Name: 밀도 그라데이션 Multilayered 중합 (DGMP) : 멀티 칸 만들기위한 소설 기법, 조직 공학을위한 사용자 정의 공사장 공중 발판 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 배우세요 다층 세포 배양 지지체를 만드는 비용 효율적인 DGMP 방법을 사용하여 RGDS 펩타이드와 C2C12 세포를 활용한 조직 공학 연구를 수행하는 기법입니다.

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저자는 NIH 원장의 새로운 혁신 상 (1DP2 OD006499-01 AA와 1DP2 AJE에 OD006460-01까지)에서 지원하고, 과학 기술 (Nanomedicine의 우수의 UC 샌디에고 센터)의 킹 Abdulaziz시 감사합니다. 우리는 원고에 대한 그녀의 중요한 의견 씨 제시카 무어 감사드립니다.

1. 휘황 레이블 Acryloyl-PEG-RGDS의 합성 <ol><li> 상온에서 아르곤에 따라 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 1.2:1:2 몰 비율에서와 NN diisopropylethylamine (DIPEA) : acryloyl-PEG-succinimidyl 카르복시 메틸 에스테르 (3천4백그램 / 몰 aPEG-SCM, PEG MW)로 RGDS 펩타이드를 반응 하룻밤. </li><li> 비행 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 이온화 시간 (든 - TOF) 질량 분광법에 의해 활용을 확인합니다. 든 대상과 드라이에 샘플 명소로 aPEG - RGDS 반응 용액 1 μl를 추가합니다. 유니버설 든 tetrahydrofuran의 매트릭스 (THF) 및 1 분에 소용돌이 포화 용액을 준비합니다. 동일한 샘플 지점이 솔루션의 ~ 1 μl를 추가합니다. 비교를 위해 aPEG-SCM 절차를 반복합니다. 로드 분석 할 수 있습니다. aPEG - RGDS의 분자 무게 aPEG-SCM (그림 2)보다 커야합니다. </li><li> 형광을 결합한하려면 용해 알렉사 형석 350 카르 복실 산 (succinimydyl 에스테르)의 몰 금액을 추가DMSO의 최소 볼륨에서, 1.1에서 aPEG-RGDS 반응 솔루션과 하룻밤 실온에서 아르곤에 따라 반응한다. </li><li> 하루에 적어도 두 번 dialysate 교환, 1,000:1 용적 비율 48 시간에 대해 4 ° C에서 DI-H 2 O에 대해 (MW 3500 다) dialyzing에 의해 aPEG-RGDS-350 정화. </li><li> 정화 Labconco Freezone 플러스 또는 이에 상응하는 동결 건조 시스템에서 aPEG-RGDS을 350 및 -20 ° C.에 상점을 건조 고정 </li></ol> 2. RGDS-350 레이어를 교대로 2D PEG 젤의 2D 몰드와 제작의 작성 <ol><li> 소수성 유리 슬라이드를 준비합니다. 진공 오븐에 유리 그릇에 깨끗한 유리 슬라이드를 놓습니다. 80 열 ° C 30 분에 완전히 표면을 건조합니다. 장소 퓸 후드에 슬라이드를 즐길 수있는 요리와 부드럽게 코트 전체 표면에 30 초에 흔들 각 슬라이드에 250 μl Sigmacote를 추가합니다. 철저히 leas에서의 5 분에 두 번 몸을 담근 채, 증류수에 세척 한 다음, 100 % 메탄올로 코팅 된 슬라이드를 헹굼t 10 ML. </li><li> 10mm 생검으로 주먹을 실리콘 스페이서 (두께 0.8 mm)을 자른다. </li><li> 실리콘 스페이서와 Sigmacote - 처리 유리 슬라이드를 압력솥. </li><li> 혼합 PEG diacrylate (PEGda)에 의해 개별 microfuge 튜브의 각 각 레이어에 대한 솔루션을 공식화 전구체 (최종 농도 15% w / V) 다양한 최종 농도 (예를 들면 40 %를, 얻을 수있는 iodixanol의 다른 양 (물에 60 %의 재고 솔루션)와 30 %, 20 %, 10 %), 인산과 나머지 볼륨을 보충하는 것은 등급 밀도의 솔루션을 얻기 위해 (PBS) 염분 버퍼. 