형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 형광 나노 입자를 추적자로 사용하여 세포 내 박테리아에 의한 말단 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 8개의 웰 챔버 슬라이드에 heela 세포를 파종하고 밤새 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 세포를 살모넬라균과 타리카균으로 감염시키는 것입니다.

다음으로, 감염된 숙주 세포의 펄스 추적 라벨링은 금 BSA 루민 나노입자로 배양하여 수행됩니다. 마지막 단계는 컨포칼 현미경으로 숙주 세포 엔도솜 시스템의 변화를 관찰하는 것입니다. 궁극적으로 나노 입자의 세포 내 분포 정량화는 MRS 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행됩니다.

면역 현미경과 같은 기존 방법에 비해이 기술의 주요 장점은 n 개의 감염된 세포를 분석한다는 것입니다., 테리카의 세포 내 생활 방식에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나 가이아 종(Gaia species), 엘라 프롤리아(Ella Prolia) 또는 결핵균(mycobacterium tuberculosis)과 같은 다른 세포 내 병원체에도 적용될 수 있습니다. 또한 micro feh, 세포주 또는 일차 세포와 같은 다른 숙주 세포 유형에 적용될 수 있습니다.

10 나노 미터 금 나노 입자 또는 NPS의 합성에는 두 가지 용액 용액 A와 용액 A B.To 용액 A를 준비하고 160 밀리리터의 밀리 Q 물에 2 밀리리터의 1 % 염화 금 수용액을 첨가해야합니다. 8ml의 1%시트르산삼나트륨 이수화물과 160마이크로리터의 1%탄닌산을 32ml의 milli Q 물에 첨가하여 용액 B를 준비합니다. 용액 A와 B를 섭씨 60도로 예열한 다음 저으면서 섞습니다.

약 15분 후에 즉시 짙은 파란색이 관찰되어야 합니다. 이 시점에서 용액이 빨간색이 되어야 합니다. 용액을 섭씨 95도로 가열합니다.

섭씨 95도에서 5분 동안 유지한 다음 용액을 실온으로 식힙니다. 1.5 밀리리터 einor 관으로 금 MPS의 900 마이크로리터를 추가하고 15, 30 분 동안 000 GS에 원심 분리해서 입히고 레테르를 붙이기를 위한 황금 조각을 준비하십시오. 상층액을 버리고 펠릿을 900마이크로리터의 멸균된 MQ 물에 재현탁합니다.

100마이크로리터의 BSA 용액을 넣고 800RPM의 와류에서 30분 동안 혼합합니다. 15, 섭씨 4도에서 60분 동안 000Gs에서 제제를 원심분리하여 과잉 BSA를 제거합니다. 상등액을 버리고 금 BSA NPS와 125마이크로리터의 PBS를 재현탁합니다.

12.5 마이크로 리터의 1 몰 중탄산염을 추가합니다. R domine n hydroxy CIN 에스테르 또는 NHS 용액은 직전에 DMSO에서 제조됩니다. 15 마이크로 리터의 R DOMINE N-H-S-D-M-S-O 용액에서 0.5 밀리리터의 금 BSA NP 현탁액에 사용합니다.

실온에서 2시간 동안 반응을 배양하면서 800RPM에서 혼합하고 빛에 노출되지 않도록 합니다. 다음으로, 정제 후에 36에서 48 시간의 기간 동안 5개의 완충기 변화를 가진 4 섭씨 온도에 PBS에 대하여 투석을 통해 금 BSA rumine NPS를 순화하고, 15에 자유로운 풀어 놓인 BSA Rumine 분리기를 제거하기 위하여 금 BSA RUMINE NPS의 각 1 밀리리터로 B-S-A-P-B-S의 10 마이크로리터를 추가해서 NPS를 안정시키십시오, 섭씨 4도에서 16분 동안 000GS. Resus는 520 나노미터 또는 OD 5 20에서 광학 밀도를 측정한 후 B-S-A-P-B-S 밀리리터당 2밀리그램으로 펠릿을 현탁시킵니다.

금 BSA 막대 Domine NPS를 섭씨 4도에 저장하고, 빛에 노출을 피하고, 이 실험을 위한 세포는 영구히 녹색 형광 단백질에 의하여 표를 붙인 lysosomal glycoprotein 램프 1 GFP를 표현하고 5%carbon 이산화탄소를 포함하는 대기권에 있는 37 섭씨 온도에 10%fetal 송아지 혈청을 가진 DMEM에서 50의 조밀도에 세포를 씨를 뿌려진 배양된다, 8개의 웰 챔버에서 웰당 000개를 슬라이드하고 밤새 배양합니다. 헬라 세포를 감염시키는 박테리아는 인간 위장 병원균인 살모넬라균과 타리카입니다. 비교를 위해 두 가지 돌연변이 균주가 사용됩니다.

세 가지 균주 모두 향상된 GFP의 구조적 발현을 위한 플라스미드를 보유하고 있으며 각 균주에 대한 플라스미드를 유지하기 위해 적절한 항생제와 함께 LB 배지에서 배양됩니다. LB 육수 3ml에 포함된 박테리아 단일 군체에 적절한 항생제를 접종하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 자랍니다. 다음 날 폭기를 위한 동요 조건 하에서, 신선한 LB 국물에 각 배양액 1에서 31을 희석하고 3시간 30분 동안 성장을 계속하십시오.

이 절차를 시작하려면 계대배양 박테리아의 OD 600을 측정하고 0.2의 OD 600으로 희석합니다. PBS 1밀리리터에 A 12 챔버 슬라이드의 헬라 세포에 적절한 양의 박테리아를 첨가하여 100의 감염 다중도를 달성합니다. 세포 배양기에서 30분 동안 배양합니다.

