멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

다중 스펙트럼 이미징 유세포 분석에 의한 나노 입자 및 박테리아의 내재화에 대한 세포 메커니즘을 분석합니다. 대식세포는 액틴 중합을 억제하기 위해 먼저 cyto klain D로 전처리됩니다. 나노 입자 또는 살모넬라균은 대식 세포, 단층에 첨가되고 배양됩니다.

그런 다음 대식세포를 채취하고, 고정하고, 이미지 스트림을 사용하여 분석을 위해 라벨링합니다. 내재화된 나노 입자 및/또는 살모넬라균이 있는 다중 스펙트럼 이미징 유세포 분석기 세포는 표면 결합 나노 입자 및/또는 살모넬라균이 있는 세포와 구별됩니다. 결과 데이터는 살모넬라균과 나노입자가 모두 사이토 클레인으로 처리되지 않은 세포에 의해서만 내재화된다는 것을 나타냅니다.

D는 내재화가 액틴 의존적임을 시사합니다. 이 기술은 유세포 분석 및 컨포칼 현미경과 같은 기존 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 주로 고속으로 서로 다른 세포 특징 간의 형광 신호 강도와 공간 해상도를 정확하게 측정합니다.

이 방법은 생체 재료 백신 및 약물 전달 연구뿐만 아니라 병원체 상호 작용 연구의 호스트에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 폴리 무수물 나노 입자 및 박테리아가 사용하는 내재화 경로를 설명하는 것이 포함됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 종종 어려움을 겪습니다.

최적의 형광 신호를 얻기 위해 염료를 적정하는 데 시간을 할애하는 것이 중요합니다. 또한 소프트웨어에 대해 알아보고 분석 템플릿을 만드는 데는 시간이 걸립니다. 우리는 폴리 하이드로 나노 입자가 현미경 및 기타 기술을 사용하는 동안 병원체 모방 특성을 나타낸다는 것을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다.

그런 다음 분석을 수행하기 전에 살모넬라균과 꽃가루 수소화물 나노 입자가 사용하는 내부화 과정을 비교할 수 있는 고처리량 시스템을 원했습니다. 모든 포유류 및 박테리아 세포 배양을 수확하고 나노 입자 현탁액을 준비해야 합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 confluent RA W2 64.7 세포를 수확하는 것으로 시작합니다.

혈구 분석기를 사용하여 세포 수를 결정합니다. 그런 다음 24웰 배양 접시에 세포를 5배 10의 밀도로 0.5밀리리터 단위로 웰당 5번째 세포로 플레이트화합니다. 완전한 DMEM은 섭씨 37도와 5%CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.

살모넬라균을 준비하기 위해 C-D-M-E-M에서 살모넬라균을 희석하여 16 x 125mm 오토클레이브 스크류 캡 유리 배양관에서 RA W2 64.7개 세포당 100개의 감염 다중성을 얻습니다. 다음으로, 멸균된 유청 종이를 사용하여 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에서 2009년 간행물 및 제약 연구에서 rean 동료들이 설명한 대로 생성된 1% FITC가 적재된 폴리 무수물 나노 입자 5mg의 무게를 잰다. 0.5ml의 차가운 인산염 완충 식염수에 나노 입자를 넣고 얼음 위에 놓습니다.

튜브를 얼음 위에 두십시오. 마이크로 팁이 있는 초음파 액체 처리기를 사용하여 4-6줄에서 약 25초 동안 서스펜션을 초음파 처리합니다. 이제 필요한 모든 세포와 시약이 준비되었으므로 식세포작용 분석을 수행할 수 있습니다.

라벨 24, 첫 번째 플레이트에서 분석을 위해 준비하기 위해 배양된 RA W2 64.7 세포를 포함하는 웰 조직 배양 플레이트. 다음 샘플 각각은 삼중, cyto 및 D와 나노 입자, cyto 및 D와 살모넬라, 매체와 나노 입자, 살모넬라 나노 입자 만있는 매체, 살모넬라 균 만, AF 6 60 염색 세포에서 섭씨 4도 대조군으로 두 번째 플레이트에서 분석되며 이 저온에서 중간 플러스 나노 입자 및 중간 플러스 살모넬라 배양을 포함합니다. 유도 1시간 전에 식세포작용(phagocytosis)과 같은 느린 세포 과정. cyto와 D 및 C-D-M-E-M을 ml당 5마이크로그램을 적절한 웰에 추가하고 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.

