Name: 형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 배우세요 형광 나노입자를 이용하여 살모넬라가 숙주 세포의 엔도-리소좀 시스템을 재구성하는 과정을 공초점 현미경으로 실시간 관찰하고 MRS 소프트웨어로 정량 분석하는 방법을.

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이 작업은 Deutsche Forschungsgemeinschaft의 지원을 받아 Sonderforschungsbereich 944 'Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments' 및 HE1964/18 in priority program 1580의 지원을 받았습니다.

10 nm의 금 나노 입자 (골드 NP에) 15 1. 합성 <ol><li> 솔루션을 준비 : 160 ml의 밀리-Q, 또는 두 번 증류 물에 2 ml의 1 % 수성 금 염화을 추가합니다. </li><li> 용액 B를 준비 : 32 ml의 밀리-Q, 또는 두 번 증류 물에 8 ml의 1 % 트라이 구연산 나트륨 × 2 H 2 O 160 ㎕의 1 % 타닌산을 추가합니다. </li><li> 60 ° C에 용액 A와 B를 따뜻하게하고 교반하면서 그들을 섞는다. 바로 다크 블루 색상을 관찰합니다. 약 15 분 후 붉은 색을 관찰한다. 그 후, 95 ° C까지 가열 5 분을 유지하고 RT에 대한 해결책을 냉각. </li><li> 탄소 코팅 격자에 NP 현탁액의 드롭을 추가하고 공기를 건조 할 수 있습니다. 투과형 전자 현미경으로 된 NP의 크기 및 형태를 확인한다. </li></ol> 로다 민 N-히드 록시 숙신 에스테르 (NHS)와 BSA와 레이블 골드 NP에 2. 코팅 (16) <ol><li> 30 분 동안 15,000 XG에 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 900 μL에게 원심 분리기를 금 NPS를 추가합니다. 연산전통적, 5 월 한 번에 여러 개의 튜브를 준비합니다. </li><li> 900 μL의 펠렛 살균 밀리 Q 물을 다시 중단하고 100 μL 2 ㎎ / ㎖ BSA / PBS를 추가, 상층 액을 버리고 30 분 동안 800 rpm으로 소용돌이에 섞는다. </li><li> 초과 BSA를 제거하려면 60 분 동안 15,000 XG에서 준비를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고, 125 μl의 PBS에서 금 BSA NPS를 다시 일시 중지, 1 M 중탄산 12.5 μl를 추가합니다. </li><li> 즉시 사용하기 전에, 로다 민 NHS / DMSO의 10 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 금 BSA NP에 현탁액 1ml를 할 로다 민 NHS / DMSO 용액 30 μl를 추가합니다. 빛에 노출을 피하고, 800 rpm으로 혼합 동안 실온에서 2 시간 (또는 O / N)에 대한 반응을 품어. </li><li> 48 시간 - 36의 기간 동안 5 버퍼 변경 4 ºC에서 PBS에 대한 투석을 통해 금 BSA-로다 민 NPS를 정화. </li><li> , NPS를 안정화 각 1 ml의 금 BSA-로다 민 NP에에 200 ㎎ / ㎖ BSA / PBS의 10 μl를 추가합니다. 15, 무료 또는 BSA-로다 민 발표 원심 분리기를 제거하려면,60 분 동안 000 XG. 빛에 대한 노출을 피하기 위해, 4 ° C에서 OD (520), 및 저장소를 측정, 2 ㎎ / ㎖ BSA / PBS에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 밀리-Q 또는 더블 증류수로 NP에 10 배 희석, 탄소 코팅 격자 상에 드롭을 추가하고, 공기를 건조 할 수 있습니다. 투과 전자 현미경 (TEM)으로 NP에의 크기 및 형태를 확인한다. 주 : NP 제제에서 사용되는 모든 재료는 멸균시키고, 동작은 세포 배양 후드에서 화염 또는 옆 벤치에 행 하였다. </li></ol> HeLa 세포 3. 