Name: 높은 처리량 마이크로 캡슐 단일 셀 및 다중 셀 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: 배우세요 마이크로유체역학을 활용한 고주파 세포 캡슐화 기술로 단일 및 다중 세포를 정밀하게 포장하는 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 생물학 및 바이오의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는이 연구에서 널리 사용 PFPE-PEG 계면 활성제의 샘플 레인 댄스 기술 감사, 우리는 PDMS 채널 복제본을 만드는 데 사용되는 실리콘 웨이퍼 금형을위한 BioMEMS 자원 센터 (Mehmet 토너, 감독)을 감사드립니다.

이 섹션의 프로토콜 제시 실험 결과를 얻기 위해 특별히 활용 자재 및 장비를 설명합니다. 화학 물질 및 장비의 대체 공급 업체가 활용할 수 있습니다. 1. 장치 제조 및 소프트 리소그래피 표준 소프트 리소그래피 기법, 21 이전 주피터 문서에 등장되어있는 다수의, 22는 유리 기판에 보세 polydimethylsiloxane (PDMS) microchannel 네트워크를 만드는 데 사용되었습니다. 이외 SU-8 석판술에 의한 마스터 복제 금형 제조에서 공정 클린룸 또는 클린 후드 밖으로 수행될 수 있지만, 먼지와 입자는 아직 일관된 결과를 달성하기 위해 최소화되어야합니다. <ol><li> 의 AutoCAD (오토 데스크 주식 회사)의 그림 1에서와 같이 마이크로 채널 패턴을 디자인합니다. 높은 해상도 (50,000 dpi의) 트랜스를 인쇄하여 타사 제조 업체 (Fineline 이미징 주식 회사) 채용채널은 어두운 배경에 투명 Mylar 필름이나 석영에 parency 마스크. </li><li> 복제 성형을위한 실리콘과 SU-8 레지스트 마스터를 만듭니다. 간단히, 회전 SU-8 2050 깨끗한 7.5 cm 또는 10cm의 실리콘 웨이퍼에서 52 μm의 두께의 레이어를 만드는 스핀 - coater에 대한 제조 업체의 권장 RPM과 (MicroChem) 부정적인 포토 레지스트. 이후 소프트 베이킹, 에지 비드 제거, 연락처 마스크, 사후 노출 베이킹, 개발 및 홍수 노출, Dektak의 profilometer (Veeco)를 사용하여 SU-8 레이어의 실제 두께를 측정을 통해 자외선 노출. 테이프 4 &quot;또는 5&quot;배양 접시의 바닥쪽으로 마스터 몰드는 PDMS 복제 성형을 준비합니다. </li><li> 경화 요원에 10시 1분 비율 w / W 기반의 엘라스토머 경화 에이전트 (다우 코닝)와 믹스 PDMS 엘라스토머 기지이다. 2~3mm 최종 두께 레이어를 만드는 실리콘 마스터에 잘 혼합 PDMS 전구체 하거라. 2g의 경화 에이전트와 20g 엘라스토머 기지의 혼합물은 4 &quot;직경이 표면을 커버하기에 충분합니다. </li><li> maste를 배치드 가스 uncured PDMS로 진공 건조기에서 R 금형 및 PDMS (Jencons). 압력 레귤레이터 (콜 Parmer)을 사용하면 천천히 과도한 거품을 피하기 ~ 20 분 동안 HG &quot;-27으로 HG&quot;0에서 챔버 게이지 압력을 줄이십시오. 공기 거품이 사라질 때까지 30 분 또는 -27 &quot;HG에서 진공 챔버에서 장치를 둡니다. </li><li> 진공 풀어 65 ° 4 시간 최소 C 오븐 (써모 과학).로 마스터 몰드와 PDMS를 이동 장치는 경화를 개선하기 하룻밤 오븐에 남아있을 수 있습니다. </li><li> 오븐에서 장치를 제거하고 냉각 수 있습니다. 조심스럽게 PDMS 아웃 정밀 나이프와 껍질을 사용하여 원형 웨이퍼 주변 PDMS를 잘라. 메스로 그림 1과 같이 장치 개요를 잘라 버릴거야. </li><li> 생검 펀치를 사용하여 그림 1에 표시된 세 개의 둥근 지역의 펀치 유체 포트 (장치 지당 3). 이 장치의 경우 0.75 mm 외경 펀치 (해리스)을 사용합니다. </li><li> 를 제거 PDMS와 껍질의 패턴 측면에 스카치 테이프를 부착먼지. 기존의 산소 플라즈마 apparatuses에 대한 비용 절감하지만, 대안으로 21,22 플라즈마는 휴대용 실험실 코로나 treater (전기 기술 제품 INC를 사용하여 PDMS와 깨끗한 3 &quot;X 1&quot;유리 현미경 슬라이드의 패턴 측면을 취급 ..) 23이 장치는 퓸 후드 또는 오존 방전에 의한 환기가 잘되는 장소에서 사용되어야한다는 것을 참고, 모든 시계와 휴대 전화는 적어도 10 피트 정도 떨어져 보관해야합니다. 최소한이 sparking과 함께 안정적인 코로나을 달성하는 데 코로나 방전을 조정합니다. 천천히 약 20 초 동안 각각의 표면 위에 &quot;4분의 1에 대한 전극을 흔들 후 즉시 PDMS 표면들이 기본 상태로 돌아가려면 이전에 강력한 영구적인 유대를 형성하기 위해 접촉하게 대우 표면을 가지고. </li><li> 금속 접시에 장치를 놓고, 시원한 오븐에 곳이, 120 ° C로 오븐을 설정하고 결합을 완료하고이 고온 베이킹, T 중에는 원래 소수성 상태. 24 PDMS를 반환하기 위해 하룻밤 구워그 채널의 유리 표면도 유리쪽으로 얇은 소수성 층의 증착에 의한 소수성 렌더링됩니다. 