비슷한 방법으로 레이어를 번갈아 가며 들어, iodixanol 및 PBS와 혼합 aPEG-RGDS-350 (최종 농도 8 MM)는 다양한 농도 (예를 들면 35%, 25 %, 15 %) 얻을 수 있습니다. </li><li> 다양한 층 (각 층 솔루션의 ML 당 재고 솔루션의 10 μl)에 대한 각 솔루션에 (2 - 히드 록시 4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone, N-비닐 pyrrolidone의 333mg/ml 주식) photoinitiator을 추가합니다. Photoinitiator 전S는 빛에 민감하므로, 금형의 젤의 레이어링하기 전에 중합을 방지하기 위해 마지막으로 추가되었습니다. </li><li> 이 프로토콜의 후속 단계는 불임을 보장하기 위해 바이오 안전성 캐비닛에서 수행됩니다. </li><li> 멸균 한 ML의 주사기와 0.2 μm 필터를 사용하여 각 솔루션을 필터 소독. 이 Sigmacore - 처리 유리 슬라이드와 그림 1에 묘사 된대로 배치 클램프와 보안 사이의 공백을 sandwiching하여 금형 설정을 조립. </li><li> 적은 고밀도 솔루션 (35 % iodixanol있는 예 aPEG-RGDS-350)에 이어 가장 고밀도 솔루션 (40 % iodixanol있는 예 PEGda) 첫을 추가하여 계층 젤을 던져. 그림 1과 같이 원하는 구성과 밀도의 여러 레이어를 달성하기 위해 다른 레이어링를 반복합니다. </li><li> 휴대용 UVR-9000 램프를 사용하여 3 분에 365 nm의 빛으로 금형을 비추다. polymerized 젤은 5 분 동안 치료 할 수 있습니다. 클램프를 제거하고 부드럽게 상단 유리를 들어슬라이드와 곰팡이, 층상 DGMP의 젤은 슬라이드에 남아있게됩니다. 멸균 주걱을 사용하여 조심스럽게 무균 PBS 또는 세척을위한 문화 매체를 포함하는 50 ML 튜브에 젤을 배치합니다. </li><li> 밀도 수정, photoinitiator 및 unreacted 폴리머를 제거하는 하루에 적어도 두 번 버퍼를 교환, 1,000:1 용적 비율로 PBS에 polymerized 젤을 씻는다. 또한 PBS는 세포의 성장 매체로 교환 할 수 있습니다. PBS 또는 3 단계에서 설명한 세포 배양 실험의 성장 매체에 DGMP 젤을 저장합니다. </li><li> 교대 레이어를 시각화하려면 VersaDoc 젤 문서 단위의 샘플 트레이에 자 함께 DGMP 젤을 (이 젤은 세포 배양에 사용할 수 없습니다) 주선합니다. 350 nm 정도의 젤을 노출, 노출 시간은 형광의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. DGMP 히드로 겔에 어두운 파란색 밴드를 교체하는 것은 별개의 화학 성분 (그림 3)의 분리 층의 형성을 보여줍니다. </li></ol><ol><li> RGDS의 펩타이드를 통합 젤 들어, C2C12 myoblasts 등의 접착에 의존 세포를 사용합니다. </li><li> 부드럽게 바이오 안전성 캐비닛에 무균 세포 스크레이퍼를 사용하여 48도 세포 배양 플레이트의 우물에 DGMP 젤을 (PBS에 저장) 삽입합니다. </li><li> 사전 따뜻한 성장 매체 (Dulbecco의 수정 이글 배지 또는 DMEM 10 % V / V 태아 소 혈청과 1% 브이 / v 100x 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션과 보충)과 37 번 설정 물 목욕에 PBS ° C. </li><li> PBS로 C2C12 세포 세 번이나 60 % 합류 플레이트 (10mm)를 씻으십시오. 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML를 추가하고 2 분에 37 ° C에서 잠복기에 의해 PBS와 수확 세포를 대기음. 성장 매체와 카운트 세포에서 세포를 Resuspend. 종자 DGMP 젤이 포함 된 C2C12 myoblasts (20,000 세포 / cm 2)과 잘 세포 배양합니다. 5 % CO 95분의 2 % 상대 습도에서 37 ° C에서 세포를 배양. 주의 4 시간 후 부드럽게 교환 매체를 다시하지 않기가볍게 준수 세포를 이동합니다. </li><li> 24 시간 후, DGMP 젤의 RGDS 함유 층에 C2C12 myoblasts의 첨부 파일은 epifluorescence과 위상 대비 현미경 (Zeiss Axiovert 200)을 통해 확인 할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 할 충돌 관심이 없습니다.

