미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

이 절차의 전반적인 목표는 3D 세포 배양 시스템을 위한 모듈식 하이드로겔 시트의 간단한 제작, 조작 및 조립을 시연하는 것입니다. 이 방법은 배양된 미세환경을 사용하여 생체 내와 같은 기능적 엔지니어링 조직을 더 많이 만드는 방법과 같은 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비용이 많이 드는 증분 없이 세포 하이드로겔 구조를 생성할 수 있다는 것입니다.

3D 세포 배양 조건은 각 모듈식 하이드로겔 시트에 따라 다릅니다. 이 기술의 의미는 3D 세포 미시 및 거시 환경의 다양한 기하학적 및 구성을 제공할 수 있기 때문에 향상된 세포 기반 분석 및 생물학적 연구로 확장됩니다. 이 방법은 체외 세포 기반 분석에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 3D 조직 모델의 이식 가능한 골격과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 원하는 마이크로스케일 패턴을 생산하는 것으로 시작합니다. 이 비디오에 표시된 예는 여기에 표시된 것과 같은 간 소엽과 같은 메쉬 패턴을 사용합니다. 다음으로 PDMS 2.5g과 경화제 용액 2.5g의 무게를 측정하고 성분을 철저히 혼합합니다.

진공 챔버에서 용액의 가스를 제거한 다음 혼합 용액을 호일 주조 접시 내에서 실리콘 웨이퍼의 마이크로 패턴 표면에 고르게 펴 바릅니다. 다음으로, 접시를 섭씨 65도로 가열된 접시의 평평한 표면에 90분 동안 놓아 PDMS를 경화시킵니다. 경화되면 주조 접시에서 PDMS를 제거하고 실리콘 웨이퍼에서 조심스럽게 벗겨냅니다.

PDMS의 가장자리를 잘라내고 패턴이 있는 부분을 100mm 직경의 페트리 접시에 올려 마이크로 패턴 면이 위를 향하도록 합니다. 그런 다음 마이크로 패턴화된 PDMS를 70% 에탄올로 세척한 다음 증류수로 세척하여 1차 멸균합니다. 그런 다음 섭씨 10도의 오븐에서 65분 동안 설정을 완전히 건조시킵니다.

다음으로, 마이크로 패턴화된 PDMS 몰드를 플라즈마 클리너에 넣고 친수성 표면을 만들기 위해 1분 동안 청소합니다. 이것은 수성 액체의 로딩을 용이하게 할 것입니다. 그런 다음 Table of Materials에 나열된 계면활성제 용액 100ml로 PDMS 표면을 코팅합니다.

실험실용 로커에서 샘플을 최소 3시간 동안 배양합니다. 다음으로, PDMS 금형의 계면활성제 용액을 멸균수를 사용하여 세척하고 섭씨 65도의 오븐에서 10분 동안 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 각 미세 패턴 곰팡이를 30분 동안 자외선에 노출시켜 살균합니다.

표준 기술을 사용하여 hepg2 세포를 배양하는 것으로 시작합니다. 세포가 70%에서 80% confluent가 되면 PBS를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 05%tripsin edta 1밀리리터를 첨가하고 섭씨 37도에서 4분 동안 배양하여 세포를 수확합니다.

분리되면 원심분리 튜브에 세포를 모아 250g에서 3분 동안 펠릿화합니다. 상등액을 제거한 다음 PBS 1밀리리터에 세포를 재현탁합니다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 PBS에 분포된 단일 셀의 수를 계산합니다.

그런 다음 250g에서 3분 동안 세포를 다시 펠릿화합니다. PBS 상등액을 제거하고 최종 파종(seeding) 밀도가 밀리리터당 500만 세포에서 1000만 세포 사이가 되도록 알긴산나트륨 용액을 세포에 충분히 첨가합니다. 피펫을 사용하여 세포 용액을 부드럽게 혼합한 다음 섭씨 37도의 5% CO2 가습 인큐베이터에서 셀 하이드로겔 현탁액을 배양합니다.