또는, 그러한 Aquapel (PPG 산업)와 같은 소수성 코팅은 12 신중하게. 1 ML의 주사기와 주사기 바늘을 사용하여 유체 포트에 주입 수 있지만 단단히 유리 결합으로 PDMS 한방울 흘리지 않고 유체 포트에 공기를 정화하여 다음 Aquapel 투입 . 건조시 채널을 방해할 수있는 예금을 방지하기 위해 초과 Aquapel을 닦아 주네하면서 적극적으로 모든 유입구와 배출구 포트에서 공기 퍼지를 반복하십시오. </li></ol> 2. 샘플 준비 <ol><li> 선택한 셀 유형에 대한 설립 절차에 따라 세포 배양을 준비합니다. 본 연구에 사용된 특정 장치의 경우, 8-15 μm의 입자 또는 세포가 적절하게 캡슐을 위해 주문해야합니다. 작게 또는 더 큰 세포 유형은 적절한 재의 P를 달성하는 주력 채널의 크기를 변경해야 할 수도 있습니다. 날 위해서thod 시범 결과를 본 논문에 나타난, 9.9 μm의 폴리스티렌 microspheres은 (G1000, 써모 과학) 세포 美, 대리모로 활용됩니다. </li><li> 부드러운 혼합을 통해 수성 입자 또는 세포 현탁액을 준비합니다. 셀 또는 폴리스티렌 입자를 사용하는 경우, 농도 제어 이상 주문 캡슐을 달성하기 위해 (그림 4 참조) 필수적입니다. 이전의 데이터를 12 가이드로 사용하기 주문 열차 간격 및 마이크로 채널 크기에 따라 원하는 셀 또는 입자 농도를 계산 등 : 한 셀 또는 예상되는 길이 방향 열차 간격 시간에 초점을 맞추고 채널 단면적 당 입자. 주식 농도 (1 % w / w)이 불충 분한 경우, 부드럽게 혼합 혼합, 또는 gentler 와동에 의해 입자를, 주식 샘플을 centrifuging 뜨는 액체를 제거하고 다시 정지하여 (여기서는 1.5 % w / W까지) 농도를 증가 세포를 사용할 때. 원하는 수거 량과 FL과 관련된 런타임에 대한 계정에 충분한 볼륨을 준비오우, 튜닝. </li><li> 셀 및 폴리스티렌 입자는 모두 하나 이상의 비중 있습니다. 이 프로토콜에서 입증되지 않지만, 시간 많은 분 순서에 지속되는 장기간의 실험, 부력은 세포에 대한 입자 또는 OptiPrep (시그마 - 올드 리치)에 대한 같은 CaCl 2에 용질을 추가하여 솔루션을 일치합니다. </li><li> 15 ML의 원심 관에 플루오로 카본 오일 FC-40 (3M)와 PFPE-PEG 블록 공중 합체 계면 활성제 25 (2.5 % W / W) (레인 댄스 기술)를 혼합하여 지속 플루오로 카본 오일 단계의 10 ML 샘플을 준비합니다. 또는 가벼운 미네랄 오일 (PTI 공정 화학)는 아빌-EM 90 계면 활성제 (2.5 % W / W) (Evonik Goldschmidt 공사)와 함께 활용하실 수 있습니다. </li></ol> 3. 실험 설정 <ol><li> 거꾸로 광학 현미경 (Axio 옵저버, 자이스 혈구)와 고속 카메라 (팬텀 V310, 비전 연구)의 전원을 켜십시오. 또는 수동 장치를 이동하여 나막신과 파편을위한 채널을 집중하고 검사동력 현미경 스테이지를 사용하여. 액체가 흐르는 경우 일부 작은 파편이 밖으로 밀려 수 있습니다. 초점 채널의 파편 크게 품질을 주문 저하될 수 있으므로 큰 파편이나 명백한 나막신 내용은 장치에 다른 채널을 선택합니다. 나막신이 자주 무딘 핀셋으로 영향을받는 영역 위에 PDMS 표면에 단단히 눌러 흐름 하에서 제거할 수 있습니다. </li><li> 세 수성 유입을위한 PVC 튜브의 길이 (0.01 &quot;ID/0.03&quot;OD, Tygon), 기름 유입, 그리고 유제 콘센트를 자르고. 죽은 부피를 최소화하려면 충분한 튜브가 주사기 펌프에서 현미경 단계에 도달하는 했네요. 유체 포트에 삽입을 용이하게하기 위해 45 ° 각도로 튜브 엔드를 자르고. </li><li> 튜브는 1 단계에서 찍었다고 유체 포트에 끝나는 맞는 찍어서 각각 수성과 오일 유입 튜브 (아무 접착제 필요)의 자유로운 끝을 둘이 30 게이지 야기한 팁 스테인레스 스틸 주사기 바늘을 (SmallParts)에 맞게 눌러 핀셋을 사용하여 . 폐기물 R에 아울렛 튜브를 삽입eservoir. 이 튜브는 나중에 회수 저수지로 이동됩니다. </li><li> , 현미경의 무대 장치와 연결된 튜브를 이동 정렬과 가능한 목표를 (20x이 실험에 사용되었다)를 사용하여 장치의 노즐에 초점. 등 최적의 레코딩에 필요한 K hler 조명 및 기타 현미경 설정을위한 조정합니다. </li><li> 2 단계에서 준비 석유 위상 솔루션을 잘 혼합 수성 단계와 3 ML의 주사기 (BD)와 함께 1 ML의 주사기 (BD)를 입력합니다. 어떤 볼륨의 주사기 사용할 수있다는 조심스럽게 원하는 실행 시간 및 pulsatility의 최소화에 따라 선택해야합니다. 세로로 한 주사기를 기울이고 주사기 콘센트에 공기 방울을 이동 동요. 천천히 주사기 끝에 공기를 밀어 정도로 플런저를 우울하게. 주사기를 개최하는 것은 세로, 이미 단계 3.3에 장치에 연결된 각각의 주사기 바늘에 주사기를 연결합니다. 유체가 P까지 주사기 바늘 죽은 볼륨을 통해 공기를 강제로 플런저를 낮춰거의 장치에 튜브를 통해 ushed. 안전 주사기 펌프 (넥서스 3000, Chemyx)에 주사기를 탑재하고 플런저 블록을 참여. 