답은 일반적으로 1-2%의 순서. 이유로 우리가 완전히 이해 하지 않는 또 다른 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 클론 (나 JQ59) (JQ27 불리)이이 프로토콜에서 설명 하는 라인으로 동시에 고립 되었던 생산 1% 미만 Nkx2.1 표현 세포 성장 하는 때 동일한 조건. 상위 라인 (J1; 그러나 ATCC SCRC-1010),,이 프로토콜에 잘 응답 하 고 그림 1B에서 표시 된 것과 유사한 DD12에 Nkx2.1 표현 세포의 백분율을 생성. 필요한 경우 XAV 939와 쉬/SAG의 농도 줄 단위로 분화 조건...

두 생쥐와 인간에 대략 절반 모든 대뇌 피 질의 억제 수 (CIns)의 발생 과도 subcortical 구조 중간 절 예 하 (MGE) 어디 라고 내 CIns 및 다른 신경 그리고 glial의 neuroepithelial 창시자 하위 그룹 표현 녹음 방송 요인 Nkx2.11,2. CIn 하위 그룹 또는 하위 형태학, neurochemical electrophysiological, 교차 및 연결 특성3,4로 정의 됩니다. MGE 파생 된 CIns로 그룹화 할 수 있습니다 대부분 비중첩 하위 PV 또는 SST, 특정 electrophysiological 및 연결 추세5와 어떤 관계가 식의 그들의 식에 따라. 부전 수, PV 비율에서 특히 그들의 여러 정신병 무질서 및 질병6,7에 연루 되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 줄기 세포 유래 mitotic 창시자 및 대뇌 피 질의 interneuron 생물학 연구 및 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 태양광 또는 SST CIn 운명에 대 한 농축 철새 선구자입니다.
Interneuron 창시자 표현 하는 Nkx2.1 및 mESCs에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장 가능한, 매우 능률적인 방법을 개발 했습니다. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP을 사용 하 여 듀얼 기자 mESC 선8, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손은 FACS를 통해 격리 되 고 이후 다운스트림 응용 프로그램의 수에 사용 될 수 있습니다. 다양 한 신호 경로, 문화, 그리고 성체의 모드를 조작 하 여 우리 붙일 레이블된 interneuron 선구자 다운스트림 응용 프로그램의 호스트에 대 한 적합의 수백만 얻을 수 있습니다.
MESCs9,10,11,12,13,14, 의존 하는 Wnt 우리의 방법에서에서 MGE 같은 창시자를 생성 하기 위한 여러 가지 다른 방법 존재 길 항 근 XAV-939, Foxg1/Nkx2.1 공동 telencephalic 창시자 표현 생성에 특히 효율적입니다. 또한, interneuron 창시자 또는 우리의 듀얼 기자 시스템을 통해 그들의 포스트 mitotic Lhx6 표현 자손에 대 한 선택 수는 크게 고유 창시자 그리고 그들의 자손을 생성 하는 능력을 향상 시킵니다.

