Name: 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: 배우세요 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 이용하여 RAW 264.7 대식세포에서 나노입자와 박테리아의 세포 내면화 메커니즘을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 내면화된 입자와 표면 결합 입자를 정확히 구분하여 면역학 및 나노의학 연구에 활용됩니다.

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저자는 금융에 대한 ONR-MURI 수상 (NN00014-06-1-1176)과 미군 의료 연구 및 Materiel 명령을 (부여 번호 W81XWH-09-1-0386 및 W81XWH-10-1-0806) 감사드립니다 지원합니다.

<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
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<li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree L. 친구는 ImageStream의 X 시스템을 제조 Amnis 회사에 의해 고용된다.

연구는 폴리 (락트 - 공동 glycolic 산 (PLGA) 또는 polyanhydrides을 기반으로 생분해성 nanoparticles는 대상 세포를 캡슐 항원이나 약물을 전달하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. phagocytic 세포에 의해 이러한 nanoparticles의 이해 이렇게 양적으로 만들어 그들의 효과를 위해 중요하다 . 소설 nanoparticle 전달 시스템을 설계에서 중요한 내면화의 분석이 방법을 사용함으로써는 다양한 세포 유형별로 nanoparticles의 차등 이해가 쉽게 분석할 수 있으며, 종래의 현미경 및 유동세포계측법 데이트를하려면 입자 이해를 quantifying에 사용되었습니다;.하지만, 각각의 높은 처리량 및 내면화를 공부하는 다른 접근 방법을위한 해상도의 호출로 제한.이 문서에서 우리는 특성화와 phagocytosis의 생물 학적 과정 목표 - 세균성 병원체 및 합성 nanoparticles의 두 유형 간의 차이가 어떻게 비교할 MIFC 분석을 수행합니다. <p class=...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> RAW 264.7 세포주 </td><td> 미국 유형 문화 수집 (ATCC) </td><td> 티비 - 71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10-013 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S 11,150 </td><td> 프리미엄 학년 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24 잘 플레이트</td><td> TPP </td><td> 92,024 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 Flasks </td><td> TPP </td><td> 90,151 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스크레이퍼 </td><td> TPP </td><td> 99,002 </td><td> 24cm </td></tr><tr><td> 살모넬라 enterica serovar Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14,028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 전기 세포 조작하는 사람 </td><td> BTX 하버드 장치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 맙스 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 식염수 (PBS)를 버퍼 </td><td> Cellgro </td><td> 21-040 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> 초음파 액체 프로세서 </td><td> MISONIX </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin-D </td><td> 시그마 - 올드 리치, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> 포름 알데히드 </td><td> Polysciences </td><td> 04,018 </td><td></td></tr><tr><td> 버퍼를 씻으십시오 </td><td> 2퍼센트 열 inactivated FBS, PBS에 0.​​1 %의 나트륨 azide. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 버퍼를 씻고 / 파마 </td><td> BD Biosciences </td><td> 554,714 </td><td></td></tr><tr><td> 스냅 캡 microtubes를 클리어 뷰 </td><td> 시그마 </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 형석 phalloidin 660 </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis Corpora기 </td><td> 100,200 </td><td> 옵션 : 658nm 레이저, autosampler </td></tr><tr><td> 나트륨 azide </td><td> 피셔 과학 </td><td> S 227I-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate 시스템은 항원 제시 세포를 1-5으로, 효율적으로 단백질을 포함하여화물을 전달하는 능력을 통해 백신 전달에 유용한 도구로 등장했습니다. 항원 제시 세포에 의해 nanoparticles의 내면화 (NP)는 캡슐화된 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 생성에 중요한 단계입니다. nanoparticle 제제 영향을 미치는 기능에 어떻게 변경 사항을 확인하려면, 우리는 internalized nanoparticles뿐만 아니라 박테리아를 검출과 호환였다 높은 처리량, 양적 실험 프로토콜을 개발하기 위해 모색하고 있습니다. 현재까지, 두 개의 독립적인 기법, 현미경 및 유동세포계측법는 nanoparticles의 phagocytosis를 연구하는 데 사용되는 방법 왔습니다. 유동세포계측법의 높은 처리량 본질은 강력한 통계 데이터를 생성합니다. 그러나, 낮은 해상도로 인해, 그것은 정확하게 셀 바운드 nanoparticles 비해 internalized 수치 실패합니다. 현미경은 높은 공간적 해상도로 이미지를 생성합니다; However, 그건 시간이 소요되며 작은 샘플 크기에게 6-8을 포함한다. 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 (MIFC)는 판상 코어를 통해 동시에 멀티 컬러 스펙트럼 형광 및 명시야 현미경 이미징을 수행하고 유동세포계측법 양쪽 측면을 통합함으로써 새로운 기술입니다. 이 기능은 형광 신호 강도와 다양한 구조와 고속 세포 기능 사이의 공간적 관계의 정확한 분석을 제공합니다. 여기, 우리는 polyanhydride의 nanoparticles이나 살모넬라 enterica serovar Typhimurium을 internalized 않은 세포 인구를 특성화하기 위해 MIFC을 활용한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 nanoparticle의 현탁액, 세포 라벨, ImageStream X 시스템의 취득 및 아이디어 응용 프로그램을 사용하여 데이터 분석 준비에 대해 설명합니다. 또한 국제화 P를 차별화하는 데 사용할 수있는 기술의 응용을 설명actin - 중재의 phagocytosis의 억제제로서 cytochalasin-D를 사용하여 nanoparticles와 박테리아 athways.