두 번째 주사기에 대한 연결을 반복하고 두 번째 주사기 펌프를 탑재합니다. </li><li> 각각의 주사기 펌프 및 펌프 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 프로그램에 전원. Q 기름에 초기 유량을 설정 = 50 μL / 분 및 Q AQ = 5 μL / 각각 석유 단계와 수성 단계를위한 분. 펌프를 시작합니다. </li><li> 나머지 죽은 공기를 밖으로 밀어내는, 장치를 입력하고 채널을 채우기 위해 각 유체 기다립니다. 이것은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 입구 관에 공기의 다량이있다면 공기는 퇴학 때까지 일시적으로 각각의 유동 율을 향상시킬 수 있습니다. 잠재적으로 PDMS - 투 - 유리 채권 실패로 이어지는, 채널에 큰 압력이 발생되도록 높은 흐름 율을 증가하지 마십시오. </li><li> 초기 흐름 속도를 사용하여 노즐에서 드랍스의 형성을 관찰 (결과가 여기에 표시 : 20x magnificatio를N, 프레임 속도 21,005 프레임, 노출 3 μs). 프레임 속도를 극대화하고 가능하면 메모리 요구 사항을 줄이기 위해 전용 노즐로보기의 카메라 필드를 줄입니다. 샘플 동영상을 캡처하여 샘플링 속도가 앨리어싱을 피하기 위해 적절한 있는지 확인합니다. </li><li> (그림 2 참조) 제트 피하기 위해 낮은 수성 유동 률로 시작합니다. 천천히 유량 증가 긴 수용액 채널에서 입자의 순서 관찰하는 수성 흐름 속도를 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 입자 농도가 상대적으로 적은 &quot;누락&quot;입자와 샘플은 부력이 일치되지 않았습니다 함께 기차를 제공할 너무 낮으면 물리적으로 주사기 콘센트 방향으로 입자의 정착 점진적 제공하기 위해 주사기 콘센트쪽으로 주사기 펌프를 기울. 이 방법은 비디오 프로토콜에서 시연된다. 주기적으로 그 축을 따라 주사기를 회전하면 원치 않는 정착을 줄일 수 있습니다. </li><li> 적절한 주문이 발생하면, 세대 주파수를 조정하는 오일 유량을 조절하고안약 사이즈. 평균 드롭 볼륨이 같은 비디오 캡처로 측정 드롭 생성 주파수로 나눈 수성 유속을 사용하여 계산됩니다. Iteratively 원하는 캡슐 속도와 드롭 볼륨을 달성하기 위해 유속을 모두 조정할 수 있습니다. </li><li> 일단 안정 주문한 캡슐이 확정되고, 컬렉션 저수지로 폐기물 저수지에서 아울렛 튜브를 움직이거나 후속 테스트를 위해 다른 장치로 그것을 먹이. </li><li> 방울의 원하는 번호와 계산 세대 주파수에 따라 수집 시간을 결정합니다. </li><li> 또는 검사 수집 에멀젼 샘플을 pipetting하여 드롭 생성 비디오 결과 중 하나를 사용하여 효율성을 계량하기 위해 0, 1, 2, ..., N 입자가 들어있는 안약 분수를 기록합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 결과는 모두 제어 단일 입자 및 제어 이중 입자 캡슐화 (그림 3)을 달성하는 제공됩니다. 절단에 의한반으로 FC-40 오일 유량은 단일 입자 캡슐은 두 입자의 캡슐이됩니다. 반대로, 우리는 더 빨리 노즐로 입자를 제공하는 수성 유량 증가했을 수 있겠지만 우리는 수성 스트림 제트의 위험을 증가 것입니다. 그림 3에서 Histograms는 Poisson 통계에 대한 비교와 함께 두 가지 경우를 드롭 당 입자의 소수점 숫자를 제시. 제로 입자와 가끔 물방울 주로 주문한 열차에서 &quot;누락된&quot;입자로 인해, 지방 높은 입자 농도와 때로는 두 개의 수직 초점 순위 중 하나으로 마이 그 레이션 입자에서 원하는 결과를보다 캡슐 입자가 가지 경우 잠시. 제 2의 설명에 따라 일치하는 그 부력이 활용되지 않습니다. 대신, 주사기 펌프는 물리적으로 실행하는 동안 입자의 높은 농도로 이어지는, 주사기 콘센트 방향으로 입자의 정착하도록 기울어져되었다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 적절한 입자 및 세포 농도의 필요성을 보여주는 실험적인 실행은 그림 4에 표시됩니다. 전체 주문없이 지역화된 입자의 명령 그룹과이 캡슐하고 있지만 많은 물방울 입자 않고 있습니다. 히스토그램 원하는 두 입자의 캡슐에 대한 감소 캡슐 효율을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4096/4096fig1.jpg" /> 1. 봉지 장치를 그림. inlets, 아울렛, 그리고 긴 주문 채널) 전체 장치. 장치 높이가 52 μm의하며 주문 채널 폭 27 μm의입니다. B) 수성 및 석유 inlets 모두 오일 입구의 확대를위한 주문 채널 너비의 순서에 차이가있는 대형 파편 필터를합니다. C) 확대 노즐보기 22 μm의와 넓은 61 μm의 채널로 갑자기 팽창 노즐 수축에 의해 나타나는 수성 기름 채널, 27 μm의 동등한 채널 폭을 보여줍니다.여기에 표시된 장치의 크기가 microfabrication 후 profilometer를 사용하여 확인되었음을 참고 마스크의 공칭 치수가 약간 다릅니다. 