DGMP 비싼 장비에 의존하지 않는 multilayered 젤을 준비하기위한 간단한 전략이다. 이 프로토콜은 이러한 콜라겐과 hyaluronic 산성 등의 biocompatible 재료를 사용하여 공사장 공중 발판을 만들기위한 적응 할 수 있습니다. 층 사이 신호의 혼합 방지하기 위해 Bioactive 작은 분자, 예를 들어 셀이 부착이 - 홍보 RGDS의 펩타이드를 고분자 매트릭스에 닿는 할 수 있습니다. 그들은, 매트릭스 메쉬 크기에 따라, hydrogels ~ 10 무마 적은 경향이 같은 단백질은 화학 결합에 대한 필요없이 개 층에 캡슐화 할 수 있습니다. 여기 iodixanol (Nycoprep), 이전에 생균 응용 프로그램에 사용 된 불활성 밀도 변형을 사용 하였다. 이러한 자당 및 덱스 트로 오스와 같은 다른 밀도 조절도 사용할 수 있습니다. 정착 시간 (t들)을 변화시킴으로써, 하나는 필요에 따라 두 레이어 사이의 인터페이스 (이상 정착 시간이 부드럽게 전환 할 수 있습니다) 과격하거나 날카로운 전환을 생산 조정 할 수 있습니다 &lt;&gt; 10 논의하게 될 것입니다. 예를 들어, DGMP 젤 레이어 사이의 부드러운 전환 효과는 같은 chemotaxis와 같은 세포 과정을 연구 할 수있는 생물학적 신호의 연속 그라디언트를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 겔 강성의 밀도 수정의 효과가 15 % aPEGda 젤에 대한 그림 5에 표시됩니다, PEGda과 iodixanol 농도의 함수로 강성 및 다공성의 더 완전한 특성화 현재 평가되고 있습니다. 이 예에서 PEGda의 농도가 상대적으로 높은 반면, 우리는없는 젤에 비해 30 % iodixanol와 젤에 60 % 더 큰 탄성 계수를 관찰했다. 겔 강성의 변화는 변조 macromer 농도 또는 crosslinking 밀도가 비용을 조정할 수 있습니다. 우리는 또한 polyacrylamide와 PEG의 전구체 (10)을 사용하여 3D multilayered 젤을 만들 수있는 DGMP 기술을 적용했습니다. 농도 또는 성 예비 중합체의 crosslinking의 정도를 변화하는 것은 허용의 구조 변화3D로 양극화 성장 및 마이그레이션과 같은 세포 행동을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다 공사장 공중 발판. 요약, DGMP는 생물 의학 및 기초 연구 응용 프로그램의 광범위한 biocompatible 재료의 다양한 2D 및 3D 공사장 공중 발판을 제조에 적용 할 수있는 적응 기술이다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 및 악기 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 글리콜 succinimydyl 카르복시 메틸 (A-PEG-SCM) </td><td> Laysan </td><td> 120-64 </td></tr><tr><td> Polyethelyene 글리콜 diacrylate (PEGda) </td><td> Dajac 연구소 </td><td> 9359 </td></tr><tr><td> 아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산 - 세린 (RGDS) </td><td> 미국의 펩타이드 </td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N, N - Diisopropylethylamine (DIPEA) </td><td> 시그마 </td><td> D125806 </td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide (DMSO) </td><td> 시그마 </td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N, N-dimethylformamide (DMF) </td><td> 어부 </td><td> D119-4 </td></tr><tr><td> Tetrahydrofuran (THF) </td><td> 어부 </td><td> T397 </td></tr><tr><td> 투석 카세트 (3500다) </td><td> 열 과학 </td><td> 66,330 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 350 카르 복실 산 succinimydyl 에스테르 </td><td> 생명 기술 </td><td> A-10168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> 시그마 </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> 실리콘 스페이서 </td><td> Grainger </td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td> 생검 펀치 </td><td> Acuderm </td><td> P1025 (10 ㎜) P850 (8 ㎜) </td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산은 (DPBS) 염분 버퍼 </td><td> Hyclone </td><td> SH30028 </td></tr><tr><td> Iodixanol (NycoPrep) </td><td> 어부 </td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> 2 - 히드 록시 4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone </td><td> 시그마 </td><td> 410896 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) </td><td> 생명 기술 </td><td> 11,054 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 생명 기술 </td><td> 10,082 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15,140 </td></tr><tr><td> C2C12 myoblasts </td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> 든 </td><td> Bruker </td><td> N / A </td></tr><tr><td> UVR-9000 </td><td> Bayco </td><td> UVR-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td> 바이오 RAD </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