이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

나노입자 시스템은 단백질을 포함한 화물을 효율적으로 전달하는 능력을 통해 백신 전달의 가치 있는 도구로 부상했습니다.

다중 스펙트럼 이미징 유세포 분석법을 이용하여 나노입자와 박테리아의 세포 내 유입 기전을 분석합니다. 먼저, 액틴 중합을 억제하기 위해 대식세포를 cytochalasin D로 전처리합니다. 그 후, 나노입자 또는 salmonella를 대식세포 단일층에 첨가하고 배양합니다.그 후 대식세포를 수확하여 고정시키고, 이미지 스트림을 이용한 분석을 위해 표지합니다. 다색 분광 이미징 유세포 분석기를 통해 나노입자와 살모넬라를 내부화한 세포를 표면에 나노입자와 살모넬라가 결합된 세포와 구분합니다. 분석 결과, cyto klain을 처리하지 않은 세포에서만 살모넬라와 나노입자가 모두 내부화되었음을 알 수 있습니다.D는 내재화가 actin 의존적임을 시사합니다. 이 기술은 유세포 분석법이나 공초점 현미경법과 같은 기존 방법들에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 우선, 형광 신호 강도를 정확하게 측정할 수 있으며, 서로 다른 세포 특징 간의 공간 해상도를 빠른 속도로 제공합니다.이 방법은 생체 재료 백신 및 약물 전달 연구뿐만 아니라 호스트-병원체 상호작용 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 여기에는 폴리무수물 나노입자와 박테리아가 이용하는 내부화 경로를 규명하는 것이 포함됩니다. 일반적으로 이 방법에 처음 접하는 사람들은 종종 어려움을 겪습니다.최적의 형광 신호를 얻기 위해 염료를 적정하는 시간을 갖는 것이 중요합니다. 또한, 소프트웨어를 익히고 분석 템플릿을 생성하는 데에도 시간이 소요됩니다. 저희는 현미경 관찰 및 기타 기술을 사용하는 과정에서 poly hydro 나노입자가 병원체 모방 특성을 나타낸다는 것을 발견하고 처음으로 이 방법 아이디어를 얻었습니다.그다음, 분석을 수행하기 전에 살모넬라와 꽃가루 하이드라이드 나노입자가 사용하는 내포화 과정을 비교하기 위한 고처리량 시스템이 필요했습니다. 모든 포유류 및 박테리아 세포 배양물을 수확하고 나노입자 현탁액을 준비해야 합니다. 먼저 세포 스크레이퍼를 사용하여 합류된 RAW 264.7 세포를 수확하는 것으로 시작하십시오.헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하십시오. 그다음, 0.5 mL의 Complete DMEM 내에서 웰당 5 × 10⁵ cells의 밀도로 24-웰 배양 접시에 세포를 분주하십시오. 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하십시오.Salmonella tarica를 준비하려면, 16 by 125 mm 오토클레이브 스크

analyzing-cellular-internalization-nanoparticles-bacteria-multi

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Zhang, Y., et al. 세포내 박테리아에 의한 엔도-리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위한 형광 나노입자의 적용. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 세포내 박테리아에 감염된 인간 상피 세포에서 엔도-리소좀 리모델링을 시각화하기 위해 형광 나노입자를 사용하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 침입 후 병원체는 숙주 세포골격과 엔도-리소좀 시스템을 조작하여 소포 수송을 변경하는 관형 돌출부가 있는 액포를 형성합니다. 그런 다음 형광 표지된 나노입자를 사용하여 이러한 변화를 추적하여 병원체 유발 세포내 트래피킹 사건의 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