주문 채널 및 노즐의 진정한 이미지로 온라인에서 사용할 수있는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4096/4096fig1supplement.jpg" target="_blank">보충 그림 1</a> . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4096/4096_mask.dwg" target="_blank">의 AutoCAD 마스크 파일</a> 도이 원고에 대한 보완으로서 온라인으로 포함되었습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4096/4096fig2.jpg" /> 그림 2. 넓은 장치 (80 μm의 x 세로 22 μm의 높이)를 사용 제팅 전환에 물떨어지는의 히스테리 시스. ) 상수 FC-40 유속에서 (Q 오일 = 45 μL / 분), 꾸준한 드롭 형성은 수성 흐름 속도 Q AQ = 8 μL / 분을 사용하여 10 kHz에서에서 발생합니다. 수성 유속이 느리게 10 &amp; M로 증가되면서U; 수성 유체 흐름의 제트 L / 분가 트리거됩니다. 나) 유량은 8 μL / 계속을 제팅 분에 반환하는 경우. 꾸준한 방울 형성​​이 간략 수성 흐름 펌프 (일초 일시 전형이다) 일시 중지하여 다시 설정할 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4096/4096fig3.jpg" /> 그림 3. 단일 및 이중 입자 캡슐. 드롭 당 하나의 세포 (와) 드롭 형성 Q 오일 = 60 μL / 분, Q AQ = 6.1 kHz에서 한 방울 생성 속도, 평균 방울 크기와 9 μL / 분) 24.4 PL, 그리고 단일 셀 캡쳐 효율성 두 개는 함께 D K = 79.5 % 및 P K = n의 샘플 크기에 83.7 % (λ = 0.95) D = 517 드랍스와 N P = 491 입자. 나) 드롭 형성 드롭 30 μ에 FC-40 유량 Q 오일을 줄임으로써 간단히 이루어진다L / 분. 대형 (39.8 PL) 방울 두 세포 캡처 효율 3.8 kHz에서의 속도로 형성되는 D K = 71.5 % 및 P k는 = 79.5 % (λ = 1.80) n의 샘플 크기에 D = 383 드랍스와 N P는 = 689 입자. CD) 두 histograms가 드롭 캡슐 입자 효율성 Poisson 통계 (무작위 캡슐)에 주문 단일 및 이중 입자 캡슐의 D K를 비교합니다. 두 경우 모두에 대해, 흐름의 방향으로 입자 간격을 완벽하게 주문, 번갈아 입자 17-18 대한 μm의 것이 있습니다. 모두 단일 및 이중 입자 캡슐을 보여주는 보충 동영상이 온라인 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4096/4096movie3a.avi" target="_blank">보충 영화 3a를 보려면 여기를 누르십시오</a> . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4096/4096movie3b.avi" target="_blank">보충 영화 3B를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 4. 농도가 크게 농도 감소로)는, 전체 주문이 발생하지 않습니다. 캡슐의 효율성에 영향을, 그리고 열차에 따라서 &quot;구멍&quot;은 예상 입자 미만으로 몇 방울을 떠나 등장. B) 히스토그램이 줄어들고 효율성 (보여줍니다 D K = 이중 입자 드랍스가있는만큼 많은 단일 입자가 = 1.57가 drops λ의 낮은 값으로 인해 두 입자 캡슐에 대해 55.9 %, P K = 70.9 %). Q 오일에서이 수치 결과 = 30 μL / 분 및 Q AQ = 9 μL / 분, 그림 3B와 동일 유량 조건입니다. 대표 보완 동영상을 온라인으로보실 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4096/4096movie4.avi" target="_blank">보충 무비 4를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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<li>Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dripping+to+Jetting+Transitions+in+Coflowing+Liquid+Streams%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams.</a> Physical Review Letters. 99, (2007).</li>
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<li>Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsification+in+a+microfluidic+flow-focusing+device%3A+effect+of+the+viscosities+of+the+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids.</a> Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).</li>
