Name: 미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T10:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 학습하세요 조직공학을 위한 모듈형 하이드로겔 시트 제작 및 조립 방법을. 이 기술은 비용 효율적인 3D 세포 배양 환경을 구축하여 생물학 연구와 세포 기반 분석을 개선합니다.

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본 연구는 미래창조과학부 연구지원으로 한국연구재단의 국가선도연구연구소 프로그램(NRF-2013R1A2A1A05006378)의 지원을 받았다. 저자는 또한 KAIST 시스템 헬스케어 프로그램을 인정합니다.

미세 패턴 금형 및 히드로 겔 1. 준비 <ol><li> PDMS 몰드 주조 표준 두 단계의 포토 리소그래피 기술에 15,17 통해 실리콘 웨이퍼의 표면에 포토 레지스트 SU-8을 사용하여 목적하는 마이크로 규모의 패턴을 생성한다. 도시 된 예에서는 간 소엽 형 메시 패턴 (도 1)를 사용한다. </li><li> 1의 비율로 PDMS와 경화제 용액을 체중 : 5 (즉, PDMS 12.5 g과 경화제 2.5 g). </li><li> 철저 용액 15g을 혼합, 진공 챔버 내에서 기포를 탈기하고 고르게 포일 캐스팅 접시 내에 실리콘 웨이퍼의 표면에 미세 패턴이 혼합 용액을 확산. </li><li> PDMS를 치료하는 평평한 표면에 90 분 동안 65 ℃로 가열 판에 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. </li><li> 주조 요리와 실리콘 웨이퍼로부터 경화 된 PDMS를 제거합니다. </li><li> PDMS의 가장자리를 잘라 100 mm 직경의 페트리 접시에 배치미세 패턴면을 위로. </li><li> 차 살균을 위해 70 % 에탄올 및 증류수를 사용하여 배양 접시에 마이크로 패턴 경화 된 PDMS를 씻으십시오. 그 후, 65 ° C의 오븐에서 10 분 동안 완전히 건조한다. </li><li> 도포 액 (/ V W) 3 %를 생성 녹이고 100 ml의 증류수에 분말 비이 온성 계면 활성제의 O / N 3g을 혼합한다. </li><li> 플라즈마 세정기에 미세 패턴 PDMS 몰드를 놓고 1 분 (85 ​​W, 0.73 밀리바) 수성 액체의 첨가를 용이하게하기 위해, 친수성 ​​표면을 생성하기 위해 그 청소. 이어서, 실험실 코트 로커를 이용하여 적어도 3 시간 (오로 / N) 100 ㎖ 용 활성제 용액의 표면 PDMS. </li><li> PDMS 금형에서 계면 활성제 용액을 씻고 10 분 동안 65 ℃의 오븐에서 완전히 건조. 그 후, 30 분 동안 자외선 (UV) 방사선을 조사함으로써 각 미세 패턴 금형 살균. </li></ol> 2. 하이드로 겔 전구체 세포 현탁액을 준비 <ol><li> 에1 % (w / v)의 전구체를 생성 알긴산, 하이드로 겔 전구체를 준비하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 10ml에 알긴산 나트륨 분말 0.1 g을 용해. 완전히 분말을 용해, 부화 및 / O N 그들을 섞는다. </li><li> 1 mL의 주사기에 연결된 0.22 μm의 필터를 통해 용액을 필터. </li><li> 배양 10 % 우 태아 혈청 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 70 %까지 종래의 조직 배양 접시에 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 인 HepG2 세포 - 5 % CO 2의 가습 인큐베이터 내에서 80 % 합류 37 ℃에서 . </li><li> 한번 PBS를 사용하여 세포를 세척 한 다음 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 인큐베이터 내에서 4 분 동안 0.05 % 트립신 EDTA 1 ㎖를 첨가하여 그들을를 Trypsinize. 원심 상등액의 제거 다음 1 ㎖의 PBS를 사용하여 3 분 재현 탁하고 250 XG에서 배양 접시에서 세포를 수확. </li><li> 자동화 된 세포를 사용하여 PBS에 분산 된 단일 세포의 수를 세계수기. </li><li> 3 분간 PBS를 제거하고, 250 XG에서 원심 분리에 이어 1 % 1ml를 추가 (/ w를 V) 나머지 세포 펠렛에 알긴산 나트륨 용액을 피펫 팅하여 부드럽게 섞어. 10 7 세포 / ml - 세포의 최종 시딩 밀도는 5 × 106이어야한다. 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 가습 셀 / 하이드로 겔 현탁액을 배양한다. </li></ol> 3.