문화 <ol><li> 영구적 LAMP1-GFP를 발현하는 HeLa 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FCS)와 DMEM에서 배양하고, 5 % CO 2를 함유하는 분위기하에 37 ℃에서 성장된다. </li><li> 8 잘 챔버 슬라이드 (Ibidi)에서 잘 50,000의 밀도로 세포를 종자 및 / N을 O를 품어. </li></ol> 박테리아 4. 문화 <ol><li> 사용 살모넬라 엔테 혈청 형 Typhimurium의 NCTC 12023 줘야D 타입 (WT) 변형. 비교를 위해, SIF에 대한 키 이펙터 시파 부족 SPI2-T3SS 및 Δ 시파에서 Δ ssaV 결함이있는 돌연변이 균주를 사용합니다. 강화 된 GFP의 구성 적 발현 플라스미드 pFPV25.1을 품고 균주를 사용합니다. 참고 : 세균 균주가 50 ㎍ / ㎖의 카르 베니 실린 및 / 또는 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신 (Δ ssaV, Δ 시파의 추가와 함께 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린 (WT)와 LB의 추가와 함께 (LB) 루리아 - 베르 타니 국물에 일상적으로 배양 )의 플라스미드를 유지하는 데 필요한. </li><li> 다음 신선한 LB에 1:31 희석 3.5 시간 동안 성장을 계속, 적절한 항생제로 3 ㎖ LB에서 박테리아의 단일 콜로니를 접종하고 폭기 진탕 조건에서 37 ºC에서 / N을 O 성장. 이 시간 시점에서 배양 후반 로그 상에 도달하고 박테리아 매우 침습적이다. '롤러 드럼'폭기 테스트 튜브 문화를 배양하는 것이 편리하다. </li></ol> HeLa 세포의 감염에 의해 5.살모넬라 균과 골드 BSA-로다 민 NPS는 체이스 - 라벨 (방식에 대한 그림 1 참조) 펄스 <ol><li> 계대 배양 균의 OD (600)를 측정하고 1 ㎖의 PBS (~ 3 × 108 CFU / ㎖) 600 = 0.2 중독 묽은의 다양성을 달성하기 위해 8 웰 챔버 슬라이드에서 HeLa 세포에 박테리아의 적당량을 추가 감염 100 (MOI). </li><li> 비 내면화 박테리아를 제거하기 위해 PBS로 3 회, 세포 배양기에서 30 분 동안 인큐베이션 세척 (이 시점을 0 시간의 감염 후, 0 시간 또는 파이로 설정 하였다). 100 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 함유하는 신선한 배지 300 μl를 추가하고 1 시간 동안 유지한다. 그런 다음 배양 시간의 나머지 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 새로운 매체와 매체를 교체하십시오. </li><li> 1 시간 동안 100 ㎍ / ㎖의 젠타 마이신을 함유하는 배양 배지로 배양 한 후, 배지는 공동 (30 mM의 HEPES, pH가 7.4, FCS, L 글루타민, 페놀 레드 및 중탄산 나트륨없이 이글스 MEM) 매질을 묘화로 대체10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 ntaining. 골드 BSA-로다 NPS는 OD = 0.1 (520)의 최종 농도를 얻기 위해 HeLa 세포에 첨가 하였다. 참고 : 골드 BSA-로다 민 NPS는 또한 감염 전에, 또는 다양한 시간 포인트 파이에서 세포에 첨가 할 수있다 </li><li> 1 시간 배양 한 후, 배지를 제거 PBS로 3 회 세척하고, 배양 시간의 나머지 10 % FCS 및 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 새로운 영상 매체의 300 μl를 추가합니다. 참고 : 배양 기간이 사용 된 NP 및 세포주의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. RAW264.7 대 식세포를 위해, 우리는 충분히 내재화 허용 OD 520 = 0.05의 농도로 된 NP와 그 30 분의 인큐베이션을 관찰했다. </li></ol> 6. 