<table><tbody><tr><td>보틀탑 진공 필터 시스템</td>: 세포 여과기가 있는 <td>Corning</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>시험관, 스냅 캡</td>, <td>ThermoFisher</td>, <td>Corning 352235</td><td></td></tr><tr><td>마우스 배아 섬유아세포(CF-1, MEF, IRR, 7M),</td> <td>MTI-Globalstem</td>, <td>GSC-6101G</td>, <td>7M MEF의 1개 바이알은 4개의 10cm TC 플레이트에 충분합니다. 참조: 29,35</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>Ant-pm-2</td><td>항균제라고도 합니다. 기본 매체로 여과하지 말고 여과 후 추가하십시오. 참조: 9,11,36,37</td></tr><tr><td>N2 supplement-B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7156</td><td>기본 미디어로 필터링하지 않음 -- 추가 여과 후</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>L-알라닌-L-글루타민으로도 알려져 있습니다. 참조: 9,11,38,39</td></tr><tr><td>KnockOut 혈청 대체(KSR)</td><td>ThermoFisher</td><td>10828028</td><td>무혈청 매체 보충제라고도 합니다. 참조: 9,11</td></tr><tr><td>L-glutamine (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td>DMEM을 함유한 비글루타민이라고도 합니다. 참조: 9,11</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>VWR</td><td>82013-578</td><td>줄기세포 등급 FBS라고도 합니다. 참조: 9,11</td></tr><tr><td>Tissue culture treated dish (10cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Non-adherent sterile petri dish (10cm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia inhibitory factor (mLIF)</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>얼리지 말고 4'C에서 보관하십시오. 참조: 9,11</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 젤라틴 용액</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-999-027</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>시그마</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>비트립신 함유 세포 해리 시약이라고도 합니다. 참조: 9,11</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>DMSO에서 재현탁 및 일회용 부분 표본에서 -80'C에 보관</td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Stemgent</td><td>04-0046</td><td>DMSO에서 재현탁 및 일회용 부분 표본에서 -80'C에 보관</td></tr><tr><td>rhFGF-2</td><td>R& 시리즈 D Systems</td><td>233-FB</td><td>0.1% BSA로 PBS에 재현탁하고 일회용 분취액</td></tr><tr><td>rhIGF-2</td><td>R&에서 -80'C에 보관; D Systems</td><td>291-G1</td><td>0.1% BSA로 PBS에 재현탁하고 일회용 분취액에서 -80'C에 보관</td></tr><tr><td>ROCK 억제제(Y-27632)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>DMSO에 재현탁하고 일회용 분취량에서 -80'C에 보관</td></tr> 평<tr><td>활화 작용제(SAG)</td><td>Millipore</td><td>566660-1MG</td><td>H20에 재현탁하고 일회용 분취액에서 -80'C에 보관</td></tr><tr><td>rm Sonic Hedgehog/SHH</td><td>R& D Systems</td><td>464-SH-025</td><td>0.1% BSA로 PBS에 재현탁하고 일회용 분취액 PKC&zeta에서 -80'C에 보관</td></tr><tr><td>; 유사기질 억제제, Myristoylated</td><td>EMD Millipore</td><td>539624</td><td>H20에 재현탁하고 일회용 분취액에서 -80'C에 보관</td></tr></tbody></table>

대뇌 피 질의 interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic 대뇌 피 질의 수는 흥분 성의 피라미드 뉴런의 출력 조절 피라미드 뉴런 앙상블의 출력을 동기화에 중요 한 역할을 하는 셀의 이종 인구. 정신병 무질서, 정신 분열 증, 자폐증, 간 질 등의 다양 한에서 적자 interneuron 함수에 연루 되었습니다. 배아 줄기 세포 로부터 대뇌 피 질의 수의 뿐만 아니라 그들의 개발 및 기능 연구에 대 한 허용 하지만 대뇌 피 질의 interneuron 관련 장애의 병 인을 기본 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 수는 또한, 마이그레이션, 생존과 호스트 대뇌 피 질의 회로 후 이식, 그들 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 이상적인 후보자를 만들기에 통합 놀라운 능력을가지고. 여기, 우리 Nkx2.1 표현 interneuron 창시자와 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장성, 높은 효율, 수정 embryoid 몸 단층 방법 제시. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 mESC 라인을 사용 하 여, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손 수 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 통해 격리 되며 이후 다운스트림 응용 프로그램의 숫자에 사용. 우리는 또한 방법을 풍부 하 게 parvalbumin (태양광 발전) 또는 somatostatin (SST) interneuron 하위 그룹을 도움이 될 수 있습니다 운명 결정의 측면을 공부 하거나 사용 하기 위해 하위 그룹 농축 interneuron에서 도움이 될 것 이라고 하는 치료 응용 프로그램에 제공 이식입니다.