로드 및 셀 / 히드로 겔 현탁액의 크로스 연결 <ol><li> 염화칼슘 1.47 g는 가교 시약을 제조 DDH 2 O 100ml에 용해 탈수 (즉, 100 mM의 CaCl2를 · 2H 2 O의 DDH 2 O). </li><li> 70 % 에탄올을 사용하는 초음파 트랜스 듀서와 가습기의 내부를 씻어 및 가교 시약 200 ㎖로 채 웁니다. 가습기, 110mm 폭 300mm 길이 170mm 깊이 (즉, 110mm X 300mm X 170mm (폭 x 높이 x 깊이)). </li><li> 미세 패턴 PDMS를 배치플라즈마 클리너 금형 및 친수성 ​​표면을 만드는 데 85 승에서 1 분을 청소합니다. </li><li> 꾸준히 금형의 미세 패턴의 가장자리에 잘 혼합 된 세포 / 하이드로 겔 현탁액의 7.2 μl를로드합니다. 도시 된 예에서는 간 소엽 형 메시 패턴 (도 1)를 사용한다. 현탁액의 부피는 지형의 패턴에 의존한다. </li><li> 셀 / 하이드로 겔 현탁액의 겔화를 달성하기 위해 가습기를 켜고 가습기가 가교 시약의 안개를 생성되었는지 확인합니다. 5cm의 범위 내 PDMS 몰드의 표면 지형을 덮고 5 분간 하이드로 겔 전구체에 가교 시약을 분무. 거리 이상과 미만 5cm 각각 불완전하고 불균일 한 겔화가 발생할 수 : 있습니다. 가습기는 5 분에서 가교 시약의 안개 20 ㎖를 생산하는 250 ㎖ / hr의 분사 속도를 가지고 있는지 확인하십시오. </li><li> 가교 공정에 따라, 가습기를 끄고 PDMS 모 채우기PBS로 LDS. </li></ol> 단일 모듈 형 하이드로 겔 시트 4. 처리 <ol><li> 200 μL 피펫 팁을 사용하여 하이드로 겔 시트 주위 PBS 부드럽게 피펫 팅을 통해 미세 패턴 금형으로부터 각 경화 하이드로 겔 시트를 분리. </li><li> 최종 절단 1,000 μL 피펫 팁 단부를 이용하여 각각의 부동 하이드로 겔 시트를 픽업. 각 간 소엽 형상 메쉬 하이드로 겔 시트는 8mm X 8.7 mm의 치수를 가지며, 100 일 - 200 μm의 두께. </li><li> 5의 하이드로 겔은 주 이상 12 웰 플레이트에서 단위 요소로 구성하여 부유하게 생체 외에서 세포를 12 웰 플레이트에 DMEM 1 ㎖로 하이드로 겔 시트의 단일 층을 이동시켜, 문화 %의 CO 2는 37 ° C에서 인큐베이터를 가습. 매일 배지를 교환하십시오. </li></ol> 5. 조립 다층 히드로 겔 시트 <ol><li> 반복 18mm X 18mm X 4mm의 크기로 PDMS 프레임을 생산하는 1.5 1.1 단계 (폭 x하부면에 170 μm의 높은 기둥 구조를 포함 H의 X의 D), 및. 단계 1.2에서와 동일한 비율로, PDMS와 경화제의 혼합물의 42g을 사용한다. PDMS 프레임이 X 9mm X 2mm 8mm의 크기와 내부 프레임을 생성하는 실리콘 웨이퍼에 특수 폴리 카보네이트 금형 배치 (폭 x 높이 x 깊이). </li><li> 121 ° C에서 15 분간의 오토 클레이브에 증류수 핀셋 잠긴 PDMS 프레임 및 180 μm의 세공 나일론 여과지 살균. </li><li> 60 mm 직경의 페트리 접시 (5cm의 직경) 나일론 여과지의 분기 상 멸균 PDMS 프레임을 배치했다. </li><li> 최종 절단 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 PDMS 프레임의 내부로 모듈화 하이드로 겔 시트를 옮긴다. 어셈블리에 사용되는 하이드로 겔 시트가 제작되었다 후 적어도 하루 동안 배양한다. </li><li> 빈 200 μL 피펫 팁을 사용하여 PDMS 프레임마다 모듈화 하이드로 겔 시트의 에지를 정렬. </li><li> 6 층 - 반복 (4)의 적층을 형성하는 모듈 형 하이드로 겔 시트를 사용하고 5.4 5.5 단계. </li><li> PDMS 프레임의 하단 기둥 구조를 통해 유출하여 배양 배지를 제거한다. 이어서 알지네이트 용액 2 μL 추가 (/ w 2 % V) 다층 구조체의 코너. </li><li> 다른 사람들과의 각각의 층의 가장자리를 연결하는 다층 구조체 상에 30 초 동안 가교 결합 시약의 안개 스프레이. (250 ㎖ / hr의 속도로 분무) 가교 시약 미스트 2 ㎖을 사용한다. </li><li> 400 μL DMEM으로 가볍게 다층 구조를 씻어 핀셋을 사용하여 PDMS 프레임을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 DME​​M 4 ㎖를 첨가 한 후 리프터 셀 닦아 여과지에서 다층 구조를 분리. </li><li> 전송 다층 하이드로 겔과 같은 구성의 3 mL의 DMEM 여과지, 문화 플로팅 방식으로 시험 관내에서 세포를 사용하여, 함유 6- 웰 플레이트로 구성37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 가습 주 이상 6 웰 플레이트에서 다중 스케일 셀룰러 지지체. 매일 배지를 교환하십시오. </li></ol>