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<li>Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+novel+fluorous+surfactants+for+microdroplet+stabilisation+in+fluorous+oil+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams.</a> Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).</li>
<li>Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+3D+droplet+self-assembly+for+ultra-high-density+digital+micro-reactor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays.</a> Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).</li>
<li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).</li>
</ol>

JE는이 원고에 활용 기술을 바탕으로 대기중인 특허의 발명가이다.

주문 상대적으로 높은 학위에도 불구하고, 모든 물방울 입자 또는 세포의 적절한 숫자를 포함합니다. 봉지 효율은 세포 또는 그 총 개수로 나눈 원하는 인과 드랍스에 캡슐된다 입자의 개수로 계산됩니다. 이러한 원시 데이터가 수집 유제의 견본 자동화된 고속의 비디오 알고리즘이나 이미지에서 어느 얻을 수있다. 이것은 K 입자와 K 입자를 포함하는 것입니다 드랍스 D K의 분수를 포함하는 드롭으로 캡슐 입자 P K의 분율을 비교할 수 있습니다. 그림 3에서 모두 단일 및 이중 입자 캡슐 효율성이 두 요인 이상으로 무작위 캡슐의 효율성을 뛰어나다 크게 입자의 원하는 숫자 이상으로 안약 수를 줄일 그림 4는 높은 효율성을 적절한 농도의 필요성을 보여줍니다.; 그것은, &amp; lambd<html> ,, 입자 농도 및 드롭 볼륨 모두 기능은 비슷하거나 정확 캡슐 입자 또는 세포를 극대화하기 위해 드롭 당 원하...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 의 AutoCAD </td><td> 오토 데스크 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 투명 마스크 </td><td> Fineline 이미징 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SU-8 레지스트 </td><td> MicroChem </td><td> 2050 </td><td></td></tr><tr><td> Dektak의 Profilometer </td><td> Veeco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 페트리 요리 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 351,058 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td> 다우 코닝 주식 회사 </td><td> Sylgard 184, 자재 번호 (241) 4019862 </td><td></td></tr><tr><td> 진공 건조기 </td><td> Jencons </td><td> 250-030 </td><td></td></tr><tr><td> 배기기 </td><td> 알카텔 진공 기술 </td><td> 2010 C2 </td><td></td></tr><tr><td> 진공 레귤레이터 </td><td> 콜 - Parmer </td><td> EW-00910-10 </td><td></td></tr><tr><td> 오븐 </td><td> 써모 과학 </td><td> 린드버그 블루 M, OV800F </td><td></td></tr><tr><td> 생검 펀치, 0.75 mm </td><td> 해리스 </td><td> 단일 코어 15,072 </td><td></td></tr><tr><td> 실험실 코로나 Treater </td><td> 전기 제품 기술 주식 회사 </td><td> BD-20AC, SKU 12051A </td><td></td></tr><tr><td> 유리 슬라이드 </td><td> 골드 인감 </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> Aquapel </td><td> PPG 산업 </td><td></td><td> 대체 전략 </td></tr><tr><td> 폴리스티렌 Microspheres, 9.9 μm의 </td><td> 써모 </td><td> G1000 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> OptiPrep </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D1556 </td><td> 입증되지 않음 </td></tr><tr><td> Luer-Lok의 주사기 </td><td> BD </td><td> 한 ML : 