이 문서에 설명 된 프로토콜 우리의 게시 프로토콜15,,1617 의 수정된 된 버전 이며, 우리의 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼-기자 mESC 선으로 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. DD0-5, 다시 도금 DD8에서 결합 XAV 939 Wnt 억제제를 추가 하 여 우리는 어떤 점에서 모든 DAPI + 핵 문화에서의 50% 이상을 또한 Nkx2.1 표현 (그림 1A, B) 강력한 Nkx2.1 유도 달성. MCherry 및 GFP 기자 Immunohistochemistry Nkx2.1-긍정적인 immunoreactivity (그림 1A)의 영역에서 ...

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

이 절차의 전반적인 목표는 변형된 배아체에서 단층 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 유사분열 후 중간뉴런 전구체에서 피질 중간뉴런 전구세포를 생성하는 것입니다. 이 방법은 피질 중간뉴런의 하위 유형이 발달 중에 개별 운명을 달성하는 방법과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 파브알부민 또는 소마토스타틴 중간뉴런 하위 그룹을 농축하는 방법뿐만 아니라 Nkx2.1 발현 중간뉴런 전구세포를 효율적으로 생성할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시작하려면 MEF 배지의 유사분열 비활성 MEF 공급 세포를 조직 배양 처리된 플레이트에 플레이트화합니다. mESC를 도금하기 전에 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에 정착할 때까지 최소 12시간을 허용합니다. 즉시 사용하지 않는 경우 3일마다 MEF 미디어를 교체합니다.다음으로, 마우스 백혈병 억제 인자를 포함하는 mESC를 MEF 플레이트에 추가합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다. 접시가 70-80% confluent가 되면 trypsin-EDTA를 사용하여 mESC를 계대측정하고, 다능성을 유지하기 위해 mESC 배지의 MEF 피더 층에서 mESC를 유지합니다.분화를 시작하기 전에 MEF가 없는 젤라틴 코팅 플레이트에 세포를 한 번 이상 통과시켜 희석합니다. 이를 위해 조직 배양 처리된 접시에 칼슘과 마그네슘이 함유된 0.1%젤라틴과 PBS를 첨가하여 젤라틴 코팅 플레이트를 준비하고 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 1.5-2 배 10 각 10cm 플레이트의 6 번째 세포를 플레이트하고 분화를 시작하기 전에 2 일 동안 팽창하도록합니다.DD0에서 mESC가 젤라틴 코팅 플레이트에서 2일 동안 자란 후 배지를 흡인하고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 플레이트 표면을 덮을 만큼 충분한 트립신-EDTA를 추가합니다. 그리고 세포를 다시 섭씨 37도의 인큐베이터에 4분 동안 넣습니다.4분 후, mESC 배지 부피의 2배를 사용하여 트립신-EDTA를 소멸시킵니다. 세포를 적절한 크기의 원심분리 튜브로 옮기고 200배 g으로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 다음으로, 튜브를 제거하고 펠릿을 방해하지 않고 매체를 흡인합니다.펠릿을 KSR-N2 배지 1밀리리터에 재현탁합니다. 그런 다음 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정합니다. 비부착성 조직 배양 접시에 KSR-N2 배지에 밀리리터당 75, 000개의 세포를 추가하여 세포를 배아체로 성장시키기 시작합니다.그리고 섭씨 37도에서 배양하십시오. DD1에서 조직 배양 처리된 접시를 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 또는 하룻밤 동안 폴리-L-라이신으로 코팅하여 세포 착륙을 준비합니다. DD2에서 폴리-L-라이신을 흡인하고 섭씨 37도에서 밤새 플레이트에 라미닌을 코팅합니다.DD3에서 EB 해리를 시작하기 전에 라미닌을 흡입하고 조직 배양 후드에서 플레이트가 완전히 건조되도록 합니다. 그 후, 매체와 함께 EB를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 15 회 g에서 3-4 분 동안 또는 EB가 펠릿 화 될 때까지 원심 분리하십시오. 배지를 흡입하고 DNase가 포함된 세포 분리 용액 3ml를 추가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. EB 해리를 돕기 위해 3분마다 튜브를 부드럽게 튕깁니다. EB가 더 이상 보이지 않거나 15분이 경과하면 DNase가 포함된 KSR-N2 6ml를 넣고 200배 g에서 5분 동안 원심분리합니다.