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이 프로토콜은 모듈 식 하이드로 겔 시트를 제조하고, 3 차원 세포 지지체를 형성하도록 조립하는 간단한 방법을 제공한다. 단시간에 분명한 패턴 알긴산 구조를 구축하기 위해서는 주형으로부터 복잡한 미세 패턴을 유지할뿐만 아니라, 세포 생존 및 대사를 유지하도록 충분한 강성 구조를 만들 수 가교 프로세스를 식별한다. 우리는 안개 형태의 가습기를 이용하여 가교 시약을 분무, 졸 - 겔 전이를 포함하여, 가교 공정을 개발 하였다. 영양소 및 대사 산물의 높은 투자율을 갖는 확산 - (200 내지 100㎛),이 가교 처리하지 않고, 미세 스케일 패턴을 한정 확산 깊이와 구성 얇은 하이드로 겔의 형태로 생성 할 수 없습니다. 60 분, 18 - - 20 가교 TI 또한, 30을 요구 기존 확산 기반 방법에 비해(- 5 분​​ 3) 나 상대적으로 짧았다. 게다가, 그것은 또한 단...

하이드로 겔은 특히 생체 재료 유망하고, 기초 생물학, 약리학 적 분석 및 의학에 중요한 것으로 예상된다. 한 하이드로 겔 기반 셀룰러 구조의 Biofabrication 동물 실험의 사용을 줄이기 위해 제안되었다, 2,3- 4, 이식 가능한 조직을 대체 및 개량 세포 기반 분석법. 5,6- 수분을 함유 한 (하이드로) 점탄성 재료 (겔)은 다수의 셀이 캡슐화되어 3D 세포 미세 환경을 제어하기 골격 구조로 유지 될 수 있도록. 미세 유동 또는 미세 가공 기술의지도와 함께, 하이드로 겔 구조의 형상을 정확하게 셀룰러 스케일에서 제어 할 수있다. 날짜, 입자를 포함하는 하이드로 젤의 모양의 다양한, 7-9 섬유, 10-12과 시트, 13-15은 상향식 (bottom-up) 아프로에 건물 단위로 사용되어왔다매크로 규모의 다세포 구조의 제조에 아파. 하이드로 겔 기반 입자와 섬유 모두 미세 유체 장치를 사용하여 유체 컨트롤, 마이크로 스케일 셀룰러 환경과 같은 애플리케이션에 쉽고 빠르게 제작되었습니다. 그러나, 설계 조직의 기본 단위로, 그것은 다시 정렬하고 매크로 규모의 구조로 자신의 볼륨을 확대. 16 미크론 크기의 기본 모듈을 생산하는 것보다 그것은 매크로 스케일 구조를 달성하기 어렵다 복잡 할 것입니다. 하이드로 겔 - 기반 구조의 시트형 유닛 간단한 조립 공정을 통해 지지체의 부피를 증가 시키는데 사용될 수있다. 간접으로, 하이드로 겔 시트의 적층은 체적의 증가뿐만 아니라, 3 차원 공간에서의 기하 확장을 제공 할뿐만 아니라. 다중 꼬임으로 그들의 조립체와 함께 15 - 우리는 이전에, 미세 패턴 (13) 하이드로 겔 시트를 제조하는 방법을보고했다겹으로 셀룰러 아키텍처. 이 기술은 다층 구조의 적층 공정을 통해 복잡한 미세 가공 및 세포 구조의 모듈 식 설계를 할 수 있습니다. 