배양 후 나노 입자 현탁액을 와류로 만들고 적절한 웰에 10 마이크로 리터를 첨가합니다. 그런 다음 살모넬라균을 소용돌이치고 MOI 100으로 적절한 웰에 추가합니다. 접시를 몇 번 두드려 섞습니다.

그런 다음 샘플 플레이트를 섭씨 37도에, 음극 대조 플레이트를 섭씨 4도에 45분 동안 놓습니다. 배양 후 플레이트를 얼음 위에 놓고 칼슘과 마그네슘이 없는 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 세척하여 오래된 배지를 흡인 및 폐기하여 결합되지 않은 입자, 살모넬라균 및 죽거나 분리된 세포를 제거합니다. 꽃잎 마그네슘 사용.

250마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하고 웰을 부드럽게 긁어내고 수확된 세포를 실리콘화된 스냅 캡 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫팅하여 얼음 위에 보관합니다. 1ml의 차가운 세척 버퍼를 첨가하여 세포를 세척한 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 250배 G로 원심분리합니다. 상등액을 버린 후 종이에 거꾸로 된 마이크로 원심분리기 튜브를 두드려 잔류 버퍼를 제거합니다.

수건으로 시험관 랙을 가로질러 마이크로 원심분리기 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠릿을 다시 매달아 놓습니다. 세포를 고정하려면 PBS에 100마이크로리터의 4% 파라 포름알데히드를 첨가하고 세포를 15분 동안 그대로 두십시오. 실온에서 1ml의 펌 세척 버퍼를 첨가하여 세포를 세척한 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 250배 G로 원심분리합니다.

상등액을 버린 후 이전과 같이 잔류 완충액을 제거합니다. 그런 다음 RA W2 64.7 세포를 염색합니다. 액틴의 경우 Alexa Fluora foid가 함유된 파마 세척 완충액 100마이크로리터를 60분 동안 60회 첨가합니다.

실온에서 염색되지 않은 샘플은 핀이 없는 파마, 세척 버퍼로 배양해야 합니다. 염색 후에, 세포를 세척하고 다시 분리기를 설치하고, 그 후에 1%PFA를 포함하는 PBS의 50 마이크로리터에서 그(것)들을 재현탁시키고 취득까지 4 섭씨 온도에 암흑에서 저장하십시오. 전원을 켜고 이미지를 스트리밍하고 실행합니다.

파일 메뉴에서 유체 역학에 영감을 주고 초기화합니다. 기본 템플릿 로드를 선택합니다. 이미지 갤러리에서 보기 메뉴를 선택하고 모두 선택한 다음 실행 설정을 눌러 비드 이미징을 시작하고, 필요한 경우 코어 추적을 조정하여 이미지를 측면으로 중앙에 배치합니다.

명시야 채널을 선택하고 강도 설정을 클릭합니다. 변동의 유속 계수가 일관되게 0.2% 미만이 될 때까지 기다립니다.보조 탭에서 모두 시작을 클릭하여 교정 및 테스트를 실행하고 소프트웨어에서 모두 통과했는지 확인합니다. load sample을 클릭합니다.

그런 다음 지시가 내리면 가장 밝은 샘플이 들어 있는 바이알을 놓습니다. Sample Loader의 모든 형광 색소를 사용하여 40 x magnification을 선택합니다. 기기 설정이 설정되면 전체 실험에 대해 변경하지 마십시오.

소프트웨어에서 레이저 아이콘을 클릭하여 실험에서 각 레이저를 켜고 각 형광 색소가 산점도에서 측정된 대로 104, 000 카운트 사이의 최대 픽셀 값을 갖도록 레이저 출력을 설정합니다. 원치 않는 개체의 수집을 제거하려면 소프트웨어에서 셀 분류기 창을 클릭하십시오. 그런 다음 셀 데이터만 수집하려면 명시야에 대한 영역 하한 채널 1을 선택하고 값을 50마이크로미터로 설정하면 면적이 50마이크로미터 미만인 물체는 파편으로 간주되어 획득되지 않습니다.

여기에서 소프트웨어에서 해당 채널 아이콘을 클릭하여 수집할 채널을 선택합니다. 채널 1, 2, 3, 4, 5 및 6은 설정 탭에서 선택됩니다. 파일 번호와 대상 폴더를 입력합니다.

시퀀스 번호를 1로 설정하고 획득할 이벤트 수를 5, 000으로 설정합니다. run, acquire를 클릭하여 첫 번째 실험 데이터 파일을 수집하고 저장합니다. FLL을 클릭하고 다음 실험 샘플을 실행합니다.