309,628 3 ML : 309,585 </td><td></td></tr><tr><td> FC-40 플루오로 카본 오일 </td><td> 3M 주식 회사 </td><td> 시그마 알드리치, F9755 </td><td></td></tr><tr><td> PFPE-PEG의 불화 계면 활성제 </td><td> 레인 댄스 기술 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 가벼운 미네랄 오일 </td><td> PTI 프로세스 케미칼 </td><td> 08042-47-5 </td><td> 대체 전략 </td></tr><tr><td> 미네랄 오일 계면 활성제 </td><td> Evonik Goldschmidt 주식 회사 </td><td> 아빌 EM 90 </td><td> 대체 전략 </td></tr><tr><td> Tygon PVC 튜빙 </td><td> SmallParts </td><td> TGY-010 </td><td></td></tr><tr><td> 30 게이지 Luer-Lok 주사기 바늘, 1 / 2 &quot; </td><td> SmallParts </td><td> NE-301PL-C </td><td></td></tr><tr><td> 거꾸로 현미경 </td><td> 칼 자이스 혈구 이미징 </td><td> Axio Observer.Z1 </td><td></td></tr><tr><td> 고속 카메라 </td><td> 비전 연구 </td><td> 팬텀 V310 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 펌프 (2) </td><td> Chemyx 주식 회사 </td><td> 넥서스 3000 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 오일 </td><td> 다우 코닝 </td><td> 200 유체, 10 CST </td><td> 에멀젼 저장을위한 옵션 </td></tr></tbody></table>

높은 처리량 마이크로 캡슐 단일 셀 및 다중 셀

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

미세유체 캡슐화 방법은 이전에 세포를 피코리터 규모의 수성 단분산 액적 내에 포획하여, 벌크 유체 환경으로부터 격리시키는 기술로 활용되어 왔으며, 이는 고처리량 스크리닝, 유세포 분석 및 질량 분석법 등에 응용되고 있습니다. 본 연구에서는 단일 세포를 캡슐화할 뿐만 아니라, 정해진 수의 세포(본 실험에서는 1개 및 2개 세포 캡슐화 시연)를 반복적으로 포획하여, 격리 상태와 제어된 크기의 세포 그룹 간 상호작용을 모두 연구할 수 있는 방법을 설명합니다. 액적 생성 기술과 세포 및 입자 정렬을 결합하여, 효율적이고 연속적인 캡슐화를 위해 세포 크기의 입자를 제어하며 캡슐화하는 방법을 입증합니다. 수성 입자 현탁액과 비혼합성 플루오로카본 오일을 사용하여, 유동 집중 노즐(flow focusing nozzle)로 오일 내 수성 액적을 생성합니다. 수성 유체의 유속을 충분히 높게 설정하면, 액적 생성 빈도의 정수배 빈도로 노즐에 도달하는 입자 정렬이 이루어져 각 액적에 제어된 수의 세포가 캡슐화됩니다. 대표적인 결과 도출을 위해 9.9 μm 폴리스티렌 입자를 세포 대용물로 사용하였습니다. 본 연구 결과, 단일 입자 캡슐화 효율 Pk=1은 83.7%, 이중 입자 캡슐화 효율 Pk=2은 79.5%로 나타났으며, 이는 각각의 푸아송 효율인 39.3% 및 33.3%와 비교하여 매우 높은 수치입니다. 일관된 세포 및 입자 농도가 효율적인 캡슐화에 매우 중요하다는 점을 입증하였으며, 드리핑(dripping)에서 제팅(jetting)으로의 전이 현상에 대해서도 다루었습니다.
서론
연속 매질 수성 세포 현탁액은 세포들이 병렬로 상호작용할 수 있게 하고 매질 측정 시 특정 세포의 영향이 균질화되도록 하는 공통 유체 환경을 공유합니다. 세포를 피코리터 규모의 액적(drop)으로 고처리량 캡슐화하면 샘플이 격리되어 액적 간의 교차 오염을 방지하고, 샘플 내 세포 다양성의 측정을 가능하게 하며, 시약 및 발현된 바이오마커의 희석을 방지하고, 바이오리액터 생성물의 신호를 증폭할 수 있습니다. 또한 액적은 세포 간 신호 전달 연구를 위해 액적을 더 큰 수성 샘플로 다시 병합하거나 다른 액적과 병합하는 기능을 제공합니다.1,2 희석의 감소는 더 정확한 측정을 위한 더 강력한 검출 신호를 의미하며, 잠재적으로 비용이 많이 드는 샘플 및 시약 부피를 줄일 수 있는 능력을 제공합니다.3 액적 내 세포 캡슐화는 고처리량 스크리닝을 위한 단백질 발현,4 항체,5,6 효소7 및 대사 활성8의 검출을 개선하는 데 활용되어 왔으며, 고처리량 사이토메트리를 개선하는 데 사용될 수 있습니다.9 추가 연구에서는 질량 분석법10 및 표적 표면 세포 코팅11을 위한 세포 함유 액적의 바이오 전기분무(bio-electrospraying) 응용 사례를 제시합니다. 그러나 일부 응용 분야는 액적에 캡슐화되는 세포 수를 제어하는 능력이 부족하여 제한적이었습니다. 본 연구에서는 하나 및 두 개의 세포에 대해 입증된 캡슐화 효율을 높이며, 더 많은 수의 세포 캡슐화로 확장 적용 가능한 정렬 캡슐화12 방법을 제시합니다.