적층되는 마이크로 패턴 모듈러 하이드로 겔 시트의 제작을 통하여, 제어 된 매크로 스케일 미세 세포와 3D 세포 배양 시스템을 실현할 수있다. 이 비디오 프로토콜은 인간 간 암종 세포주 (HepG2)에 기반 모듈러 하이드로 겔 시트를 구성하는 데 사용될 수있다 간단하지만 강력한 제조 방법을 설명한다. 우리는 본원에서 이러한 간단한 패터닝 모듈 하이드로 겔 시트의 조작, 다층 구조로 그 조립을 증명한다.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>분말 비이온 계면활성제&nbsp;</td></tr><tr><td>알긴산 나트륨 염, 저점도</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>초음파 가습기</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>수정 된 장비, 최대 분무 속도 : 250 ml / hr</td></tr><tr><td>나일론 그물 필터 친수성, 180 &mu; m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 금형</td><td></td><td></td><td>PDMS 프레임 패턴 제작을 위한 맞춤형 금형</td></tr></tbody></table>

미세 패턴 매크로 스케일 3d 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

하이드로 겔은 생체 -like 3 차원 조직 구조를 제공하는 미세 유동 또는 미세 가공 기술을 이용하여 미세 규모로 패터닝 될 수있다. 얻어진 하이드로 겔 3D 기반 셀룰러 구조는 진보 된 생물학적 연구, 약물 학적 분석 및 장기 이식 애플리케이션 동물 실험의 대안으로 도입되었다. 하이드로 겔 계 입자와 섬유가 쉽게 제조 될 수 있지만, 조직 재건으로 조작하는 것이 곤란하다. 이 동영상에서는 셀룰러 미세 제어와 매크로 스케일 3 차원 세포 배양 시스템을 형성하기 위해 그들의 조립체와 함께, 미세 패턴 알지네이트 하이드로 겔 시트의 제조 방법을 설명한다. 200 μm의, 정밀한 미세 패턴으로 - 칼슘 겔 화제의 안개 상을 사용하여, 하이드로 겔 얇은 시트 용이 100의 범위의 두께로 생성된다. 세포를 하이드로 겔 시트 형상의 안내 배양 할 수있다독립 구조로 서있는 상태. 또한, 하이드로 겔 시트가 용이 단부 컷 팁 마이크로 피펫을 사용하여 조작 될 수 있고, 패터닝 된 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)을 사용하여 프레임을 적층하여 다층 구조로 조립 될 수있다. 손쉬운 프로세스를 사용하여 제조 할 수있다 이러한 모듈 형 하이드로 겔 시트, 마이크로 및 거시 및 조직 재건의 기능 연구를 포함하여 체외 약물 분석 및 생물학적 연구의 응용 가능성을 가지고있다.