이미징 <ol><li> 서로 다른 시간 지점에서 고해상도 이미징을위한 가습 환경 챔버와 공 초점 레이저 주사 (CLSM) 또는 회전 디스크 (SD) 현미경으로 공 초점 이미징 시스템을 사용합니다. </li><li> 온도 C에 스위치가 안정 될 때까지 시스템을 조작부 기다립니다. 이러한 확대, 스캔 속도, 해상도, Z-스택 등 GFP에 적합한 여기 / 방출 설정을 사용하여 금 BSA-로다 민 NP에 같은 이미지 설정을 최적화합니다. 이 프로토콜의 경우, 512 X 512 픽셀의 400 Hz의 스캔 속도, 해상도 및 0.25 μm 인 Z-스텝 크기를 사용한다. GFP 각각 아르곤 레이저 (488 nm의)와 헬륨 네온 레이저 (543 nm의)를 사용하여 금 BSA-로다 민을 흥분. 세포의 형태를 관찰하기위한 명 시야 (BF) 채널을 포함. 현미경 시스템 및 다른 감염 조건의 경우, 설정은 적절하게 조정되어야한다. 참고 사진 승수 (PMT) 검출기로 검출 된 BF 채널과 신호의 광원과 같은 아르곤 레이저를 사용합니다. </li><li> 표시된 시간 - 점에서 PI, 스테이지 현미경 및 기록 이미지에 감염된 세포를 함유하는 8 웰 챔버 슬라이드 마운트. </li></ol> 이미지 7. 분석 <ol><li> 현미경 이미지 분석 소프트웨어를 사용 (참조 살모넬라 균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 개조를 분석합니다. '열기'를 클릭하고 파일을 선택하여 데이터를 엽니 다. 참고 : 또한, 같은 ImageJ에 나 피지 같은 오픈 소스 소프트웨어 패키지 양적 이미지에 사용될 수있다 분석한다. </li><li> 아이콘 뷰를 능가 클릭의 개체 도구 모음에서 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg"> 새로운 표면 항목을 추가 할 수 있습니다. 에 클릭 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg"> (다음). </li><li> 관심 (ROI)의 지역을 선택 세그먼트 ROI를 분석합니다. 보기 영역에서 이미지 위에 겹쳐 사각형 테두리가 절에서는 투자 수익 (ROI)을 대표한다. Y-, 해당 x 축에 값을 입력하고 Z- 필드 또는 직접 크기와 ROI의 위치를​​ 변경하려면 미리보기 사각형에 화살표를 클릭합니다. 다음을 클릭합니다 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src> = "/ 파일 / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg"/&gt; (다음). </li><li> 소스 채널로 선택 채널 3 (금 BSA-로다 민 NP에 대한 신호). 결과 영역의 부드러움을 설정하는 부드러운 옵션을 선택합니다. 수동으로 값을 정의 또는 자동으로 생성 된 값을 적용합니다. 임계 값의 경우, 절대 강도 옵션을 선택합니다. </li><li> 임계 조정 용의 옵션을 선택하고 값을 설정. 보기 영역에서, 표면 임계 미리보기가 회색으로 표시됩니다. </li><li> 탭 분류 표면에 생성 된 표면은 여러 기준에 의해 필터링 할 수 있습니다. 기본 필터는 다른 필터 '복셀&gt; (10)의 수'는 '추가'를 클릭하여 포함시킬 수있다. 필터링이 필요없는 경우, 삭제 버튼을 클릭하여 모든 필터를 삭제합니다. 클릭 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg"> (다음). </li><li> 표면 생성을 완료하려면 클릭/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg은 "/&gt; (마침). 개체 목록에서 지금 확인되지 않은 항목의 볼륨 및 새로 생성 한 표면의 상자 것은보기 영역에 표시됩니다. </li><li> 통계를 내 보냅니다. 이제 능가보기에서 대상의 색상은 지역에 따라 보라색에서 빨간색으로 변화한다. 그리고 '플롯 번호 영역'표는 통계 정보 (예를 들어, ID 번호와 객체의 영역)를 보여줍니다. 클릭하여 Excel 파일을 사면 (1)의 모든 통계를 내 보냅니다 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg"> (저장). </li></ol>