단분산 액적 생성을 위해, 미세유체 "흐름 집중(flow focusing)" 기술은 스트림이 수렴하는 노즐을 사용하여 다른 유체(연속 오일 상) 내에 조절 가능한 크기의 유체(수성 세포 혼합물) 액적을 생성할 수 있게 합니다.13 주어진 노즐 기하학적 구조에서, 액적 생성 빈도 f와 액적 크기는 오일 및 수성 유량인 Qoil과 Qaq를 조절하여 변경할 수 있습니다. 유량이 증가함에 따라, 흐름은 액적 생성 단계에서 노즐로부터의 불안정한 수성 유체 제팅(jetting) 단계로 전이될 수 있습니다.14 
수성 용액에 현탁 입자가 포함되어 있을 때, 입자들은 노즐에서 캡슐화되어 서로 격리됩니다. 무작위로 분포된 수성 세포 현탁액을 사용하여 액적을 생성할 때, k개의 세포를 포함하는 액적의 평균 비율 Dk는 포아송 통계(Poisson statistics)에 의해 결정되며, 여기서 Dk = λk exp(-λ)/(k!)이고 λ는 액적당 평균 세포 수입니다. "정확하게" 캡슐화된 액적에 포함되는 세포의 비율은 Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk')를 사용하여 계산합니다. 이 두 지표의 미묘한 차이점은 Dk는 수성 용액의 활용도 및 캡슐화 이후 수행되어야 하는 액적 분류량과 관련이 있는 반면, Pk는 세포 샘플의 활용도와 관련이 있다는 점입니다. 예를 들어, 희석된 세포 현탁액(낮은 λ)을 사용하여 세포를 포함하는 대부분의 액적이 단 하나의 세포만 포함하도록 캡슐화할 수 있습니다. 이 경우 효율성 지표인 Pk는 높겠지만, 대다수의 액적은 비어 있게 되어(낮은 Dk), 빈 액적을 제거하기 위한 분류 메커니즘이 필요하게 되며 이는 처리량을 감소시키는 원인이 됩니다.15
액적 생성과 관성 정렬을 결합하면 무작위 캡슐화보다 액적당 세포 수를 더 예측 가능하게 조절할 수 있으며, 더 높은 처리량으로 액적을 캡슐화할 수 있습니다. 관성 초점화(Inertial focusing)는 Segre와 Silberberg에 의해 처음 발견되었으며16, 유한한 크기의 입자가 채널 흐름 내의 횡방향 평형 위치로 이동하려는 경향을 의미합니다. 관성 정렬(Inertial ordering)은 입자와 세포가 수동적으로 일정한 간격의 엇갈린 일정 속도 행렬로 조직되는 경향을 말합니다. 초점화와 정렬 모두 충분히 높은 유속(높은 레이놀즈 수)과 입자 크기(높은 입자 레이놀즈 수)가 필요합니다.17,18 여기서 레이놀즈 수 Re =uDh/ν 및 입자 레이놀즈 수 Rep =Re(a/Dh)2이며, u는 특성 유속, Dh [=2wh/(w+h)]는 수력 직경, ν는 동점성 계수, a는 입자 직경, w는 채널 너비, h는 채널 높이입니다. 경험적으로, 완전히 정렬된 행렬을 달성하는 데 필요한 길이는 Re와 Rep가 증가함에 따라 감소합니다. 높은 Re 및 Rep 요구 사항(본 연구에서는 각각 약 5 및 0.5 수준)이 액적 생성 노즐에서의 제팅(jetting) 현상을 피하기 위해 수상 유속을 낮게 유지해야 하는 필요성과 충돌할 수 있음에 유의하십시오. 또한, 높은 유속은 세포에 더 높은 전단 응력을 유발하며, 이는 본 프로토콜에서 다루지 않습니다. 이전의 정렬 캡슐화 연구에 따르면, 본 연구와 유사한 유동 조건에서 단일 캡슐화된 HL60 세포의 90% 이상이 세포막 무결성을 유지한 것으로 나타났습니다.12 하지만 다른 세포 유형과 유동 파라미터로 확장 적용할 때는 전단 응력의 크기와 시간 척도의 영향을 주의 깊게 고려해야 합니다. 세포 정렬, 액적 생성, 그리고 세포 생존율에 따른 수상 유속 제약 조건들이 겹치는 구간은 단일 및 다중 세포의 제어된 캡슐화를 위한 이상적인 운전 영역을 제공합니다.