그런 다음 LDN193189, XAV939 및 ROCK 억제제 Y27632를 포함하는 KSR-N2의 세포를 제곱센티미터당 4.5에서 10의 4배로 플레이트합니다. DD5에서 FGF2, IGF1 및 SSH를 포함하는 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. 다음으로, DD1 및 DD2에 대한 절차에 설명된 지침에 따라 8일째에 재생할 조직 배양 플레이트를 준비합니다.DD7에서 FGF2, IGF1 및 SHH를 포함하는 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. DD8에서 섭씨 37도에서 5분 동안 트립신-EDTA로 플레이트에서 세포를 분리하여 세포를 다시 플레이팅합니다. KSR-N2로 부피의 2배를 사용하여 트립신-EDTA를 담금질합니다.그리고 200 곱 g에서 5 분 동안 원심 분리기. 40미크론 필터 튜브를 통해 세포를 필터링하여 덩어리를 제거합니다. 다음, 250, SHH를 가진 FGF2, IGF1 및 Y27632를 포함하는 N2-KSR에서 제곱된 센티미터 당 000의 세포에 세포를 replated.DD10에서 SHH가 포함된 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 세포를 한 번 세척하고 DNase를 함유한 예열된 비트립신 함유 세포 해리 시약을 세포에 첨가합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에 10-30분 동안 또는 세포가 분리될 때까지 놓습니다.그런 다음 해리를 돕기 위해 5분마다 플레이트를 부드럽게 두드립니다. DD5에서 FGF2 및 IGF1을 포함하는 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. 다음으로, DD8에 다시 도금하기 위해 조직 배양 플레이트를 준비합니다.DD7에서 FGF2 및 IGF1이 포함된 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. DD8에서 세포를 평활화된 작용제로 재플레이팅하고 비정형 PKC 억제제를 추가합니다. DD10에서 aPKCi가 포함된 KSR-N2로 미디어를 변경합니다.DD11에서 FACS용 플레이트에서 셀을 분리합니다. DD11에서 FACS를 위해 셀이 분리되지 않은 경우 aPKCi가 포함된 KSR-N2를 사용하여 DD12에서 미디어를 변경합니다. DD14에서 aPKCi가 포함된 KSR-N2로 미디어를 변경합니다.그리고 DD16에서 aPKCi가 포함된 KSR-N2로 미디어를 변경합니다. 그런 다음 DD17에서 Nkx-2.1:mCherry 양성 세포를 수집합니다. 다음은 분화 12일차 배양에서 Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry 및 Lhx6:GFP에 대한 면역염색의 대표적인 이미지입니다.이러한 이미지는 동일한 시야에서 겹치는 채널입니다. 이 그래프는 배양 중 DD12에서 Nkx2.1을 발현하는 DAPI 양성 핵의 평균 백분율을 정량화한 것입니다. 그리고 이것은 대표적인 FACS 플롯으로, 이중 리포터 mESC 라인을 사용하여 분리할 수 있는 4개의 서로 다른 세포 집단을 보여줍니다.mCherry는 x축에 있고 GFP는 y축에 있습니다. 따라서 오른쪽 상단 상자는 mCherry-GFP 이중 양성 셀을 나타냅니다. 다음은 Nkx2.1:mCherry 및 Lhx6:GFP가 DD6에서 16으로 유도되는 시간 경과로, mCherry 단독 발현, GFP 단독 발현 또는 mCherry-GFP 동시 발현인 배양 내 세포의 비율로 표시됩니다.이 프로토콜은 일단 마스터하면 제대로 수행되면 처음부터 끝까지 17일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 흉막화능, 미분화, 건강해 보이는 줄기세포부터 시작해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 신생아 또는 성인 마우스 신피질에 이식하는 것과 같은 다른 방법을 수행하여 인터뉴런 운명 결정 또는 인터뉴런 이식이 회로 기능 및 동물 행동에 미치는 영향에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 발달 신경과학 분야의 연구자들이 생쥐, 더 나아가 인터뉴런 관련 장애의 영향을 받는 환자에서 인터뉴런 운명 결정을 주도하는 요인을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 배아 줄기 세포에서 Nkx2.1 발현 전구 세포와 유사 분열 후 자손을 유도하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 배아 생쥐의 개발​​ 피질에서 neuroprecursors의 절연에 사용되는 방법을 설명합니다. , 자궁에서 태아를 제거하는 대뇌 피질의 조직을 해부하고, 고립 대뇌 피질을 소화에 대한 절차는 표시됩니다.