우리는 제조 및 세포 하이드로 겔 시트를 자립의 조작을 설명했다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 우리는 미세 패턴 PDMS 몰드를 제작하고, 세포 - 함유 하이드로 겔은 친수성이 금형의 표면 상에 로딩 된 가교 결합 된 겔 화제의 에어로졸 분무를 생성하도록 가습기를 사용. 금형에서 방출 후, 인 HepG2 세포는 다양한 패턴 (그림 2)와 하이드로 겔 시트 자립에서 배양 하였다. 따라서, 얇은 하이드로 겔 시트는 3 차원 배양 환경을 제공. 또한, 모듈 형 하이드로 겔 시트는 최종 절단 끝 마이크로 피펫을 사용하여 시트를 적층하고, 3D 매크로 스케일의 세포 배양 물 (도 3) 사용 PDMS 프레임을 이용하여 조립 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/fil...

우리는 독립형 형태로 조립 및 조작할 수 있는 간단한 프로세스를 사용하여 미세 패턴화된 하이드로겔 시트의 제작을 설명합니다. 이러한 모듈식 하이드로겔 시트를 사용하면 제어된 세포 미세환경으로 간단한 매크로 스케일 3D 세포 배양 시스템을 생성할 수 있습니다.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

본 절차의 전반적인 목표는 3D 세포 배양 시스템을 위한 모듈형 하이드로젤 시트의 간단한 제작, 조작 및 조립 방법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 배양된 미세 환경을 통해 어떻게 더 생체 내와 유사한 기능성 공학 조직을 생성할 것인가와 같은 조직 공학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비용 증가 없이 세포 하이드로젤 구조체를 생성할 수 있다는 점입니다.3D 세포 배양 조건은 각 모듈형 하이드로젤 시트에 따라 달라집니다. 이 기술은 3D 세포 미세 및 거시 환경의 다양한 기하학적 구조와 조성을 제공할 수 있으므로, 세포 기반 분석 및 생물학적 연구의 개선으로 그 응용 범위가 확장될 수 있습니다. 이 방법은 in vitro 세포 기반 분석에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 3D 조직 모델의 이식 가능한 스캐폴드와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 원하는 마이크로 스케일 패턴을 제작하는 것으로 시작하십시오. 이 비디오에서 보여주는 예시에서는 여기 보이는 것과 같은 간엽상 구조의 간 소엽 유사 메쉬 패턴을 사용합니다. 다음으로 PDMS 2.5 g과 경화제 용액 2.5 g을 정밀하게 측정하여 각 성분을 충분히 혼합하십시오.진공 챔버에서 용액의 가스를 제거한 후, 호일 캐스팅 디시 내의 실리콘 웨이퍼 마이크로패턴 표면에 혼합 용액을 고르게 도포합니다. 다음으로, 디시를 65°C로 가열된 평평한 플레이트 위에 90분 동안 놓아 PDMS를 경화시킵니다. 경화가 완료되면, 캐스팅 디시에서 PDMS를 분리하고 실리콘 웨이퍼에서 조심스럽게 떼어냅니다.PDMS의 가장자리를 잘라내고, 마이크로패턴 면이 위를 향하도록 100mm 직경의 페트리 접시에 패턴이 형성된 부분을 올립니다. 그 다음, 1차 멸균을 위해 마이크로패턴이 형성된 PDMS를 70% ethanol로 세척한 후 증류수로 헹굽니다. 이후 65 °C의 오븐에서 10분 동안 장치를 완전히 건조시킵니다.다음으로, 친수성 표면을 만들기 위해 마이크로패턴이 형성된 PDMS 몰드를 플라스마 세척기에 넣고 1분 동안 세척합니다. 이렇게 하면 수성 액체의 로딩이 용이해집니다. 그런 다음 재료 표에 나열된 계면활성제 용액 100 milliliters로 PDMS 표면을 코팅합니다.실험실 로커(laboratory rocker)에서 샘플을 최소 3시간 동안 배양합니다. 다음으로, 멸균수를 사용하여 PDMS 몰드에서 계면활성제 용액을 세척하고, 65 °C의 오븐에서 10분 동안 완전히 건조합니다. 그 후, 각 마이크로패턴 몰드를 자외선에 30분 동안 노출시켜 멸균합니다.표준 기술을 사용하여 HepG2 세포를 배양하는 것으로 시작합니다. 세포의 밀도가 70%에서 80%에 도달하면, PBS를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음, 0.5% trypsin EDTA 1 mL를 첨가하고 37 °C에서 4분 동안 배양하여 세포를 수확합니다.