Name: Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 마우스 배아 줄기 세포를 소분자로 처리하여 30일 내에 80% 효율로 올리고덴드로사이트 전구세포(OPC)를 분화시키는 방법을. 바이러스 매개 전도로 스파이킹 OPC를 생성하여 중추신경계 수초 형성 연구에 활용합니다.

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이 작품은 일부 보건 국립 연구소 (RO1 NS059043 및 RO1 ES015988), 국립 다중 경화증 학회, 빈혈 연구, Feldstein 의료 재단 로체 재단, 어린이를위한 이너스 병원에서 WD로 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 제안 데이빗 플레져와 제니퍼 비행기를 감사하고 싶습니다. 우리는이 문서에 관한 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

GFP - Olig2 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)를 생성하는 자세한 절차 : <ol><li> 마우스 ES 세포 라인 GFP - Olig2 (G - Olig2)은 미국 유형 문화 수집 (ATCC)에서 구입. mESCs는 정기적으로 조사 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 계층에 삼일마다 passaged 있습니다. MEF 세포는 젤라틴 코팅 여섯 잘 조직 문화 판 ESCs을 passaging하기 전에 최소한 1 일 이상 0.1 %로 도금입니다. mESC 문화 매체 20 % 태아 소 혈청 (GIBCO), 2 MM L - 글루타민, 1 ㎜의 나트륨 pyruvate, 0.1 MM β - 메르 캅 토 에탄올 /, 1 % 불필요한 아미노산 (와 보충 Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) (GIBCO)입니다 NEAA), 1000 U / ML 백혈병 억제 인자. </li><li> MES의 식민지가 하나의 셀에 (TrypLE, 5 분, 37 ° C) trypsinized 및 녹아웃 혈청 대체 (KSR) 중간에 중단되며, 다음 세포는 세포에서 코스타 초저 첨부 여섯 잘 플레이트 (코닝)으로 전송됩니다 50,000 세포 / cm 2 밀도. 이러한 조건에서 mESCs는 embryoid기구 (EBS)를 형성합니다. KSR 매체 20 % KSR, 1 MM 나트륨 pyruvate, 1 % NEAA, 그리고 0.1 MM β - 메르 캅 토 에탄올 /과 보완의 - 최소한의 필수적인 매체를 (- 멤)로 구성되어 있습니다. </li><li> 일 4 일 7, retinoic 산 (RA, 0.2 M)와 purmorphamine (PUR, 1 M)은 같은 그림과 같이 포함되어 있습니다. KSR 또는 N2 매체에서 1A. N2 매체 1X의 N2의 보완, 1 MM 나트륨 pyruvate, 1 % NEAA, 그리고 0.1 MM β - 메르 캅 토 에탄올 /를 포함하는 - 멤입니다. 매체는 매일 변경됩니다. </li><li> 일 8시, EBS는 N2 매체와 fibroblast 구성되어 OPC 매체에서 0.01 % polyornithine - 코팅 요리 TrypLE (5 분, 37 ° C) 및 도금을 사용하여 disaggregated 아르 성장 인자 - 2 (FGF - 2, 20, NG / ML). 