마우스 신경 줄기 세포 엽 성의 전구 물질의 문화

우리는 작은 분자 기반 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)에 마우스 배아 줄기 세포의 차별 화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 차별화 후 30 일에 의해 고효율 Olig2 + NG2 + OPCs를 생성합니다. 우리는 또한 행동 잠재력을 불 수있다 "급상승"OPCs를 생성하는 방법을 설명합니다.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

우리는 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 시험 관내 분화의 효율을 개선하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 차별 ES 전지는 모터 뉴런이 같은 immunohistochemical 기술을 사용의 연결 및 모터 신경 세포 마커의 표현에 의해 입증 기능을 인수했습니다.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

이 비디오는 인간 배아 줄기 세포(hESCs)가 영양 세포나 중간 단계를 사용하지 않고 신경 전구 세포로 직접 분화되는 과정을 보여줍니다. 뼈 형태 유전 단백질(BMP)의 선택적 억제와 성장 인자-베타 또는 TGF-β 신호 전달 경로의 변형은 hESC를 신경 전구 세포(NPC)로 분화시킵니다.

인간 배아 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화

이 비디오는 마우스 배아 줄기 세포에서 피질 중간뉴런 전구체를 생성하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 줄기세포의 증식 및 배아체(EB)로의 응집을 촉진하는 특정 소분자 억제제를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 수반합니다. 그 후, EB는 효소와 해리되고 접착 단백질로 코팅된 배양 플레이트 웰에 도금되어 피질 중간뉴런 전구체로의 분화를 촉진합니다.

Generating Cortical Interneuron Precursors from Mouse Embryonic Stem Cells(마우스 배아 줄기세포에서 피질 중간뉴런 전구체 생성)

이 동영상은 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 신경전구세포(NPC)를 체외에서 생성하는 방법을 보여줍니다. mESC는 현탁액에서 배양되어 배아체(EB)를 형성한 다음, 부착 배양에서 레티노산 처리를 통해 NPC로 분화하도록 유도됩니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 기술

이 비디오는 신경 전구 세포를 뉴런으로 분화시키는 세포 배양 방법을 선보였습니다. 성장 인자로 보충된 영양이 풍부한 배지에서 세포를 배양함으로써, 전구 세포는 발달된 축삭돌기와 수상돌기를 가진 뉴런으로 성숙했습니다. 안정화제는 세포 생존력을 보장하고 분화 과정 전반에 걸쳐 산화적 손상으로부터 보호했습니다.

신경전구세포(Neural Progenitor Cells)를 뉴런(Neuron)으로 분화(Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neuron)

이 비디오는 배아 줄기 세포를 기능하는 시냅스를 가진 뉴런의 네트워크 집단으로 분화하는 기술을 보여줍니다. 배아 줄기 세포가 뉴런으로 분화하고, 뉴런 네트워크 형성을 유도하고, 네트워크 뉴런으로 배양을 풍부하게 하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 배아 줄기세포를 네트워크화된 뉴런 집단으로 분화(Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population)

이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

배우세요 마우스 배아 줄기 세포에서 수정된 배아체-단층 배양법을 이용해 대뇌 피질 인터뉴런 선구자를 효율적으로 분화시키는 방법을. Nkx2.1 발현 세포 생성 및 신경 발달 연구에 활용할 수 있습니다.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

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