밀도 그라데이션 multilayered 중합 (dgmp) : 멀티 칸 만들기위한 소설 기법, 조직 공학을위한 사용자 정의 공사장 공중 발판

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

유형 및 생물학적 자극 (예 : 성장 요인 억제제, 작은 분자) 또는 매트릭스 구조의 농도는 (매트릭스의 예 조성, 농도, 또는 강성) 공간을 통해 다양하고있는 복합 조직 문화 매트릭스는 조사의 다양한 사용 것 이 변수는 셀 차별화, 마이그레이션 및 기타 현상에 미치는 영향에 관한. 계층 매트릭스를 생성의 주요 과제는 각 레이어 1에서 개별 구성 요소의 확산없이 레이어 인터페이스의 구조 무결성을 유지하고 있습니다. 이를 위해 현재 방법론은 photopatterning 2-3, 리소그래피 4 연속 functionalization5, 6 건조 동결, microfluidics 7 또는 어떤 많은 복잡한 장비 및 기술 능력을 필요로 원심 분리 8이 포함되어 있습니다. 기타 층 9 박리가 발생할 수 있습니다 개별 레이어의 연속 첨부 파일에 의존 </&gt;를 논의하게 될 것입니다. DGMP는 밀도 10 달러를 변화의 레이어를 만들 수 같은 iodixanol 같은 불활성 밀도 변형을 사용하여 이러한 문제를 극복. 밀도 수정은 어떤 성 예비 중합체 또는 bioactive 분자와 혼합 될 수 있기 때문에, DGMP는 각 비계 층이 사용자 정의 할 수 있습니다. 그들은 수성 유지하면서 단순히 밀도 변형의 농도를 변화하는 것은 인접한 레이어의 혼합 방지 할 수 있습니다. 후속 단일 단계 중합은 각 층은 독특한 화학적, 기계적 성질을 가지고있는 구조적 연속 multilayered 발판에 상승을 제공합니다. 밀도 수정은 쉽게 개별 레이어 또는 구성 요소의 섭동없이 린스 충분한와 함께 제거 할 수 있습니다. 이 기술은 따라서 잘 다양한 크기, 형태, 및 자료의 hydrogels를 만들 적합합니다. 번갈아 가며 층 RGDS-350 통합하는 2D-폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 젤, 제조를위한 프로토콜은 아래 설명되어 있습니다. 우리는 PEG B를 사용이 biocompatible 및 불활성입니다 ecause. RGDS, 세포 접착 펩타이드 11, 생물학적 단서의 공간 제한을 설명하는 데 사용, 그리고 형광 (알렉사 형석 350)의 활용은 우리가 시각적으로 다양한 레이어를 구별 할 수 있습니다. 이 절차는 다른 재료에 적용 할 수 있습니다 (예 : 콜라겐, hyaluronan 등) 10 일부 수정 3D 젤을 제조하도록 확장 할 수 있습니다.