모든 실험 샘플이 수집될 때까지 반복합니다. 그런 다음 컨트롤을 실행하려면 comp 설정을 클릭합니다. 이렇게 하면 명시야와 산란 레이저가 꺼지고 획득 탭에서 모든 형광 채널을 수집할 수 있습니다.

입력 값을 500으로 변경합니다. 그런 다음 제어 튜브를 놓고 실행을 클릭합니다. 단일 염색 대조군에서 500개의 양성 세포를 수집하기 위해 획득합니다.

실험의 각 형광 색소에 대해 반복하여 보상 매트릭스를 개발합니다. 모든 샘플 이미지를 획득했으면 바탕 화면의 아이디어 아이콘을 두 번 클릭하여 별도의 분석 컴퓨터에서 아이디어 분석 소프트웨어를 실행합니다. 내재화 마법사를 두 번 클릭하고 테스트 샘플 RIF 파일 중 하나를 로드합니다.

팝업 창은 테스트 파일을 로드하기 위한 지침을 제공합니다. 지침에 따라 다음 버튼을 클릭하십시오. 그런 다음 새 매트릭스를 클릭합니다.

그러면 보정 마법사가 시작됩니다. 메시지가 표시되면 단일 색상 컨트롤에 대한 데이터 파일을 선택하여 추가합니다. 보상 매트릭스 파일이 저장되고 내부화 마법사의 2단계에서 상자에 로드될 때까지 마법사를 따라 다음 지침을 따릅니다.

다음을 클릭하고 DAF 파일이 생성될 때까지 지시를 따릅니다. 획득 중에 사용되는 이미지 채널을 선택하여 이미지 표시 속성을 설정합니다. FITC의 경우 채널 2를 클릭하고 AF six 60의 경우 채널 5를 클릭합니다.

명시야(Brightfield) 및 측면 산란(side scatter)이 기본적으로 선택되어 있습니다. 세포 경계를 만들기 위해 명시야 채널 O 1을 선택하고, 단일 세포 집단을 정의하기 위해 내재화 프로브를 위해 나노 입자 또는 박테리아가 수집된 채널 O2를 선택하면 모든 세포의 명시야 영역 대 명시야 종횡비의 산점도가 생성됩니다. 여러 데이터 파일의 높은 처리량 분석에는 템플릿 파일이 필요하므로 템플릿 파일을 만드는 동안 게이트를 신중하게 정의하는 것이 매우 중요합니다.

각 점은 개별 셀 이미지의 값을 나타냅니다. 하나를 클릭합니다. 을 클릭하여 이미지 갤러리에서 해당 특정 셀의 이미지를 선택합니다.

다음으로, 단일 셀 이벤트에 해당하는 면적과 종횡비를 가진 셀 주위에 게이트를 그립니다. 단일 셀의 종횡비는 round one과 doublets입니다. 종횡비는 약 0.5입니다.

여러 세포를 클릭하여 단일 세포와 이중선 또는 파편을 포함하는 영역을 구별합니다. 명시야 구배근의 히스토그램을 생성한다는 것은 명시야 이미지의 제곱을 의미합니다. 다음 버튼을 클릭합니다.

그런 다음 population 탭에서 bin 옵션을 선택하여 선택한 bin을 표시합니다. 빈을 클릭하여 셀과 가장 잘 초점을 맞추는 위치를 결정합니다. 초점을 맞춘 세포를 보행시키기 위해 선 영역을 시작하고 그립니다.

그래디언트 RMS가 높을수록 집중이 잘 되며, 게이트할 다른 얼룩이 없는 한 다음 단계를 건너뜁니다. X축에 있는 채널 2의 강도와 Y축에 있는 채널 2의 최대 픽셀에 대한 새로운 산점도가 생성됩니다. 점을 클릭하고 이미지를 보면 나노 입자 또는 박테리아에 대해 양성인 세포 주위에 그릴 영역을 결정하는 데 도움이 됩니다.

내재화 기능의 히스토그램은 0에서 시작하는 영역으로 생성되며, 이는 이미지를 관찰하여 조정해야 합니다. 내재화 기능은 전체 세포의 강도에 대한 세포 내부의 강도의 비율입니다. 값이 0일 때 강도의 절반이 내부에 있도록 크기가 조정됩니다.

마법사는 세포 표면을 찾기 위해 입력되는 셀 이미지인 마스크를 만들어 내부를 지정하는 각 셀의 영역을 만들고 이를 4픽셀로 침식했습니다. 이 마스크는 필요한 경우 명시야 이미지에 먼저 객체 마스크를 만들고 이를 더 많거나 더 적은 픽셀로 침식하여 다양한 세포 유형에 대해 수동으로 조정할 수 있습니다. 내재화 기능은 소프트웨어의 알고리즘을 사용하여 이 침식된 객체 마스크를 기반으로 계산됩니다.