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

포유류 세포의 엔도 리소좀 시스템은 영양소 흡수, 호르몬 - 매개 신호 전달, 면역 감시 및 항원 제시 (17)과 같은 중요 생리 학적 과정을 제어한다. 지금, 마커의 다양한 세포 내 이입 경로 및 추적 연구의 표지에 사용 된 최대. 예를 들어, LysoTracker 프로브는 선택적으로 낮은 내부 pH가 세포 구획에 축적하고 효과적으로 나노 몰 농도 18 살아있는 세포에 레이블을 지정할 수 있습니다 리소좀 라벨링에 대한 분자 프로브 (생명 기술, USA)에 의해 개발 된 형광 acidotropic 프로브입니다. 그러나, 세포 LysoTracker 프로브의 긴 시간 배양 리소좀 pH의 증가를 유도하고 리소좀 (19)의 잠재적 인 생리적 변화가 발생할 수 있습니다. 이러한 형광 표지 된 덱스 트란과 같은 일부의 생체는 자주 엔도 / 리소좀 라벨에 사용된다. 그러나, 낮은 광 안정성, 짧은 순환 수명, P주시를 OOR 유지 장기 라이브 세포 이미징에 응용 프로그램을 방해하고...

등의 금속 NP에, 양자점, NP는 폴리머, 실리카 NP는, 탄소 도트 포함한 형광 나노 입자 (NPS는), 지난 수십 년 동안 1,2- 상당한 주목을 받고있다. 기존의 유기 염료에 비해 형광 NPS는 이러한 강한 신호 강도 photobleaching에 저항과 높은 생체 적합성과 같은 3,4- 바람직한 화학적, 광학적 및 기계적 특성을 보여준다. 이러한 장점은 그 세포 내 감지 및 라이브 세포 이미징에 대한 선택의 방법합니다. 또한, 전자 밀도가 된 NP의 다양한 EM 5 초 미세 수준에서 광학 현미경 (LM)과 높은 해상도로 추적 라이브 셀의 조합을 할 수 있습니다 상관 현미경 분석에 대한 사용을 촉진, 전자 현미경 (EM)로 볼 수 있습니다. 예를 들어, 금 NPS는 효율적 민감한 진단 살아있는 세포뿐만 아니라 면역 표지 (6)의 분야에서 바이오 센서로서 사용 장시간왔다. 최근의tudies 다른 크기 및 형상 골드 NPS에서 세포주 많은 다양한 흡수는 일상적 엔도 좀 경로를 통해 운송, 따라서 큰 잠재력의 존재는 세포 내 소포 반송 추적 및 엔도 리소좀 시스템 라벨링 적용될 용이하게 할 수 있음을 나타내 7,8 . 살모넬라 엔테, 시겔 flexneri 및 리스테리아 균 등의 미생물 병원균, 비 식세포 숙주 세포 9 침입하는 다른 메커니즘을 개발했습니다. 내면화 한 후, 병원균, 중 세포질에 지역화 또는 막 결합 구획에 압수은, 자신의 호스트 환경과 상호 작용하고 자신의 생존 (10)를 선호하는 이들을 조절. 예를 들어, 살모넬라 엔테는 상주하며 세포 내 phagosomal 구획 감염 11시 살모넬라 함유 공포 (SCV)를 지칭 내에서 복제합니다. 성숙 SCV, 골지체으로 트래픽 세포 내 이입 경로와 지속적으로 상호 작용을 진행하고, 살모넬라 유도 된 필라멘트와 같은 광범위한 관상 구조, (SIF), 넥신 세관 정렬, 살모넬라 유도 된 분비 캐리어 막 단백질 3 (SCAMP3) 세관 등의 형성을 유도 . 12 ~ 14. 이러한 병원성 세균이 숙주 세포 경로를 조작하는 방법을 공부하는 것은 이해 감염성 질환에 필수적이다. 여기서, 금 BSA-로다 된 NP는 숙주 세포 엔도 리소좀 시스템에 라벨 유체 추적자로 사용하여, 인간의 위장관 병원체 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움 (살모넬라)와 병원체의 상호 작용을 연구하는 모델 박테리아로서 사용 세포 내 이입 통로를 개최. WT 살모넬라 돌연변이 균주에 감염된 비감염 세포와 세포에서의 세포 내 금 BSA-NP에 로다는 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)에 의해 촬영 하였다.이어서 Imaris 소프트웨어는 살모넬라 감염 엔도 좀 / 리소좀 극단적 재 배열을 유도 나타내는 NPS에서의 분포를 정량화하는 데 사용되었다. 이 방법의 설명에 이어, 유사한 실험은 내재화 된 NP의 장기 거동을 추적 및 진핵 세포의 세포 내 이입 경로에 다양 외인성 또는 내인성 인자 물질의 영향을 조사하기 위해 설계 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>염화 금</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>, 520918</td><td></td></tr><tr><td>타닌산</td>, <td>시그마-알드리치,</td><td>403040</td><td></td></tr>, <tr><td>시트르산 삼나트륨</td>, <td>시그마</td><td>C8532</td><td></td></tr>, <tr><td>소 혈청 알부민</td>, <td>시그마</td><td>A2153</td><td></td></tr>, <tr><td>NHS-로다민</td><td>피어스</td>, <td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td>, <td>시그마</td><td>D8418</td><td></td></tr>, <tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>Kanamcyin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>8웰 챔버 슬라이드</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>조직 배양 처리, 멸균</td></tr><tr><td>Imaris 소프트웨어</td><td>Bitplane</td><td>버전 7.6</td><td>다양한 구성 사용 가능</td></tr></tbody></table>