든 - TOF 분석 acryloyl-PEG에 RGDS의 펩타이드 (그림 2)의 결합을 확인합니다. 젤 영상은 photopolymerization (그림 3A) 이후 RGDS-350 (파란색) 레이어를 번갈아 가며 보여준다. 그림 3a에 도시 된 바와 같이, 2D DGMP 젤 크기는 실리콘 금형 (왼쪽 10mm,, 8mm, 오른쪽)의 직경에 따라 다양 할 수 있으며, 따라서 여러 assays에 사용하기 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다 -이 경우에 맞게 48 잘 세포 배양 플레이트 (그림 3B). Epifluorescence과 DGMP 젤을 배양 C2C12 myoblasts의 위상 대비 현미경가 선택적 첨부 파일을 보여줍니다 RGDS-350이 포함 된 셀 접착 펩타이드 (RGDS)의 compartmentalization을 보여주는 PEG 레이어를 (그림 4). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> 1 그림. 분자 무게는든 - TOF는 RGDS의 펩타이드의 결합 후 얻은 aPEG - RGDS에 aPEG-SCM을 비교하여 HT 분석. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> 그림 2. DGMP 겔 제조의 개략도. 그라데이션이 층을 한 후에 그들이 photopolymerization 다음 단계적 인터페이스를 만들 시간 기간 (t들) 변화에 정착 할 수 할 수 있습니다. 층상 DGMP의 젤 쉽게 더 사용을위한 금형에서 추출 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. photopolymerization 후 얻은 A) 2D multilayered 젤은 350 nm의와 마찬가지의 하얀 빛 채널을 사용하여 이미징닥터 겔 문서 단위입니다. 이 이미지는. B) DGMP 젤의 삽입 48도 세포 배양 요리에 흰색으로 RGDS를 포함하는 레이어를 번갈아 가며 나타 그레이 스케일. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 통합 위상 대비, DGMP 젤 (스케일 바 50 μm)에서 성장 C2C12 myoblasts의 epifluorescence 이미지입니다. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 2 NN 힘 트리거 12 이전에 설정 한 방법을 사용하여 가교 PEG 기판의 정적 샘플 겔 표면 탄성에 iodixanol의 효과. 원자 힘 현미경 측정. * P &lt;0.05와 ** P &lt;0.01.

여기 조직 공학을위한 개 층 사이의 끊임없는 인터페이스와 biocompatible, 다층 매트릭스를 만들기위한 독특한 전략을 설명합니다. 이러한 비계는 다양한 생물학적, 화학적 또는 기계적 신호에 의해 세포 행동을 조절하기 위해 이상적인 사용자 정의 환경을 제공 할 수

