밀도 그라데이션 Multilayered 중합 (DGMP) : 멀티 칸 만들기위한 소설 기법, 조직 공학을위한 사용자 정의 공사장 공중 발판

이 절차의 전반적인 목표는 다층 세포 배양 골격을 만드는 것입니다. 이 동영상은 접착 펩타이드 RGDS를 교대층으로 통합하여 C 두 개의 C 12 세포 영역을 분리하는 2D 세포 배양 매트릭스를 생산하는 방법을 보여줍니다. 이는 먼저 RGDS 펩타이드를 acro 충성도 매크로에 테더링하여 수행됩니다.

그런 다음 매크로 펩타이드 조합에 LOR 염료를 태그하여 다층 겔 층을 포함하는 펩타이드를 시각화할 수 있습니다. 두 번째 단계는 실리콘 시트에서 금형을 절단하고 두 개의 유리 슬라이드 사이에 끼워 넣고 각 층의 개별 구성 요소를 혼합하여 금형을 형성하는 것입니다. PEG RGDS Alexa three 50을 사용한 peg di acrl 및 peg di acrl의 솔루션은 금형 내에서 번갈아 가며 층을 이룹니다.

겔은 UV 조사에 의해 중합됩니다. 마지막 단계는 기질 구성이 세포의 성장과 부착에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해 2D 다층 겔에 C 두 개의 C 12 세포를 시딩하는 것입니다. 궁극적으로, 명시야 및 형광 현미경 검사는 골격에서 C two C 12 세포의 선택적 성장을 시각화하는 데 사용됩니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 다층 2D 및 3D 세포 배양 매트릭스를 만들기 위한 간단하고 비용 효율적인 방법이라는 것입니다. 값비싼 기기의 필요성에 의존하지 않습니다. 레이어 간의 인터페이스는 연속적이고 구조적으로 통합되어 있습니다.

개별 레이어의 구성 요소 사이에는 혼합이 없습니다. 이 방법은 패턴화된 생물학적, 화학적, 기계적 신호에 반응하여 세포가 어떻게 이동하고 분극화되는지와 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 세포 이동 및 분화에 대한 부드러운 통찰력을 제공할 수 있으며 신경 줄기 세포의 새로운 우측 성장 및 시냅스 형성 지시와 같은 다른 시스템에 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 RGDS 펩타이드와 아크로 오일 페그 숙시닐 카보 메틸 에스테르를 아르곤의 건조 DMSO에서 1-2:1 몰비로 결합합니다. 그런 다음 NN diop, 프로필 메틸아민 또는 D-I-P-E-A를 aquilo PEG SCM에 비해 2:1 몰 비율로 첨가하여 반응을 촉진하고 곰팡이가 핀 TOF 질량 분석법을 사용하여 aquilo PEG RGDS 분자의 접합을 확인합니다. 이를 위해 별도로 AQUILO PEG RGDS 반응 용액 1마이크로리터와 비반응성 AQUILO PEGG SCM 1마이크로리터를 곰팡이가 핀 표적의 다른 지점에 추가합니다.

둘 다 말리십시오. 그런 다음 THF 와류에서 1 분 동안 보편적 인 곰팡이 매트릭스의 포화 용액을 준비하고 동일한 두 지점에 1 마이크로 리터를 첨가합니다. 둘 다 말리십시오.

다음으로 샘플을 로드합니다. SAVIS 골 스무딩 탑햇 베이스라인 감산 및 OID 피크 검출 알고리즘을 사용하여 약 19%의 출력으로 60헤르츠 레이저로 곰팡이가 핀 거친 분석을 수행합니다. acro PEG RGDS의 분자량은 공유 결합 펩타이드로 인한 질량 변화에 따라 오른쪽으로 이동해야 합니다.