중간 이틀마다 변경됩니다. </li><li> 세포 trypsinized (TrypLE, 3 분, 37 ° C)과 그들이 합류이되면 매주 약을 replated 있습니다. 30 일, 세포의 80 %가 GFP/Olig2 표현을 표시하고, NG2 - 긍정적인 OPCs의 특징입니다. </li><li> 급상승 OPCs를 생성하려면, BacMam 나 + 채널 키트 이러한 mESC - 파생 OPCs에 나 V 1.2 subunit을 소개하는 데 사용됩니다. BacMam 시약 (1 ML, 구성 요소가) 5 ML의 최종 볼륨 PBS와 혼합됩니다. 다음, 혼합 BacMam 시약 전에 PBS로 rinsing하기 (50~70%의 합류에서) 60mm 문화 접시에 mESC - 파생 OPCs 문화로 추가됩니다. 2 시간 보육 후, 혼합 BacMam 시약은 1X 확장기와 함께 보충 OPC 매체로 제거하고 교체합니다. 확장기는 구성 요소 B DMSO (구성 요소 C)에서 재구성됩니다. 다음, 추가 2 시간 보육 후 확장기와 매체 전체 OPC 매체로 제거하고 교체합니다. 세포는 24 시간 후에 assayed 있습니다. </li></ol> 대표 결과 : 그림에 표시된 차별 프로토콜을 다음. 1A, G - Olig2의 mESCs는 처음 embryoid 단체 (EBS) (그림의 1B)를 형성 KSR 매체에서 4 일간 정지되었습니다. 그렇다면, 우리는 순차적으로 RA와 PUR와 EBS를 취급. EBS는 4 일 모든 GFP의 형광을 표시하고 D8 (그림의 1B)에 강한 GFP의 형광을 표명하지 않았다. 이 시점에서, EBS는 trypsinized되었으며 성장 요인 FGF - 2와 함께 보충 N2 매체에 도금. 22일 (D30)에 대한 자세한 문화 후, GFP + 세포의 비율은 80.3에 도달 ± 0.6 % 우리의 유동세포계측법 결과에 따라. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 1C, GFP + 세포가 지속적으로 NG2 얼룩 (96.4 ± GFP 양성 세포의 1.3 % 긍정적인 NG2 및 94.8 ± NG2 긍정적인 세포의 1.5 %가 긍정적인 GFP 쓰셨)와 overlapped. 따라서, 이러한 전지는 OPCs으로 그들을 정의 GFP/Olig2 및 NG2을 표현. mESC 파생 OPCs (76 셀)는 탈분극 (그림 2A)에 따라 행동 잠재력을 해고하지 못했습니다. 나 V 1.2 subunit를 들고 baculovirus와 transducing 후 다음 mESC 파생 OPCs (17 세포의 94.1 %, 16)는 (그림 2B)로 분류 급상승 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. embryoid 신체의 프로토콜을 보여주는 OPCs로 GOlig - mESC의 분화. (A) 계획 (EB) 기반 및 작은 분자 기반 차별화. D8에서는 EBS가 disaggregated 및 도금했다. 그들이 합류되었을 때 세포는 주 당 한 번 passaged했다. (B) D8 아니지만 D4 EBS, GFP 발현을 보여주었다. (C) NG2 (빨간색)의 Immunostaining는 D30에서 GFP (녹색) 표현식과 일치했다. DAPI (파란색)은 핵을 식별하는 데 사용되었다. 스케일 바 : 20mm. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 에 의해 mESC - 파생 OPCs를 nonspiking에서 난리 OPCs의 생성 바이러스 중재 셀 0으로 depolarized 때도 나 V 채널 표현. (A) 멤브레인 가능성은 -60 뮤직 비디오와 mESC 파생 OPCs에서 개최 되었음, 액션 잠재력을 발사하는 데 실패 MV. (B) mESC 파생 OPC의 예바이러스 전달 후 행동 잠재력을 (빨간색으로 강조) 발사.

