Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

다음 실험의 전반적인 목표는 30일 동안 일련의 배양 단계를 통해 배아 줄기 세포에서 희소돌기아교세포 전구체를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 ES 세포에서 배아체를 생성하여 세포 분화를 시작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 배아체는 소분자인 레티노산(retinoic acid)과 순수 모르핀(morphine)으로 처리되어 세포가 리가 굴(liga den)로 유도됩니다.

Cyte 전구체. 세 번째 단계로, 배아체는 추가로 22일 후에 단일 세포로 분해됩니다. 배양에서 세포의 약 80%가 OPC입니다.

다음으로, MESC 유래 OPC를 NAV 1.2 서브유닛을 운반하는 바오 바이러스로 형질도입하여 스파이크 OPC를 생성하고, 면역형광 현미경 및 전기생리학적 기록을 기반으로 이러한 MESC 유래 OBC의 OPC 마커 및 스파이킹 특성의 발현을 보여주는 결과를 얻습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스(University of California Davis)의 세포 생물학 및 인체 해부학과 Dr.Ing 연구실의 Pong Chiang입니다. 우리는 또한 북부 캘리포니아의 슈라이너스 아동 병원(Shriners Hospital for Children of Northern California)과 제휴하고 있습니다.

안녕하세요, 저는 Deng 실험실의 바이알 Raj입니다. 오늘은 마우스 엠론 줄기세포를 대량학살 전구세포로 분화하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 더 나은 치료 잠재력을 가진 세포를 생성하기 위해 배아 줄기 세포 derd 희소돌기아교구 전구체의 특성을 연구하기 위해 실험실에서 이 절차를 사용합니다.

시작하겠습니다. 오늘날 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 OG 2 GFP 마우스 배아 줄기 세포주에서 생성될 것입니다. 이러한 배아 줄기 세포는 최적의 밀도로 건강을 유지하고 자발적인 분화를 방지하기 위해 3일마다 배양 줄기 세포를 배양해야 합니다. 통로.

ESS 세포는 층류 후드 아래에서 70% 합류할 때. 배양 위에 있는 매체를 제거합니다. PBS와 트립신 눈으로 2ml의 예열로 헹굽니다.

섭씨 37도에서 5분 동안 1회 LE 익스프레스. 반응을 중지하고 4ml의 MES 세포 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포를 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 1000RP에서 5분 동안 펠릿화합니다.

MES 세포 배지에서 방사선 조사된 메스암페타민 공급원의 합류층 위에 있는 세포의 10분의 1인 MESL 배지 플레이트에 재현탁합니다. 3일 후 ES 세포는 약 70% confluent 상태가 되고 배아체를 형성하기 위해 배양체 또는 현탁 준비가 되어 배아체를 유도하고 이전과 같이 트립신 마우스 ES 세포 콜로니를 분화하기 시작한 다음 녹아웃 혈청 대체 또는 KSR 배지에서 세포를 재현탁합니다. hemo TER의 세포를 세고 KSR에서 현탁액을 희석합니다.

15에 매체, 밀리리터 판 당 000 세포 초저 부착 6 웰 플레이트 배양의 각 우물로 3 밀리리터. 4일 동안 섭씨 37도에서 부유 세포. 이틀에 한 번씩 매체를 완전히 교체하십시오.

4일째부터 시작하여 4일째에는 매일 배지를 교체하고, 5일째에는 0.2마이크로몰 레티노산으로 KSR을 보충하고, 6일째와 7일째에는 레티노산과 1마이크로몰 프리모르 기근을 보충합니다. 0.2 마이크로몰 레티노산과 1 마이크로몰 프리모르 기근을 보충한 두 개의 배지 내에서 배아체에 영양을 공급합니다. 배양에서 8일이 지나면 대부분의 배아체에서 GFP가 발현되고 이전과 같이 트립신 눈을 분해하고 세포를 계수할 준비가 됩니다.

그런 다음 resus는 3.5 곱하기 10에서 밀리리터당 다섯 번째 세포에 현탁시킵니다. OPC 매체에서 OPC 매체에 있는 현탁액의 3 밀리리터를 reflate. 대략 매주 폴리 오르니틴으로 코팅된 60mm 접시를 사용하면 세포가 합류하고 3분 트립신 화와 함께 이전과 같이 세포로 가는 이 통로처럼 보일 것입니다.

원래 Resus 서스펜션 후 30일. KSR 배지에서 세포는 spiking OPC를 생성하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포의 특성을 보입니다. 50%에서 70% 사이의 융합 상태인 마우스 ESL 파생 OPC를 사용합니다.

배지를 하나의 XPBS로 교환하여 세포를 헹굽니다. 전압 게이트 나트륨을 소개합니다. 채널 1.2 알파 서브유닛.

우리는 백 MAM 나트륨 채널 키트를 사용합니다. 1밀리리터의 백 MAM 성분 A와 4밀리리터의 XPBS를 혼합합니다. PBS 헹굼을 제거하고 희석된 성분을 추가합니다.

섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 키트에 설명된 대로 후면 메모리 에이전트를 구성 요소 B 및 C로 향상된 OPC 매체로 교체합니다. 지침은 섭씨 37도에서 추가로 2시간 동안 배양합니다.

배양 후 강화 배지를 새로운 OPC 배지로 교체하십시오. 또 다른 24시간 배양 후, ESL 유래 OPC는 이 시점에서 스파이크에 대해 분석할 수 있습니다. EBS는 GFP 형광을 나타내지 않습니다.

EBS는 강한 GFP 발현을 보이며 원래 resus 현탁 후 약 30일 동안 disaggregation culturing을 할 준비가 되어 있습니다. KSR 배지에서 대부분의 세포는 NG 2 염색에 대해 면역 양성이며, 이는 GFP 발현과 일치합니다. 그러나 뇌 OPC와 달리 이러한 MES 세포 유래 OPC는 세포가 0밀리볼트로 탈분극된 경우에도 활동 전위를 발사하지 못합니다.

바이러스 형질도입에 의해 NAV 1.2 subunit을 도입한 후, 이러한 MES 세포 유래 OPC는 여기되고 작용 전위를 발사합니다. 방금 마우스 배아 줄기 세포를 OPC로 분화하고 바이러스 형질도입을 통해 스파이크 OPC를 생성하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 모르핀과 FGF 2당 레티노이드산을 적절하게 보관하고 항상 새로운 부분 표본을 사용하고 사용 후 여분의 t 레티노이드산을 버리는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.