이 기능을 사용하면 마스크 경계 내에서 대부분의 형광 신호를 갖는 내부화된 입자 및 박테리아와 표면 결합 입자 및 박테리아(이 예에서 볼 수 있듯이 형광 신호의 대부분을 마스크 경계 밖에 있는 박테리아)를 구별할 수 있으며, 침식된 객체 마스크를 기반으로 새로운 내부화 기능이 있는 새로운 히스토그램을 생성할 수 있습니다. 선택한 bin 모드에서 이미지를 확인하여 내부화된 셀에 게이트를 적용할 영역을 그립니다. 게이트를 0.3.Here로 설정합니다.

점수가 0.3 미만인 세포는 표면 결합 입자 양성 세포로 간주됩니다. 배경 라벨링이 있는 세포를 제거하고 내재화된 특정 나노입자 또는 박테리아를 식별하려면 분석 메뉴에서 기능을 선택합니다. 분석 메뉴를 클릭합니다.

그런 다음 옆에 있는 스팟 카운트 기능을 클릭하여 통계 보고서에 평균 스팟 카운트를 추가합니다. 보고서 메뉴에서 보고서 아이콘을 클릭합니다. 그런 다음 통계 보고서를 정의한 다음 열을 추가한 다음 적절한 셀 모집단을 선택합니다.

확인을 클릭합니다. 내재화 마법사는 이 보고서에 통계를 자동으로 추가하여 데이터 파일을 모든 실험 파일의 배치 분석에 사용할 템플릿 파일로 저장합니다. 파일 메뉴를 클릭하고 템플릿으로 저장을 선택합니다.

템플릿 파일. 아이디어 소프트웨어에 있는 다수 자료 파일을 분석하기 위하여 확장 점 AST가 있으십시오. 도구를 클릭하고 배치 데이터 파일을 선택한 다음 모든 RIF 파일을 입력합니다.

해당 섹션에 compensation matrix 파일과 템플릿 파일을 추가하여 처리를 위해 배치를 제출하고 submit을 클릭합니다. 처리 단계 후에 모든 RAF 파일이 분석되고 개별 원시 파일 각각에 대해 DAF 파일이 생성됩니다. 살모넬라균과 나노입자의 식세포작용에 대한 액틴 억제 및 저온의 효과를 비교하기 위해 모든 샘플에 대한 통계가 포함된 최종 보고서가 생성됩니다.

RA W2 64.7 세포는 cyto klain D의 유무에 관계없이 섭씨 37도의 배지에서 배양하거나 섭씨 4도의 배지에서 배양했습니다. 온도와 액틴 조작 모두 나노 입자와 살모넬라균의 내재화를 감소시켰습니다. 그러나 세포와 D에서 세포를 배양하면 표면 결합 나노 입자가 있는 세포의 비율이 증가하는 반면 표면 결합 살모넬라균이 있는 세포의 비율은 감소합니다.

표면 결합 나노 입자에 대해 양성 인 세포의 비율은 섭씨 37도에서 약 8 %에서 세포 및 D 또는 섭씨 4도 처리 후 35 % 이상으로 증가합니다. 대조적으로, 표면 결합 살모넬라균을 가진 세포의 비율은 세포와 D 처리 후 37°C 대조군에 비해 표면 결합 박테리아의 양이 뚜렷하게 증가하지 않고 내재화가 감소한 세포와 D 처리, RA W2 64.7 세포를 섭씨 4도에서 배양한 후 내재화가 감소했습니다. 이러한 데이터는 살모넬라균과 나노입자가 액틴을 필요로 하고 온도에 의존하는 유사한 세포 과정에 의해 내재화되어 있음을 보여줍니다.

더욱이, 데이터는 살모넬라균이 대식세포에 지속적으로 부착되려면 액틴 중합화가 필요하다는 것을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 다중 스펙트럼 이미징 유세포 분석을 통해 나노 입자 및 박테리아의 세포 내재화를 exa하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 억제제가 세포 독성이 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 사용할 최적의 농도를 결정하기 위해 사전 세포 독성 프로파일링 실험이 필요합니다. 살모넬라균에 대한 작업은 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 이 절차를 수행할 때 에어로졸 생성을 피하는 것과 같은 위험한 예방 조치가 될 수 있음을 잊지 마십시오.