밀도 그라데이션 Multilayered 중합 (DGMP) : 멀티 칸 만들기위한 소설 기법, 조직 공학을위한 사용자 정의 공사장 공중 발판

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

이 절차의 전반적인 목표는 다층 세포 배양 골격을 만드는 것입니다. 이 동영상은 접착 펩타이드 RGDS를 교대층으로 통합하여 C 두 개의 C 12 세포 영역을 분리하는 2D 세포 배양 매트릭스를 생산하는 방법을 보여줍니다. 이는 먼저 RGDS 펩타이드를 acro 충성도 매크로에 테더링하여 수행됩니다.그런 다음 매크로 펩타이드 조합에 LOR 염료를 태그하여 다층 겔 층을 포함하는 펩타이드를 시각화할 수 있습니다. 두 번째 단계는 실리콘 시트에서 금형을 절단하고 두 개의 유리 슬라이드 사이에 끼워 넣고 각 층의 개별 구성 요소를 혼합하여 금형을 형성하는 것입니다. PEG RGDS Alexa three 50을 사용한 peg di acrl 및 peg di acrl의 솔루션은 금형 내에서 번갈아 가며 층을 이룹니다.겔은 UV 조사에 의해 중합됩니다. 마지막 단계는 기질 구성이 세포의 성장과 부착에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해 2D 다층 겔에 C 두 개의 C 12 세포를 시딩하는 것입니다. 궁극적으로, 명시야 및 형광 현미경 검사는 골격에서 C two C 12 세포의 선택적 성장을 시각화하는 데 사용됩니다.기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 다층 2D 및 3D 세포 배양 매트릭스를 만들기 위한 간단하고 비용 효율적인 방법이라는 것입니다. 값비싼 기기의 필요성에 의존하지 않습니다. 레이어 간의 인터페이스는 연속적이고 구조적으로 통합되어 있습니다.개별 레이어의 구성 요소 사이에는 혼합이 없습니다. 이 방법은 패턴화된 생물학적, 화학적, 기계적 신호에 반응하여 세포가 어떻게 이동하고 분극화되는지와 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 세포 이동 및 분화에 대한 부드러운 통찰력을 제공할 수 있으며 신경 줄기 세포의 새로운 우측 성장 및 시냅스 형성 지시와 같은 다른 시스템에 적용할 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 RGDS 펩타이드와 아크로 오일 페그 숙시닐 카보 메틸 에스테르를 아르곤의 건조 DMSO에서 1-2:1 몰비로 결합합니다. 그런 다음 NN diop, 프로필 메틸아민 또는 D-I-P-E-A를 aquilo PEG SCM에 비해 2:1 몰 비율로 첨가하여 반응을 촉진하고 곰팡이가 핀 TOF 질량 분석법을 사용하여 aquilo PEG RGDS 분자의 접합을 확인합니다. 이를 위해 별도로 AQUILO PEG RGDS 반응 용액 1마이크로리터와 비반응성 AQUILO PEGG SCM 1마이크로리터를 곰팡이가 핀 표적의 다른 지점에 추가합니다.둘 다 말리십시오. 그런 다음 THF 와류에서 1 분 동안 보편적 인 곰팡이 매트릭스의 포화 용액을 준비하고 동일한 두 지점에 1 마이크로 리터를 첨가합니다. 둘 다 말리십시오.다음으로 샘플을 로드합니다. SAVIS 골 스무딩 탑햇 베이스라인 감산 및 OID 피크 검출 알고리즘을 사용하여 약 19%의 출력으로 60헤르츠 레이저로 곰팡이가 핀 거친 분석을 수행합니다. acro PEG RGDS의 분자량은 공유 결합 펩타이드로 인한 질량 변화에 따라 오른쪽으로 이동해야 합니다.다음 단계는 아르곤 하에서 아르곤을 하룻밤 동안 배양하기 위해 최소한의 DMSO에 용해된 아퀼로 PEG SCM에 비해 중간 에스테르에서 3개의 50 카르복실산 흡입구를 등몰량으로 첨가하여 Fluor를 접합하는 것입니다. 그런 다음 3, 500 DAU 분자량 차단 투석 카세트를 사용하여 섭씨 4도에서 염료 물에 대해 투석하여 아크로 오일 페그 RGD S3 50을 정제합니다. 1001 용적 비율을 사용하여 48시간 동안 투석을 계속하고 하루에 최소 두 번 차가운 투석액을 교환합니다.제품은 0.22 미크론 주사기 필터를 통한 필터 살균으로 더욱 정제됩니다. 마지막으로, 멸균 환경에서 멸균 정제된 아크로 오일 페그 RGD S3 50을 멸균 사전 중량 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 열린 마이크로 원심분리기 튜브를 멸균 브리더 튜브 내에서 밀봉합니다.샘플을 동결 건조하고 각각 섭씨 영하 20도에서 파라핀 필름으로 밀봉하여 보관하십시오. 100% 메탄올로 슬라이드를 사전 세척하고 액체가 증발할 때까지 섭씨 80도의 오븐에서 건조합니다. 그런 다음 유리 슬라이드가 들어있는 접시를 흄 후드에 넣고 각 슬라이드에 250 마이크로 리터의 시그마 코트를 추가합니다.전체 표면을 코팅하기 위해 30초 동안 슬라이드를 부드럽게 흔듭니다. 다음으로, 코팅된 슬라이드를 100% 메탄올로 철저히 헹군 다음 최소 10ml의 물에 5분 동안 두 번 담가 세척 및 증류수를 사용합니다. 헹구면 슬라이드를 자연 건조시킵니다.실리콘 시트를 유리 슬라이드와 동일한 치수로 트리밍하여 0.8mm 두께의 실리콘 공간을 준비합니다. 그런 다음 생검 펀치를 사용하여 면도날로 실리콘에 10mm 또는 8mm 구멍을 뚫어 골격을 고정합니다. 비계 재료를 추가할 수 있도록 금형 상단에 약 2mm 채널을 만듭니다.