세포가 분리되면 원심분리관에 수집하고 250 g에서 3분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 상층액을 제거한 후 1 mL의 PBS에 세포를 재부유시킵니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 PBS 내에 단일 분산된 세포의 수를 측정합니다.그 다음, 250 g에서 3분 동안 세포를 다시 원심분리하여 펠릿화합니다. PBS 상층액을 제거하고, 최종 세포 파종 밀도가 mL당 500만에서 1,000만 개의 세포가 되도록 1% sodium alginate 용액을 충분히 첨가합니다. 피펫을 사용하여 세포 용액을 부드럽게 혼합한 후, 37 °C의 5% CO2 습윤 배양기에서 세포 하이드로젤 현탁액을 배양합니다.세포를 배양하는 동안, 마이크로패턴이 형성된 PDMS 몰드를 플라스마 세척기에 넣고 85 watts에서 1분간 세척하여 친수성 표면을 생성합니다. 세포 하이드로겔 현탁액을 파이펫으로 부드럽게 섞어준 다음, 몰드 내 마이크로패턴의 가장자리에 현탁액 7.2 microliters를 일정하게 로딩합니다. 이후 가습기를 사용하여 가교제를 시간당 250 milliliters의 속도로 분무하여 하이드로겔 전구체 위에 5분간 분사함으로써 세포 하이드로겔 현탁액을 겔화합니다.이 절차가 5cm 범위 내의 PDMS 몰드 표면 지형을 모두 커버하도록 하십시오. 가교 공정이 완료되면 가습기를 끄고 PDMS 몰드에 PBS를 채웁니다. 200µL 파이펫을 사용하여 경화된 하이드로젤 시트의 가장자리에 PBS를 조심스럽게 분주하여 각 하이드로젤을 분리하십시오.그런 다음, 끝을 자른 1,000-µL 피펫 팁을 사용하여 떠 있는 하이드로젤 시트를 각각 집어 올립니다. 각 하이드로젤 시트를 1 mL의 예열된 DMEM이 담긴 12-well 플레이트의 개별 웰로 옮겨 배지 표면에 띄웁니다. 이 상태로 세포를 1주일 동안 배양하며, 이틀마다 배양액을 교체합니다.다음으로, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 하단 표면에 170 µm 높이의 기둥 구조가 포함된 PDMS 프레임을 제작합니다. 제작 과정에서 실리콘 웨이퍼 위에 특수 폴리카보네이트 몰드를 배치하여 너비 8 mm, 높이 9 mm, 깊이 2 mm의 내부 프레임을 형성합니다. 멸균 후, 60 mm 페트리 접시에 놓인 나일론 필터 페이퍼 1/4 조각 위에 PDMS 프레임을 배치합니다.인큐베이터에서 하이드로젤 시트를 꺼내고, 끝을 자른 1,000-microliter 피펫 팁을 사용하여 첫 번째 모듈형 하이드로젤 시트를 PDMS 프레임 내부로 옮깁니다. 빈 200-microliter 피펫 팁을 사용하여 모듈형 하이드로젤 시트의 가장자리를 PDMS 프레임에 맞춥니다. 4~6개 층이 쌓일 때까지 추가 하이드로젤 시트로 이 과정을 반복합니다.다음으로, PDMS 프레임 하단의 필라 구조를 통해 배양액을 흘려보내 제거합니다. 그런 다음, 다층 구조체의 한쪽 모서리에 2% 알지네이트 용액 2 µL를 첨가합니다. 가습기를 사용하여 가교제를 시간당 250 mL의 속도로 다층 구조체에 30초 동안 분무하여 각 층의 가장자리를 서로 부착시킵니다.그런 다음, 다층 구조물을 400 µL의 DMEM으로 부드럽게 헹구고 핀셋을 사용하여 PDMS 프레임을 제거합니다. 이어서 DMEM 4 mL를 추가로 넣습니다. 셀 리프터로 조심스럽게 닦아내어 거름종이로 다층 구조물을 분리한 다음, 거름종이를 사용하여 3 mL의 DMEM이 들어 있는 6-웰 플레이트로 옮깁니다.6웰 플레이트에서 하이드로젤 구조체를 다중 스케일 세포 지지체로 사용하여 세포를 부유 상태로 최소 1주일 동안 배양하십시오. 배양액은 격일로 교체합니다. 여기에 간 소엽 유사 미세 패턴 하이드로젤 시트를 층별 조립한 결과가 나타나 있으며, 녹색 형광을 띠는 인간 간암 세포와 적색 형광을 띠는 NIH-3T3 섬유아세포가 결합된 메쉬 위에서 함께 공동 배양되었습니다.본 기술을 사용하여 육각 기둥, 얇은 망상 구조, 전체 어레이, 그리고 100에서 200 micrometers 정도의 얇은 하이드로젤 구조 형태를 갖는 다수의 마이크로콤 유사 마이크로파이버를 포함한 다양한 패턴 변형을 제작할 수 있습니다. 이러한 구조체들은 다양한 세포 유형에 풍부한 3D 배양 환경을 제공합니다. 이 영상을 시청한 후에는 생체 내 유사 3D 배양 시스템을 바텀업 방식으로 구축하기 위한 세포 하이드로젤 시트 제작 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