세균에 감염된 세포에서 엔도-리소좀 리모델링의 나노입자 매개 시각화

우리는 컴팩트하고 비용 효율적인 광학 유체 첨부 파일을 사용하여 휴대 전화의 형광 현미경 및 이미징 유동 세포 계측법 도구의 통합에 우리의 최근 결과를 검토합니다. 이 휴대 전화 기반 마이크로 분석 장치는 다음과 같은 자원 제한 설정에서 예를 들어, 물 시료의 높은 처리량 검사를위한뿐만 아니라 다양한 세포 계수 작업을 수행하는 등 cytometric 분석을 위해 유용 할 수 있습니다.

휴대 전화에 폭 넓은 분야 형광 현미경과 형광 이미징 유동 세포 계측법

이 연구에서 주요 목적은 탄소 나노튜브(CNT)의 세포 흡수와 최종 엑소사이토시스를 모니터링하는 것이었습니다. 이러한 관점에서, 우리는 통계적으로 유의미한 수의 세포에서 CNT의 정량화 및 국소화를 허용하는 다중 스펙트럼 이미징 유세포 분석을 사용하는 고유한 방법을 제안했습니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법과 세포의 현지화 및 탄소 나노 튜브의 상대 정량

유동 세포 계측법에 의해 면역 세포의 정의 모집단을 가진 나노 입자의 상호 작용의 분석.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

이 방법은 박테리아의 식균작용과 산화 버스트를 동시에 측정하여 과립구 기능을 평가하는 기술을 보여줍니다. 이미지 기반 유세포 분석을 통해 상대적 기능적 용량이 모두 다른 활성 과립구의 세 가지 별개의 subset을 식별할 수 있었습니다.

이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기 체외

흐름 cytometric 분석은 순수 문화 조사 및 미생물 지역 사회 역학을 모니터링 귀중 한 입증 했다. 우리는 순수한 문화 및 도전 행렬에서 명확한 매체 뿐만 아니라 복잡 한 사회에 대 한 데이터 분석, 샘플링에서 세 개의 포괄적인 워크플로 각각 제시.

특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

시험관 내 미세핵 분석은 유전체 독성 및 세포 독성을 평가하기 위한 잘 확립된 방법이지만 수동 현미경 을 사용하여 분석법을 채점하는 것은 힘들고 주관성 및 득점자 간 가변성으로 고통받고 있습니다. 이 논문은 다중 스펙트럼 화상 진찰 유동 세포측정을 사용하여 분석의 완전 자동화된 버전을 능력을 발휘하기 위하여 개발된 프로토콜을 기술합니다.

다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

이 기사에서는 스펙트럼 초점 모듈과 이중 출력 펄스 레이저의 통합을 제시하여 금 나노 입자와 암세포의 신속한 초분광 이미징을 가능하게 합니다. 이 작업은 표준 레이저 스캐닝 현미경에서 다중 모드 비선형 광학 기술의 세부 사항을 시연하는 것을 목표로 합니다.

다중 모드 비선형 광학 현미경을 사용한 나노 입자의 세포 흡수의 생체 분자 이미징

이 프로토콜은 이미징 유세포 분석을 사용하여 미생물 자가응집을 측정하기 위한 정량적 접근 방식을 설명합니다.

미생물 자가응집(microbial autoaggregation)을 연구하기 위한 이미징 유세포분석(Imaging flow cytometry)

이 연구는 포유류 세포에서 Godanti Bhasma(GB) 입자의 식세포 처리를 규명하여 세포 흡수, 액포 역학, 산성화 및 분해를 특성화합니다. 이러한 발견은 근본적인 식균작용 메커니즘에 대한 이해를 증진시킬 뿐만 아니라 GB를 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 유망한 모델 시스템으로 확립했습니다.

포유류 세포에서 Godanti Bhasma에 의해 유발된 식세포작용의 순차적 세포 이벤트 탐색

배우세요 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 이용하여 RAW 264.7 대식세포에서 나노입자와 박테리아의 세포 내면화 메커니즘을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 내면화된 입자와 표면 결합 입자를 정확히 구분하여 면역학 및 나노의학 연구에 활용됩니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

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