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

바람직한 화학, 광학 및 기계적 특성을 가진 형광 나노 입자 (NPS는) 세포 내 소기관에 레이블 유망한 도구입니다. 여기서, 우리는 진핵 세포의 엔도 리소좀 시스템 라벨과 세포 내 병원체 살모넬라 엔테 의해 호스트 세포질 통로의 조작을 모니터링하기 위해 골드 - 로다 BSA NPS를 이용하는 방법을 소개한다. NPS는 용이 늦은 엔도 솜 / 리소좀으로 HeLa 세포에 의해 내부화 된 및 집중 하였다. 살모넬라 감염 Salmonella- 유도 막 구조체 및 소포 및 축적 된 NP의 재 배열을 유도. 우리는 공 촛점 현미경 이미지의 정량적 분석을 위해 Imaris 소프트웨어 패키지를 배포. 개체의 개수 및 비감염 세포에서 크기 분포가 매우 WT 살모넬라 엔도 리소좀 시스템의 개장 나타내는 살모넬라 -infected 세포들로부터 구별 하였다.

골드 NPS는 구연산과 타닌산에 의해 염화 금산의 감소를 통해 확립 된 방법을 통해 생성되었다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 합성 금 NPS는 약 10 nm의 크기와 모양에 준 구형이다. BSA 코팅 및 로다 민 - 라벨은 형태 나 크기 (그림 2B)에 영향을 미치지 않았다. 이것은 금 NP에 용이 다양한 포유 동물 세포에 의해 흡수 및 세포 내 이입 시스템 (7)에서 종료 할 수 있다고보고되었다. 기존의 연구에 따르면, 밝은 적색 형광 신호는 세포의 NP에 효과적으로 내재화를 나타내는, 금 BSA - 로다 민 NP는 (도 3, WT 5 열연 PI)와 함께 1 시간 배양 후 HeLa 세포에서 관찰되었다. 빨간 신호의 대부분은 국민 연금이 늦게 엔도 솜 또는 리소좀에 국한되었다는 것을 보여주는, 녹색 신호와 colocalized 발견되었다. 그러나 후반 엔도 솜 /...

이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다.