그런 다음 실리콘 공간과 시그마 코트 처리된 유리 슬라이드를 오토클레이브하여 살균합니다. 또한 einor 튜브 및 집게와 같은 젤 주조를 위한 추가 재료를 살균합니다. 조직 배양 후드 필터에서 멸균 1ml 주사기와 0.2미크론 필터를 사용하여 Peg di aquil의 스톡 용액을 멸균합니다.먼저 50%PEG D acrl을 다양한 양의 멸균 60%IO DAL 원액 PBS 및 광 개시제와 결합하여 10%20%30% 및 40%I oal의 다양한 최종 농도를 산출하여 형광 표지된 15%PEG 프리 폴리머 용액을 준비하기 위해 용액을 철저히 혼합하여 개별 호박색 마이크로 쓰레기 튜브의 각 층에 대해 15%중량 대 부피 비율로 PEG 프리폴리머 용액을 공식화하는 것으로 시작합니다. 최종 농도 8밀리몰에서 50%PEG 디 아퀼 및 아퀼로 PEG RGD S3 50을 IO Dal 원액 PBS 및 광 개시제와 호박색 Microview 튜브에서 결합하여 15%25% 및 35%IO IRA의 농도를 산출하고 용액을 완전히 혼합합니다. 다음으로, 두 개의 시그마 공동 처리된 유리 슬라이드 사이에 미리 절단된 스페이서를 배치하여 금형 설정을 조립하고 클램프로 고정합니다. 일단 형이 조립되면, 40% 해결책의 10 마이크로리터를 첫째로 추가해서 겹이 쌓인 젤을 던지십시오, 그 후에 형광으로 레테르를 붙인 35% 해결책의 10 마이크로리터.대체 레이어링을 반복하여 여러 레이어를 만듭니다. 그런 다음 365나노미터의 빛을 금형에 3분 동안 조사합니다. 휴대용 UVR 9, 000 램프를 사용하여 중합된 하이드로겔이 5분 동안 경화되도록 합니다.그런 다음 클램프를 제거하고 상단 유리 슬라이드와 금형을 부드럽게 들어 올립니다. 층화된 밀도 구배. 다중 배치 중합 또는 DG MP 젤은 슬라이드에 남아 있습니다.멸균 주걱을 사용하여 금형에서 젤을 조심스럽게 제거하고 멸균 DMEM이 들어 있는 50ml 튜브에 넣습니다. 1000:1 부피의 DMEM을 사용하여 하루에 두 번의 완충액 교환으로 48시간 동안 중합된 겔을 세척합니다. 이렇게 하면 밀도, 개질제, 광 개시제 및 반응 프리 폴리머가 제거됩니다.그런 다음 DGMP 젤을 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에 보관하십시오. 교대하는 층을 시각화하려면 겔 문서화 장치의 샘플 트레이에 있는 자를 따라 DGMP 겔을 배열합니다. 그런 다음 DGMP 하이드로겔에서 3개의 짙은 색과 파란색 띠가 번갈아 나타나는 Alexa 50을 사용하여 겔을 노출시키고 이미지화하여 뚜렷한 화학 조성의 개별 층을 형성함을 보여줍니다.세포 배양을 위해 DGMP 젤을 준비하려면 48웰 세포 배양 플레이트의 웰에 부드럽게 삽입합니다. 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포 배양 배지에서 세 번 헹굽니다. 다음으로, 100mm 세포 배양 플레이트에서 C 2개의 C 12 근아세포가 60% 융합될 때 수확합니다.이렇게하려면 예열 된 PBS로 플레이트를 세 번 헹굽니다. 그런 다음 EDTA에 0.25% 트립 1밀리리터를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 2분 동안 배양합니다. 세포가 분리되면 1ml의 예열 배양 배지를 추가하고 원심분리를 위해 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.세포를 펠릿화한 후 Reeses, 성장 배지에 펜을 넣고 트리암 블루를 추가하고 TC 10 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다. 그런 다음 DG MP 골격에 C 2 개의 C 12 근 아세포를 파종하고 섭씨 37도에서 24 시간 동안 5 % 이산화탄소로 배양합니다. 에피 형광 및 위상차 현미경을 사용하여 DGMP 겔 층을 포함하는 RGDS에 C 2개의 C 12 근아세포가 부착되어 있는지 확인합니다.DGMP 겔의 교대층은 우측에 도시된 RGDS와 같은 다양한 펩타이드를 함유할 수 있으며, 이는 세포 부착 및 성장을 지원합니다. 그러나 왼쪽의 층에는 세포 부착 펩타이드가 포함되어 있지 않았고 세포는 해당 영역에서 생존하지 못했습니다. IO 디올은 겔 강성에 영향을 줄 수 있습니다.여기서, 탄성 계수는 원자력 현미경을 사용하여 측정되었습니다. 이 겔 제형에서 30%IAL을 사용할 때 강성이 60% 증가하는 것으로 나타났으며, 겔 강성에 대한 IAL의 영향은 사용되는 재료에 따라 다를 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 층의 순서를 기억하는 것이 중요합니다. IEX null이 가장 많은 계층이 맨 아래에 있고 IEX null이 가장 적은 계층이 맨 위에 있습니다.주변광으로 인한 중합을 방지하기 위해 끝에 광 개시 장치를 추가하는 것을 항상 잊지 마십시오. 우리는 공동 작업자들과 함께 이 기술을 적용하여 신경돌기 성장을 3D로 정리하고 있습니다. 이를 통해 건강한 개인에서 유래한 신경 전구 세포와 신경 발달 장애가 있는 환자에서 유래한 신경 전구 세포를 비교할 수 있습니다.자외선으로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 가교 단계를 수행하는 동안 UV 보호 안경을 착용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