세포가 배양하는 동안 마이크로 패턴화된 PDMS 몰드를 플라즈마 클리너에 넣고 85와트에서 1분 동안 세척하여 친수성 표면을 만듭니다. 셀 하이드로겔 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 다음 금형의 마이크로패턴 가장자리에 7.2마이크로리터의 현탁액을 꾸준히 로드합니다. 그런 다음 가교 시약의 미스트를 가습기와 함께 시간당 250ml의 속도로 생성하고 5분 동안 하이드로겔 전구체에 분무하여 셀 하이드로겔 현탁액을 겔

이 절차가 5cm 범위 내에서 PDMS 금형의 지형 표면을 덮는지 확인합니다. 가교 과정에 따라 가습기를 끄고 PDMS 금형에 PBS를 채웁니다. 200마이크로리터 피펫을 사용하여 경화된 하이드로겔 시트의 가장자리 주위에 PBS를 부드럽게 분사하여 각 하이드로겔을 분리합니다.

그런 다음 엔드 컷 1, 000 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 각 플로팅 하이드로 겔 시트를 집어 올립니다. 하이드로겔의 각 시트를 1밀리리터의 예열된 DMEM이 포함된 12웰 플레이트의 개별 웰로 옮겨 매체 표면에 떠오르도록 합니다. 이와 같이 세포를 일주일 동안 배양하고 격일로 배양 배지를 교환합니다.

다음으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 하단 표면에 170미크론 높이의 기둥 구조를 포함하는 PDMS 프레임을 생성합니다. 제작하는 동안 PDMS 프레임용 실리콘 웨이퍼에 특수 폴리카보네이트 몰드를 배치하여 너비 8mm, 높이 9mm, 깊이 2mm의 내부 프레임을 만듭니다. 멸균이 완료되면 PDMS 프레임을 60mm 페트리 접시에 담긴 나일론 여과지 1/4 조각에 놓습니다.

인큐베이터에서 하이드로겔 시트를 제거하고 엔드컷 1, 000마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 첫 번째 모듈식 하이드로겔 시트를 PDMS 프레임 내부로 옮깁니다. 빈 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 모듈식 하이드로겔 시트의 가장자리를 PDMS 프레임에 맞춥니다. 4-6개의 층이 쌓일 때까지 추가 하이드로겔 시트로 이 과정을 반복합니다.

다음으로, PDMS 프레임 하단의 기둥 구조를 통해 배양 배지를 통과시켜 제거합니다. 그런 다음 다층 구조의 한쪽 모서리에 2 % 알긴산 용액 2 마이크로 리터를 추가합니다. 가습기를 사용하여 시간당 250밀리터의 속도로 가교 시약의 미스트를 다층 구조물에 30초 동안 분사하여 각 층의 가장자리를 함께 부착합니다.

그런 다음 400마이크로리터의 DMEM으로 다층 구조를 부드럽게 헹구고 핀셋을 사용하여 PDMS 프레임을 제거합니다. 그런 다음 4ml의 DMEM을 추가로 추가합니다. 셀 리프터로 부드럽게 닦아 여과지가 있는 다층 구조를 분리한 다음 여과지를 사용하여 3밀리리터의 DMEM이 들어 있는 6웰 플레이트로 옮깁니다.

하이드로겔 구조체를 사용하여 최소 1주일 동안 6-well 플레이트에서 다중 스케일 세포 스캐폴드로 부유 방식으로 세포를 배양합니다. 격일로 배양 배지를 교환하십시오. 간 소엽과 같은 마이크로패터된 하이드로겔 시트를 층별로 조립한 결과가 여기에 나와 있으며, 녹색으로 형광을 발하는 인간 간암 세포와 적색 형광을 발하는 NIH-3T3 섬유아세포가 결합된 메쉬에서 공동 배양으로 함께 성장했습니다.

여기에 제시된 기술을 사용하여 육각형 기둥, 얇은 메쉬, 전체 어레이 및 100-200 마이크로 미터 정도의 얇은 하이드로겔 구조 형태의 여러 마이크로 콤 모양의 마이크로 섬유를 포함하여 많은 패턴 변형을 만들 수 있습니다. 이러한 구조는 다양한 세포 유형에 풍부한 3D 배양 환경을 제공합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 in vivo와 유사한 3D 배양 시스템 엔지니어링을 위한 세포 하이드로겔 시트를 아래에서 위로 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.