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

이 절차의 전반적인 목표는 형광 나노 입자를 추적자로 사용하여 세포 내 박테리아에 의한 말단 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 8개의 웰 챔버 슬라이드에 heela 세포를 파종하고 밤새 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 세포를 살모넬라균과 타리카균으로 감염시키는 것입니다.다음으로, 감염된 숙주 세포의 펄스 추적 라벨링은 금 BSA 루민 나노입자로 배양하여 수행됩니다. 마지막 단계는 컨포칼 현미경으로 숙주 세포 엔도솜 시스템의 변화를 관찰하는 것입니다. 궁극적으로 나노 입자의 세포 내 분포 정량화는 MRS 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행됩니다.면역 현미경과 같은 기존 방법에 비해이 기술의 주요 장점은 n 개의 감염된 세포를 분석한다는 것입니다., 테리카의 세포 내 생활 방식에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나 가이아 종(Gaia species), 엘라 프롤리아(Ella Prolia) 또는 결핵균(mycobacterium tuberculosis)과 같은 다른 세포 내 병원체에도 적용될 수 있습니다. 또한 micro feh, 세포주 또는 일차 세포와 같은 다른 숙주 세포 유형에 적용될 수 있습니다.10 나노 미터 금 나노 입자 또는 NPS의 합성에는 두 가지 용액 용액 A와 용액 A B.To 용액 A를 준비하고 160 밀리리터의 밀리 Q 물에 2 밀리리터의 1 % 염화 금 수용액을 첨가해야합니다. 8ml의 1%시트르산삼나트륨 이수화물과 160마이크로리터의 1%탄닌산을 32ml의 milli Q 물에 첨가하여 용액 B를 준비합니다. 용액 A와 B를 섭씨 60도로 예열한 다음 저으면서 섞습니다.약 15분 후에 즉시 짙은 파란색이 관찰되어야 합니다. 이 시점에서 용액이 빨간색이 되어야 합니다. 용액을 섭씨 95도로 가열합니다.섭씨 95도에서 5분 동안 유지한 다음 용액을 실온으로 식힙니다. 1.5 밀리리터 einor 관으로 금 MPS의 900 마이크로리터를 추가하고 15, 30 분 동안 000 GS에 원심 분리해서 입히고 레테르를 붙이기를 위한 황금 조각을 준비하십시오. 상층액을 버리고 펠릿을 900마이크로리터의 멸균된 MQ 물에 재현탁합니다.100마이크로리터의 BSA 용액을 넣고 800RPM의 와류에서 30분 동안 혼합합니다. 15, 섭씨 4도에서 60분 동안 000Gs에서 제제를 원심분리하여 과잉 BSA를 제거합니다. 상등액을 버리고 금 BSA NPS와 125마이크로리터의 PB

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Zhang, Y., et al. 세포내 박테리아에 의한 엔도-리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위한 형광 나노입자의 적용. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 세포내 박테리아에 감염된 인간 상피 세포에서 엔도-리소좀 리모델링을 시각화하기 위해 형광 나노입자를 사용하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 침입 후 병원체는 숙주 세포골격과 엔도-리소좀 시스템을 조작하여 소포 수송을 변경하는 관형 돌출부가 있는 액포를 형성합니다. 그런 다음 형광 표지된 나노입자를 사용하여 이러한 변화를 추적하여 병원체 유발 세포내 트래피킹 사건의 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

세균에 감염된 세포에서 엔도-리소좀 리모델링의 나노입자 매개 시각화

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

이 기사에서는 두 가지 프로토콜을 제시합니다: 하나는 숙주 내에서 성공적으로 침입하여 생존할 수 있는 혐기성 박테리아를 측정하기 위한 것이고, 다른 하나는 숙주 세포와 상호 작용하는 혐기성 박테리아를 시각화하기 위한 것입니다. 이 연구는 모든 배양 가능한 혐기성 및 모든 진핵 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

이 문서는 단백질 세포 외 지역화 역학을 조사하고 바실러스 subtilis 및 황색 포도상 구균에 있는 고분해능 형광 현미경 검사법을 사용하여 형태학적 인 변화를 감시하기 위하여 단계별 가이드를 제공합니다.

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

재활용 내분은 내피 관 네트워크의 일부입니다. 여기서는 GFP-STX13을 세포구마커로 사용하여 재활용 내종의 역학을 정량화하는 방법을 제시합니다.

SNARE 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석하는 현미경 기반 분석

원형질막에서 트랜스-골지체 네트워크로의 단백질의 엔도사이틱 및 역행성 수송은 막 항상성을 유지하고 신호 전달을 조절하는 데 필수적입니다. 여기에서는 HeLa 세포에서 유도체화된 항-GFP 나노바디를 사용하여 살아있는 세포 현미경으로 막관통 화물 단백질의 엔도사이틱 수송을 이미지화하고 정량화하는 방법을 설명합니다.

배양 세포에서 기능화된 나노바디를 사용한 엔도사이틱 수송의 생세포 이미징

우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘​​플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

배우세요 형광 나노입자를 이용하여 살모넬라가 숙주 세포의 엔도-리소좀 시스템을 재구성하는 과정을 공초점 현미경으로 실시간 관찰하고 MRS 소프트웨어로 정량 분석하는 방법을.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

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