이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기 체외

이 절차의 전반적인 목표는 과립구 기능을 두 가지 매개 변수 접근 방식으로 평가하는 것입니다. 이는 먼저 환자의 혈액 샘플에서 과립구를 바이오 입자와 시약으로 배양하여 산화 버스트를 시각화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 배양 후 phagocytosis를 차단한 다음 관심 세포 표면 수용체를 라벨링하여 과립구를 확실하게 식별할 수 있도록 합니다.

궁극적으로, 활성화된 granulocyte subset은 이미지 기반 유세포 분석으로 식별하고 분리할 수 있습니다. 이 방법은 영양 또는 임상 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 식습관 및 영양 관행이 과립구 기능의 변화와 과립구 기능에 어떻게 기여하는지 등을 확인할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Eric Prado입니다.

말초 혈액 샘플이 해동된 후 SIU 바이오 입자와 DHE를 실온에서 추출하고 에틸을 섭씨 37도의 B 수조에서 말라마드한 후 시약이 해동되면 멸균 후드 내의 4개의 개별 1.2ml 튜브에 20마이크로리터의 ssus 바이오 입자를 추가합니다. 그런 다음 해동된 DHE를 40마이크로리터의 바이오 입자가 들어 있는 각 튜브에 넣고 벤치의 튜브를 부드럽게 두드려 튜브 바닥에 시약을 수집합니다. 각 튜브에 100마이크로리터의 혼합 전혈을 추가한 후 면봉 애플리케이터로 튜브 안쪽 가장자리를 따라 오염된 혈액을 제거하고 혈액과 시약을 3주기 동안 설정된 전자 피펫과 혼합합니다.

세 번째 사이클이 끝나면 모든 튜브를 빛으로부터 보호된 얼음 양동이에 넣습니다. 그런 다음 섭씨 37도의 수조에서 10분, 20분 또는 40분 동안 튜브를 배양하여 40분 튜브부터 시작하여 모든 배양이 동시에 완료되도록 합니다. 배양이 끝나면 각 튜브에 15마이크로리터의 에틸 말라메드를 분배합니다.

30분 후, 각각 10마이크로리터의 적절한 항체로 세포를 배양합니다. 한 시간 후 750마이크로리터의 백혈구 고정 적혈구 이가 용액에서 세포를 추가로 배양합니다. 또 한 시간 후, 배양 원심분리, 세포를 흡인하고 상층액을 진공 흡입하여 세포 펠릿 위로 100마이크로리터의 잔류 유체 부피를 남깁니다.

이제 각 샘플에 갓 희석된 7A, d 50마이크로리터의 PBS 및 25마이크로리터의 보정 비드 10마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브에 뚜껑을 씌우고 호일로 싸서 섭씨 4도에서 보관하십시오. 이미지 기반 유세포 분석기가 준비되면 사전 정의된 매개변수를 사용하여 샘플을 분석하기 위해 최소 3000개의 ULU 사이트 이벤트를 수집하는 각 샘플 튜브를 실행합니다.

IDEA 소프트웨어의 자동화된 소프트웨어 보정 마법사를 사용하여 원시 이미지 파일에 보상 매트릭스를 적용하고 보정된 이미지 파일을 생성할 수 있습니다. 그런 다음 IDEA 소프트웨어에서 개별 CIF 파일을 로드하고 다음 플롯을 생성하여 각 환자 샘플에 대한 과립구 부분 집합을 식별합니다. unstimulated control을 참조 표준으로 사용하여 먼저 명시야 구배근 평균 제곱의 히스토그램을 사용하여 초기 게이트를 설정하고 초점이 맞춰진 것으로 간주되는 세포를 식별합니다.

그런 다음 단일항 세포를 파편과 이중항에서 분리하려면 명시야 종횡비와 명시야 영역의 점도표를 만듭니다. 깨끗한 세포 집단이 확인되면 CD 45 대 CD 6 B.To 6의 점도표를 설정하여 CD 45 양성 CD 66 B 양성 과립구를 긍정적으로 식별합니다. 마지막으로, 아우레우스에 대한 밝은 디테일 강도와 산화 버스트에 대한 밝은 디테일 강도에 대한 점도표를 만듭니다.

채널 1과 9의 명시야 이미지, 채널 3의 바이오 입자, 채널 4의 DHE, 채널 5의 7 a a d, 채널 11의 CD 66 B, 채널 12의 CD 45를 수집하는 활성 과립구의 부분 집합을 식별하기 위해 결합된 DHE 및 바이오 입자 이벤트를 묘사하는 2색 오버레이를 생성할 수도 있습니다. 이미지 기반 유세포 분석을 사용하면 활성화된 과립구의 균질한 집단을 세 가지 다른 활성화 subset으로 분리할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 세 개의 subset을 해결하는 가장 효과적인 방법은 phagocytosis 대 oxidative burst에 대한 밝은 세부 강도를 플롯하는 것입니다.

IDEAS 소프트웨어에서 colocalization wizard를 추가로 사용하면 과립구의 동시 식세포작용 및 산화 버스트의 존재를 정량화할 수 있으며, 이는 높은 활성화의 특징적인 신호입니다. 또한 이 실험에서는 40분의 잠복기가 고활성 과립구의 비율이 가장 높았음을 보여주었습니다. 따라서 프로토콜에 최소 3개의 잠복기를 포함하면 주어진 임상 치료가 과립구의 일시적 활성화 상태를 어떻게 변화시킬 수 있는지 쉽게 결정할 수 있습니다.

이 절차에 따라 비드 기반 멀티플렉스 어세이와 같은 다른 방법을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다. 예를 들어, 수피네이트의 GRANULOCYTE 케모카인 생산은 바이오 입자에 노출된 후 어떻게 변화합니까?