다음 단계는 아르곤 하에서 아르곤을 하룻밤 동안 배양하기 위해 최소한의 DMSO에 용해된 아퀼로 PEG SCM에 비해 중간 에스테르에서 3개의 50 카르복실산 흡입구를 등몰량으로 첨가하여 Fluor를 접합하는 것입니다. 그런 다음 3, 500 DAU 분자량 차단 투석 카세트를 사용하여 섭씨 4도에서 염료 물에 대해 투석하여 아크로 오일 페그 RGD S3 50을 정제합니다. 1001 용적 비율을 사용하여 48시간 동안 투석을 계속하고 하루에 최소 두 번 차가운 투석액을 교환합니다.

제품은 0.22 미크론 주사기 필터를 통한 필터 살균으로 더욱 정제됩니다. 마지막으로, 멸균 환경에서 멸균 정제된 아크로 오일 페그 RGD S3 50을 멸균 사전 중량 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 열린 마이크로 원심분리기 튜브를 멸균 브리더 튜브 내에서 밀봉합니다.

샘플을 동결 건조하고 각각 섭씨 영하 20도에서 파라핀 필름으로 밀봉하여 보관하십시오. 100% 메탄올로 슬라이드를 사전 세척하고 액체가 증발할 때까지 섭씨 80도의 오븐에서 건조합니다. 그런 다음 유리 슬라이드가 들어있는 접시를 흄 후드에 넣고 각 슬라이드에 250 마이크로 리터의 시그마 코트를 추가합니다.

전체 표면을 코팅하기 위해 30초 동안 슬라이드를 부드럽게 흔듭니다. 다음으로, 코팅된 슬라이드를 100% 메탄올로 철저히 헹군 다음 최소 10ml의 물에 5분 동안 두 번 담가 세척 및 증류수를 사용합니다. 헹구면 슬라이드를 자연 건조시킵니다.

실리콘 시트를 유리 슬라이드와 동일한 치수로 트리밍하여 0.8mm 두께의 실리콘 공간을 준비합니다. 그런 다음 생검 펀치를 사용하여 면도날로 실리콘에 10mm 또는 8mm 구멍을 뚫어 골격을 고정합니다. 비계 재료를 추가할 수 있도록 금형 상단에 약 2mm 채널을 만듭니다.

그런 다음 실리콘 공간과 시그마 코트 처리된 유리 슬라이드를 오토클레이브하여 살균합니다. 또한 einor 튜브 및 집게와 같은 젤 주조를 위한 추가 재료를 살균합니다. 조직 배양 후드 필터에서 멸균 1ml 주사기와 0.2미크론 필터를 사용하여 Peg di aquil의 스톡 용액을 멸균합니다.

먼저 50%PEG D acrl을 다양한 양의 멸균 60%IO DAL 원액 PBS 및 광 개시제와 결합하여 10%20%30% 및 40%I oal의 다양한 최종 농도를 산출하여 형광 표지된 15%PEG 프리 폴리머 용액을 준비하기 위해 용액을 철저히 혼합하여 개별 호박색 마이크로 쓰레기 튜브의 각 층에 대해 15%중량 대 부피 비율로 PEG 프리폴리머 용액을 공식화하는 것으로 시작합니다. 최종 농도 8밀리몰에서 50%PEG 디 아퀼 및 아퀼로 PEG RGD S3 50을 IO Dal 원액 PBS 및 광 개시제와 호박색 Microview 튜브에서 결합하여 15%25% 및 35%IO IRA의 농도를 산출하고 용액을 완전히 혼합합니다. 다음으로, 두 개의 시그마 공동 처리된 유리 슬라이드 사이에 미리 절단된 스페이서를 배치하여 금형 설정을 조립하고 클램프로 고정합니다. 일단 형이 조립되면, 40% 해결책의 10 마이크로리터를 첫째로 추가해서 겹이 쌓인 젤을 던지십시오, 그 후에 형광으로 레테르를 붙인 35% 해결책의 10 마이크로리터.