<ol><li>Xian, H., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dividing+Olig2-expressing+progenitor+cells+derived+from+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells.</a> Glia. 47 (1), 88-101 (2004).</li>
<li>Clair, A., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+ES-cell-derived+neural+cells+marked+by+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting.</a> Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-dependent+Olig2+expression+in+motor+neurons+and+oligodendrocytes+differentiated+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).</li>
<li>Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+timing+of+oligodendrocyte+development+from+genetically+engineered%2C+lineage-selectable+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells.</a> J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).</li>
<li>Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+NG2+proteoglycan+and+PDGF+alpha-receptor+on+O2A+progenitor+cells+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain.</a> J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).</li>
<li>Ligon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+NG2+neural+progenitor+cells+requires+Olig+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).</li>
<li>Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).</li>
<li>Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+in+the+mouse+white+and+grey+matter+display+distinct+physiological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties.</a> J Physiol. 561, 109-122 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+and+nonspiking+classes+of+oligodendrocyte+precursor+glia+in+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter.</a> Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

blastocyst의 배아에서 분리된 배아 줄기 세포 (ESCs)는, oligodendrocyte 사양을 포함하여 초기 포유류의 개발 연구를위한 체외 모델 시스템을 제공하는 유기체 3, 4의 모든 세포 lineages로 구별하실 수 있습니다. mESCs는 소닉 헤지 호그 (쉬) 5의 치료 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)로 차별화하는 표시되었습니다. 또한, mESCs에서 쉬 유발 OPC의 차별화는 배아 개발 6 관찰 올바른 타이밍을 유지합니다. 따라서 mESCs에서 체외 OPC의 분화에의 성격은 생체내 개발에 배운되었습니다 것과 일치로 간주됩니다. 여기, 작은 분자 RA와 쉬 작용제의 PUR 사용, 우리는 성공적으로 고효율 GFP + Olig2 + NG2 + OPCs에 G - Olig2 mESCs을 차별. 그들은 전체 세포의 상당한 비율 (~ 5 %)를 구성하고 어디 proteoglycan NG2 7 표현과 나선형 루프 - 나선의 전사 인자 Olig2 8 시까지 특징 OPCs는, 개발하고 성숙한 CNS에 oligodendrocytes를 생성 주요 proliferating 세포 유형 9. V 채널 나 보여준 근 20 년 연구가들은 OPCs의 subpopulation 표현하고 탈분극 10, 11시 활성화할 수 있습니다. 또한, 최근 인상적인 관찰 9 전압 - 게이 티드 나트륨 (나 V) 채널의 표현에 따라 언제 depolarized 흰 물질 현장 쥐 CNS에서에서 OPCs는 (~ 50 %) 액션 잠재력을 생성하기 때문에 난리로 세분화 될 수 있다고했습니다 와 subpopulations을 nonspiking. 그러나 이러한 요동 치고 속성의 기능은 여전히​​ 대부분 알 수 있습니다. 우리는 electrophysiologically, 쉬 - 의존 프로토콜 차별화된 mESC 파생 OPCs는 현장 뇌 OPCs에서 같은이 아니라, 사실을 발견했습니다. subunit 나 V 1.2를 소개하면 다음과 침묵 mESC 파생 OPCs가 튀어 오르고 수 있었다. 따라서 요동 치고 / mESC - 파생 OPCs과 차별화 프로토콜 여기에 설명된 내용을 nonspiking (1) OPCs 춤을 추는과 nonspiking 사이의 기능적 차이, (2) mESC 파생 OPCs에 나트륨 채널 표현을 촉진 수도 선별 새로운 요소를 공부하고 용이하게 수 있습니다 ( 3) 개발 및 인간 ESC 또는 유도 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)에서 OPCs의 차별 프로토콜을 최적화.

<table><tbody><tr><td>MEFs</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6001G</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009634</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>EMD Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>BacMam Na&lt;sub&gt;V&lt;/sub&gt; 1.2</td><td>Invitrogen</td><td>B10341</td><td></td></tr></tbody></table>

oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes은 중추 신경계의 myelinating 세포 수 있습니다. demyelinating 질병의 재생 세포 치료, 이식을위한 혈통 - 최선을 다하고 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)의 순수한 인구 파생에 상당한 관심이 있습니다. OPCs는 전사 인자의 Olig2 및 proteoglycan의 NG2의 표면 표현의 활동에 의해 특징입니다. GFP - Olig2 (G - Olig2) 마우스 배아의 줄기 세포 (mESC) 기자 라인을 사용하여, 우리는 GFP + Olig2 + NG2 + OPCs에 mESCs의 차별 화를위한 조건을 최적화. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 먼저 mESCs에서 embryoid 기관의 세대 (EBS)를 설명합니다. 둘째, 우리는 작은 분자로 mESC - 파생 EBS의 치료를 설명 : (1) retinoic 산 (RA)와 정의 문화 조건 (2) 소닉 헤지 호그 (쉬) 작용제의 purmorphamine (PUR)는 oligodendroglial 혈통에 EB 차별을 직접합니다. 이 방법으로 OPCs 30 일 기간에 높은 효율 (&gt; 80 %)로 구할 수 있습니다. 이 프로토콜의 mESCs에서 파생된 세포는 기본 조직 문화에서 파생된 OPCs에 phenotypically 비슷합니다. mESC 파생 OPCs는 현장에서 뇌 OPCs의 subpopulation에 대한 설명 급상승 속성을 표시하지 않습니다. 이 electrophysiological 속성을 연구하기 위해, 우리는 ectopically 나 표현하여 mESC - 파생 OPCs 춤을 추는의 생성을 설명<sub&gt; V</sub&gt; 1.2 subunit. 이 프로토콜에서 얻은 요동 치고 및 nonspiking 세포가 OPCs의 두 subpopulations에 사전 기능 공부를하는 데 도움이됩니다.

우리는 작은 분자 기반 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)에 마우스 배아 줄기 세포의 차별 화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 차별화 후 30 일에 의해 고효율 Olig2 + NG2 + OPCs를 생성합니다. 우리는 또한 행동 잠재력을 불 수있다 &quot;급상승&quot;OPCs를 생성하는 방법을 설명합니다.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

희소돌기아교세포는 중추신경계의 수초 형성 세포입니다. 탈수초 질환의 재생 세포 치료를 위해, 상당한...