이 문서는 조직 공학에 대 한 셀 정렬을 조절 하는 동심 셀-라덴 히드로에 연속 되지 않은 그라데이션 정적 긴장을 제공 하는 간단한 방법을 소개 합니다.

그라데이션 변형 칩 셀 라덴 히드로에 자극 세포 행동에 대 한

우리는 3차원 세포 배양 응용을 위한 합성 하이드로겔 매트릭스의 광 매개 형성 및 후속 생화학적 패터닝을 위한 순차적 프로세스를 설명합니다. 세포 적합성 photoclick chemistry를 가진 하이드로겔의 구성 및 변형이 입증되었습니다. 또한 패턴을 정량화 및 관찰하고 이러한 하이드로겔 내에서 세포 생존력을 결정할 수 있는 손쉬운 기술이 제시됩니다.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

이 보고서는 저압 진공을 사용하여 생물학 연구를 위한 세포와 기질로 미세유체 채널을 채우는 간단하고 수행하기 쉬운 기술을 설명합니다.

패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

상보적인 반응성 그룹을 갖는 마이크로겔 로드는 수용액에서 상호 연결될 수 있는 능력을 가진 마이크로유체공학을 통해 생산됩니다. 아니소메트릭 마이크로젤은 구형 기반 시스템에 비해 더 큰 기공을 가진 안정적인 구조물로 막히고 상호 연결됩니다. GRGDS-PC로 변형 된 마이크로 겔은 세포 배양에 사용할 수있는 거대 다공성 3D 구조물을 형성합니다.

마이크로젤 로드의 상호 연결된 거대 다공성 3D 스캐폴드

이 연구는 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질 복합체 내부의 신경 줄기 세포의 자유형 임베디드 3D 프린팅을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 높은 충실도로 상호 연결된 인간 신경 조직 구조의 프로그래밍 가능한 패터닝을 가능하게 합니다.

인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

학습하세요 조직공학을 위한 모듈형 하이드로겔 시트 제작 및 조립 방법을. 이 기술은 비용 효율적인 3D 세포 배양 환경을 구축하여 생물학 연구와 세포 기반 분석을 개선합니다.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

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