대체 레이어링을 반복하여 여러 레이어를 만듭니다. 그런 다음 365나노미터의 빛을 금형에 3분 동안 조사합니다. 휴대용 UVR 9, 000 램프를 사용하여 중합된 하이드로겔이 5분 동안 경화되도록 합니다.

그런 다음 클램프를 제거하고 상단 유리 슬라이드와 금형을 부드럽게 들어 올립니다. 층화된 밀도 구배. 다중 배치 중합 또는 DG MP 젤은 슬라이드에 남아 있습니다.

멸균 주걱을 사용하여 금형에서 젤을 조심스럽게 제거하고 멸균 DMEM이 들어 있는 50ml 튜브에 넣습니다. 1000:1 부피의 DMEM을 사용하여 하루에 두 번의 완충액 교환으로 48시간 동안 중합된 겔을 세척합니다. 이렇게 하면 밀도, 개질제, 광 개시제 및 반응 프리 폴리머가 제거됩니다.

그런 다음 DGMP 젤을 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에 보관하십시오. 교대하는 층을 시각화하려면 겔 문서화 장치의 샘플 트레이에 있는 자를 따라 DGMP 겔을 배열합니다. 그런 다음 DGMP 하이드로겔에서 3개의 짙은 색과 파란색 띠가 번갈아 나타나는 Alexa 50을 사용하여 겔을 노출시키고 이미지화하여 뚜렷한 화학 조성의 개별 층을 형성함을 보여줍니다.

세포 배양을 위해 DGMP 젤을 준비하려면 48웰 세포 배양 플레이트의 웰에 부드럽게 삽입합니다. 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포 배양 배지에서 세 번 헹굽니다. 다음으로, 100mm 세포 배양 플레이트에서 C 2개의 C 12 근아세포가 60% 융합될 때 수확합니다.

이렇게하려면 예열 된 PBS로 플레이트를 세 번 헹굽니다. 그런 다음 EDTA에 0.25% 트립 1밀리리터를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 2분 동안 배양합니다. 세포가 분리되면 1ml의 예열 배양 배지를 추가하고 원심분리를 위해 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

세포를 펠릿화한 후 Reeses, 성장 배지에 펜을 넣고 트리암 블루를 추가하고 TC 10 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다. 그런 다음 DG MP 골격에 C 2 개의 C 12 근 아세포를 파종하고 섭씨 37도에서 24 시간 동안 5 % 이산화탄소로 배양합니다. 에피 형광 및 위상차 현미경을 사용하여 DGMP 겔 층을 포함하는 RGDS에 C 2개의 C 12 근아세포가 부착되어 있는지 확인합니다.

DGMP 겔의 교대층은 우측에 도시된 RGDS와 같은 다양한 펩타이드를 함유할 수 있으며, 이는 세포 부착 및 성장을 지원합니다. 그러나 왼쪽의 층에는 세포 부착 펩타이드가 포함되어 있지 않았고 세포는 해당 영역에서 생존하지 못했습니다. IO 디올은 겔 강성에 영향을 줄 수 있습니다.

여기서, 탄성 계수는 원자력 현미경을 사용하여 측정되었습니다. 이 겔 제형에서 30%IAL을 사용할 때 강성이 60% 증가하는 것으로 나타났으며, 겔 강성에 대한 IAL의 영향은 사용되는 재료에 따라 다를 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 층의 순서를 기억하는 것이 중요합니다. IEX null이 가장 많은 계층이 맨 아래에 있고 IEX null이 가장 적은 계층이 맨 위에 있습니다.

주변광으로 인한 중합을 방지하기 위해 끝에 광 개시 장치를 추가하는 것을 항상 잊지 마십시오. 우리는 공동 작업자들과 함께 이 기술을 적용하여 신경돌기 성장을 3D로 정리하고 있습니다. 이를 통해 건강한 개인에서 유래한 신경 전구 세포와 신경 발달 장애가 있는 환자에서 유래한 신경 전구 세포를 비교할

자외선으로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 가교 단계를 수행하는 동안 UV 보호 안경을 착용하십시오.