다음 실험의 전반적인 목표는 30일 동안의 일련의 배양 단계를 통해 배아줄기세포로부터 희소돌기아교세포 전구세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 ES 세포로부터 배아체(embryo bodies)를 생성하여 세포 분화를 유도함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 배아체에 소분자인 레티노산(retinoic acid)과 순수 모르핀(pure morphine)을 처리하여 세포가 liga den으로 지향성 분화하도록 유도합니다.세포 전구체. 세 번째 단계로, 22일이 더 지난 후 배아 본체를 단일 세포로 분리합니다. 배양 시, 세포의 약 80%가 OPC입니다.다음으로, 스파이킹 OPC를 생성하기 위해 NAV 1.2 소단위체를 운반하는 bao 바이러스를 MESC 유래 OPC에 형질전환시킵니다. 면역형광 현미경 검사와 전기생리학적 기록을 통해 이러한 MESC 유래 OPC의 OPC 마커 발현과 스파이킹 특성을 보여주는 결과를 얻습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 세포생물학 및 인체해부학과의 Dr.Ing 연구실 소속 Pong Chiang입니다. 저희는 북가주 슈라이너 어린이 병원(Shriners Hospital for Children of Northern California)과도 협력하고 있습니다.안녕하세요, Deng 연구실의 vial Raj입니다. 오늘은 마우스 배아 줄기세포를 희소돌기아교 전구세포로 분화시키는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 치료 잠재력이 더 뛰어난 세포를 생성하기 위해, 배아 줄기세포 유래 희소돌기아교 전구세포의 특성을 연구하는 데 이 절차를 사용하고 있습니다.그럼 시작하겠습니다. 오늘은 OG2 GFP 마우스 배아줄기세포주로부터 희소돌기아교세포 전구세포(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)를 생성해 보겠습니다. 이 배아줄기세포들은 최적의 밀도를 유지하여 건강한 상태를 유지하고 자발적 분화를 방지하기 위해 3일마다 계대 배양해야 합니다. 계대 배양 과정입니다.층류 후드 아래에서 ESS 세포가 70% 밀도(confluence)에 도달했을 때, 배양액을 제거합니다. PBS로 헹군 후, 2 mL의 예열된 trypsin으로 처리합니다.37°C에서 5분 동안 1회 LE express를 수행합니다. 반응을 중단하고 4 mL의 MES 세포 배지에 세포를 재부유시킵니다. 세포를 15 mL 원추형 튜브로 옮긴 후 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다.MES 세포 배지 내에서 방사선 조사를 통해 합류층(confluent layer)을 형성한 meth 피더 세포 위에, 세포의 1/10 분량을 MESL 배지 플레이트에 재부유시킵니다. 3일 후 ES 세포가 약 70% 합류 상태가 되면 계대 배양을 하거나, 배아체(embryoid bodies)를 형성하여 분화를 유도할 준비가 된 것입니다. 이전과 동일하게 트립신(Trypsin)을 사용하여 마우스 ES 세포 콜로니를 처리한 다음, 세포를 knockout serum replacement 또는 KSR 배지에 재부유시킵니다. 헤모사이토미터(hemocytometer)로 세포 수를 측정하고 KSR 내에서 현탁액을 희석합니다.밀리리터당 15,000개의 세포가 포함된 배지 3mL를 초저부착 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주하여 배양합니다. 부유 세포를 37°C에서 4일 동안 배양합니다. 배지는 2일마다 완전히 교체합니다.4일째부터 매일 배지를 교체합니다. 4일째에는 KSR에 0.2 µM retinoic acid를 첨가하고, 5일째에는 retinoic acid와 1 µM primor famine을 모두 첨가하며, 6일과 7일째에도 동일하게 첨가합니다. 배아체(embryo bodies)를 0.2 µM retinoic acid와 1 µM primor famine이 첨가된 두 가지 배지로 배양합니다. 배양 8일 후, 대부분의 배아체에서 GFP가 발현되며, 이전과 동일하게 trypsin을 처리하여 세포를 분리하고 세포 수를 측정할 준비가 됩니다.그런 다음 세포를 mL당 3.5 × 10⁵ cells 농도로 재현탁합니다. OPC 배지를 사용하여 현탁액 3 mL를 OPC 배지에 다시 분주합니다. 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornithine)이 코팅된 60 mm 디쉬를 사용하면 약 일주일마다 세포가 합류(confluent) 상태가 되며 이와 같은 모습이 됩니다. 이전과 동일하게 3분간의 트립신 처리(trypsinization)를 통해 세포를 계대 배양합니다.최초의 재현탁 현탁액 조제 후 30일이 지난 시점입니다. KSR 배지에서 세포는 스파이킹(spiking) OPC를 생성하기 위한 희소돌기아교 전구세포의 특성을 나타냅니다. 50~70% 정도로 합쳐진(confluent) 마우스 ESL 유래 OPC를 사용하십시오.세포를 헹구기 위해 배지를 1X PBS로 교체합니다. 전압 개폐성 나트륨 채널 1.2 알파 서브유닛을 도입하기 위해서입니다.back MAM 나트륨 채널 키트를 사용합니다. back MAM 성분 A 1 mL를 1X PBS 4 mL와 혼합합니다. PBS 린스액을 제거하고 희석된 성분을 첨가합니다.37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 키트의 설명에 따라 성분 B와 C가 첨가된 OPC 배지로 배경 메모리 제제를 교체합니다. 추가로 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.배양 후, 강화 배지를 신선한 OPC 배지로 교체합니다. 다시 24시간 동안 배양한 후, 이 시점에서 ESL 유래 OPC의 스파이킹(spiking) 여부를 분석할 수 있습니다. EBS에서는 GFP 형광이 나타나지 않습니다.EBS는 최초 재현탁 후 약 30일 동안 강한 GFP 발현을 보이며, 해리 배양 준비 상태가 됩니다. KSR 배지에서 대부분의 세포는 NG2 염색에 대해 면역 양성 반응을 보이며, 이는 GFP 발현과 일치합니다. 하지만 뇌 유래 OPC와 달리, 이러한 MES 세포 유래 OPC는 세포를 0 mV까지 탈분극시켰을 때에도 활동 전위를 생성하지 못했습니다.바이러스 형질전환을 통해 NAV 1.2 소단위를 도입하면, 이러한 MES 세포 유래 OPC들이 흥분하여 활동 전위를 발생시킵니다. 지금까지 마우스 배아줄기세포를 OPC로 분화시키고 바이러스 형질전환을 통해 스파이킹 OPC를 생성하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 레티노산, 모르핀 및 FGF two를 적절하게 보관하고 항상 신선한 분주액(aliquots)을 사용하며, 사용 후 남은 레티노산은 폐기해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 태아의 척추 코드에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유래를 설명하고 이식이나 oligodendrocytic 혈통의 연구 중 체외 유지.