PBS로 헬라 세포를 세 번 세척하여 내재화되지 않은 박테리아를 제거합니다. 이 시점은 감염 후 0시간 또는 0시간 파이로 설정됩니다. 겐타마이신 100마이크로그램을 함유한 300마이크로리터의 신선한 배양 배지를 세포에 추가하고 1시간 동안 유지합니다.

1시간 후. 배지를 겐타마이신 밀리리터당 10마이크로그램을 함유한 이미징 배지로 교체합니다. 금 BSA 반추위 NPS를 헬라 세포에 첨가하여 0.1의 OD 5 20의 최종 농도를 얻습니다.

1시간 후 1시간 동안 배양합니다. 매체를 제거하고 PBS로 세 번 씻습니다. 마지막으로, 10%FCS와 10마이크로그램/밀리리터의 겐타마이신을 함유한 300마이크로리터의 새로운 이미징 배지를 추가합니다.

나머지 배양 시간 동안에는 컨포칼 레이저 스캐닝 또는 가습 환경 챔버 스위치가 있는 회전 디스크 현미경과 같은 컨포칼 이미징 시스템을 사용하여 온도 제어 시스템을 켜고 안정될 때까지 기다리는 등 서로 다른 시점의 세포에 대한 고해상도 이미징을 수행합니다. 배율 스캔, 속도 해상도 및 Z 단계 크기와 같은 이미징 설정을 최적화합니다. 감염 후 표시된 시점에서 GFP 및 금 BSA 반추위 NPS에 대한 적절한 여기 방출 설정을 사용합니다.

감염된 세포가 포함된 A 12 챔버 슬라이드를 현미경 스테이지에 장착하고 이미지를 기록하여 이미지를 분석하고 세포 내 살모넬라균에 의한 엔도솜 시스템의 리모델링을 연구합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 열기를 클릭하고 초과 뷰의 개체 도구 모음에서 파일을 선택하여 데이터를 엽니다.

아이콘을 클릭하여 새 지표면 항목을 추가합니다. 관심 영역 또는 ROI를 분석하려면 관심 영역만 세그먼트화한 후 소스 채널로 다음을 클릭합니다. 채널 3을 선택합니다.

매끄럽게 옵션을 선택하여 결과 영역의 부드러움을 설정합니다. 값을 수동으로 정의하거나 자동으로 생성된 값을 수락합니다. 임계값의 경우.

임계값 조정에 대한 절대 강도 옵션을 선택합니다. 수동 옵션을 선택하고 보기 영역에서 값을 설정합니다. 표면 임계값 미리보기는 회색으로 표시됩니다.

Classifies surfaces(표면 분류) 탭에서 next(다음)를 클릭합니다. 결과 표면은 다양한 기준으로 필터링할 수 있습니다. 기본 필터는 10개보다 큰 V 구멍 수이며, 추가를 클릭하여 다른 필터를 포함할 수도 있습니다.

이 예에서는 기본 필터를 사용하여 표면 생성을 완료합니다. 개체 목록에서 마침을 클릭합니다. 항목 볼륨에 대한 상자를 선택 취소합니다.

이제 새로 생성된 표면이 보기 영역에 표시됩니다. 빨간색에서 저장을 클릭하여 통계를 Excel 파일로 내보냅니다. 이 프로토콜에 의해 합성된 금 NPS는 준 구형이고 크기는 약 10나노미터였습니다.

BSA 코팅 및 rho domine 라벨링은 형태나 크기에 영향을 미치지 않았습니다. 세포 내 살모넬라균에 의한 숙주 세포 엔도솜 시스템의 리모델링을 연구합니다. 헬라 세포는 야생형 살모넬라 균주 또는 2 개의 돌연변이 균주에 모의 감염 또는 감염되었으며 10 나노 미터 금으로 맥박을 추적했습니다.

BSA 막대 도미네 n 완두콩은 감염되지 않은 세포에서 NPS는 후기 엔도솜 또는 리소좀에 균일하게 분포합니다. 이와는 대조적으로, 야생형 살모넬라균에 감염된 세포의 NPS는 감염 후 8시간에 대부분 재배열되었습니다. 살모넬라균 유도 필라멘트 또는 체질의 안정화된 네트워크가 형성되었고, 대부분의 mps는 관 구조 내에 축적된 것으로 발견되었습니다.

돌연변이 균주는 감염 후 8시간 후에 뚜렷한 행동을 보였습니다. SSAV 돌연변이 균주는 VAE 또는 SCV를 포함하는 살모넬라균 내부에 국한되었습니다. 체질이 형성되지는 않았지만, 대다수의 mp는 여전히 sif에 대한 자유 후기 엔도솜 또는 리소좀에 위치했습니다.

살모넬라균이 세포질로 탈출하는 돌연변이 균주가 발생했으며 NPS와 박테리아 간의 연관성은 관찰되지 않았습니다. 살모넬라균 감염의 다양한 단계에서 말단 리소좀 시스템의 접근성을 조사한 결과, 결과는 모든 경우에 대부분의 내재화된 NPS가 이 절차에 따라 SCV 또는 SIF에 축적되었음을 보여줍니다. 다른 방법, 현미경으로 목 전달을 수행할 수 있습니다.

이것은 일부 나노 감염된 숙주 세포의 초미세 구조 또는 막 구획과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형광 나노 입자를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이는 세포 내 살모넬라균에 의해 변형된 호스터 구획을 라벨링하는 데 사용할 수 있습니다.