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우리는 독립형 형태로 조립 및 조작할 수 있는 간단한 프로세스를 사용하여 미세 패턴화된 하이드로겔 시트의 제작을 설명합니다. 이러한 모듈식 하이드로겔 시트를 사용하면 제어된 세포 미세환경으로 간단한 매크로 스케일 3D 세포 배양 시스템을 생성할 수 있습니다.

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이 보고서는 저압 진공을 사용하여 생물학 연구를 위한 세포와 기질로 미세유체 채널을 채우는 간단하고 수행하기 쉬운 기술을 설명합니다.

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듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

상보적인 반응성 그룹을 갖는 마이크로겔 로드는 수용액에서 상호 연결될 수 있는 능력을 가진 마이크로유체공학을 통해 생산됩니다. 아니소메트릭 마이크로젤은 구형 기반 시스템에 비해 더 큰 기공을 가진 안정적인 구조물로 막히고 상호 연결됩니다. GRGDS-PC로 변형 된 마이크로 겔은 세포 배양에 사용할 수있는 거대 다공성 3D 구조물을 형성합니다.

마이크로젤 로드의 상호 연결된 거대 다공성 3D 스캐폴드

배우세요 다층 세포 배양 지지체를 만드는 비용 효율적인 DGMP 방법을 사용하여 RGDS 펩타이드와 C2C12 세포를 활용한 조직 공학 연구를 수행하는 기법입니다.

밀도 그라데이션 Multilayered 중합 (DGMP) : 멀티 칸 만들기위한 소설 기법, 조직 공학을위한 사용자 정의 공사장 공중 발판

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