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해...

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

이 비디오는 성체 쥐의 뇌에서 외측 심실 벽을 분리하고 효소 조직 해리를 수행하여 단일 세포를 얻기 위한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 그런 다음 이러한 세포는 신경 줄기 세포의 증식을 선택적으로 강화하고 희소돌기아교세포와 성상세포의 공동 배양으로의 분화를 촉진하는 특정 배양 조건에 적용됩니다.

성체 마우스 신경 줄기세포에서 혼합 희소돌기아교세포와 성상교세포 배양 획득

이 동영상은 인간 배아 줄기 세포에서 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 생성한 후 OPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 과정을 보여줍니다. 이러한 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 생성하는 과정은 알츠하이머병을 포함한 신경퇴행성 질환의 연구와 치료를 개선할 수 있는 수많은 길을 열어줍니다.

인간 배아 줄기 세포를 희소돌기아교세포로 분화

이 비디오는 인간 유도 뉴런(iN)과 유도 희소돌기아교세포 전구세포(iOPC)의 공동 배양 확립을 보여줍니다. iNm은 공동 배양에서 iOPC와 혼합된 다음 두 iNm이 뉴런으로, iOPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 것을 지원하기 위해 배양됩니다. 뉴런은 다른 뉴런 및 희소돌기아교세포와 시냅스 연결을 형성하는 반면, 희소돌기아교세포는 뉴런의 축삭돌기 주위에 수초를 발달시킵니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용을 모델링하는 공동 배양 방법

희소돌기아교세포는 중추신경계의 수초세포입니다. 이 프로토콜은 쥐 피질에서 전구체인 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리 및 배양하는 방법과 실험 요인에 따라 체외에서 희소돌기아교 형성을 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 정량적 방법을 설명합니다.

쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

우리는 성숙한 올리고드로시테스로 분화하는 태아 또는 성인 신경 줄기 세포에서 유래한 성상세포및 올리고드엔드로시테 전구세포의 혼합 배양, 유해자극의 시험관내 모델링을 설명한다. 셀 기반 고함량 선별 기술과 결합은 신뢰할 수 있고 견고한 약물 선별 시스템을 구축합니다.

태아 및 성인 신경 줄기 세포의 고함량 선별 분화 및 성숙 분석- 유래 올리고드로시테 전구체 세포 배양

배우세요 마우스 배아 줄기 세포를 소분자로 처리하여 30일 내에 80% 효율로 올리고덴드로사이트 전구세포(OPC)를 분화시키는 방법을. 바이러스 매개 전도로 스파이킹 OPC를 생성하여 중추신경계 수초 형성 연구에 활용합니다.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

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