입자 간 열(train) 간격을 다룬 연구가 매우 적기 때문에,19,20 해당 간격은 경험적으로 결정하는 것이 가장 쉬우며, 이는 채널 기하학적 구조, 유량, 입자 크기 및 입자 농도에 따라 달라집니다. 그럼에도 불구하고 열 사이의 측면 간격이 일정하다는 것은 세포가 예측 가능하고 일관된 시간 간격으로 도착함을 의미합니다. 정렬된 세포가 노즐에 도착하는 속도와 동일한 속도로 액적 생성이 이루어지면, 세포는 제어된 방식으로 액적 내에 캡슐화됩니다. 이 기술은 15 kHz 수준의 처리량으로 단일 세포를 캡슐화하는 데 활용되었으며,12 이는 60-160 Hz 수준의 캡슐화 속도를 보고한 이전 연구들에 비해 크게 개선된 결과입니다.4,15 제어된 캡슐화 연구에서는 액적의 80% 이상에 단 하나의 세포만이 포함되었으며, 이는 평균 40% 미만의 효율을 예측하는 푸아송(Poisson, 무작위) 통계에 비해 효율성이 크게 향상된 것입니다.12
이전의 제어 캡슐화 연구에서는,12 방울당 평균 입자 수 λ는 단일 세포 캡슐화를 제공하도록 조정되었습니다. 우리는 유속 조절을 통해 λ가 방울당 원하는 세포 수와 같거나 근접할 때, 방울당 임의의 세포 수를 효율적으로 캡슐화할 수 있다고 가설을 세웠습니다. 단일 세포 캡슐화는 자극에 대한 개별 세포의 반응을 결정하는 데 유용하며, 다중 세포 캡슐화는 제어된 수와 종류의 세포 간 상호작용과 관련된 정보를 제공합니다. 본 문서에서는 수동 관성 정렬 채널과 방울 생성 노즐을 사용하여 다중 세포를 제어하여 캡슐화하는 프로토콜, 폴리스티렌 미세구체를 이용한 대표적인 결과 및 관련 논의를 제시합니다.

세포 및 입자의 관성 주문과 monodisperse 드롭 생성을 결합하여, 우리는 kHz에서 속도에서 한 방울의 세포 또는 입자의 원하는 숫자를 캡슐하는 방법을 설명합니다. 우리는 두 번 단일 및 이중 입자 술을 정렬되지 않은 캡슐 분들을 초과 효율성을 보여줍니다.

미세유체 캡슐화 방법은 이전에 세포를 피코리터 규모의 수성 단분산 액적 내에 포획하여 구속 환경을 제공하는 데 활용되어 왔으며...

소량의 피코리터 크기 액적에 캡슐화된 세포를 이용하는 응용 분야들은 액적당 세포 수를 제어할 수 없다는 점으로 인해 종종 제한을 받아왔습니다. 본 프로토콜에서는 유체 역학적 세포 정렬과 유동 집속 마이크로 노즐에서의 액적 생성이라는 두 가지 서로 다른 미세유체 현상을 결합하여 세포 캡슐화를 제어하는 방법을 제시합니다. 상류 채널에서 세포나 입자가 현탁된 수용액을 충분히 높은 유량으로 공급함으로써, 하류 흐름 방향으로 동일한 간격을 가진 열을 형성하게 합니다.계면활성제로 안정화된 허용 오일 담체 유체 내에서 킬로헤르츠(kHz) 속도로 수성 액적을 형성하기 위해 유동 집중 액적 생성 노즐을 사용합니다. 이후 수성 및 오일 유속을 조절하여 액적 생성 속도를 노즐에 도달하는 종방향 정렬 세포 또는 입자의 도달 시점에 동기화함으로써, 정렬된 세포 입자 열을 액적 생성과 결합하며, 이때 입자는 세포 대용물로 사용됩니다. 이 프로토콜을 입증하기 위해서는 유속을 충분히 낮게 설정하여 유체를 제한해야 합니다.생물학적 세포에 가해지는 전단 응력, 세포 배열의 중첩, 액적 생성 및 세포 생존율을 분석하였습니다. 수성 유량 제한은 단일 및 다중 세포의 제어된 캡슐화를 위한 이상적인 작동 범위를 제공합니다. 비디오 현미경 데이터 분석 결과, 단일 및 이중 세포 또는 입자 캡슐화 효율이 무작위 캡슐화 효율보다 우수하며, 원하는 수의 세포나 입자가 포함되지 않은 액적의 수를 크게 줄이는 것으로 나타났습니다.세포와 액적의 가둠은 벌크 현탁액과 비교했을 때 세포 분비물의 희석을 제한하고 세포의 이질성을 부각시키며 세포 간 신호를 제어합니다. 이러한 세포들을 액적 내에 캡슐화하는 효율적인 수단은 생물학 연구자들에게 가치 있는 도구를 제공합니다. 이 절차를 시작하기 위해, AutoCAD 소프트웨어에서 이 그림에 표시된 것과 같이 마이크로채널 패턴을 설계하십시오.긴 채널 섹션은 너비가 27 µm인 수성 흐름 정렬 채널을 나타냅니다. 확대된 노즐 도식에서는 수성 정렬 채널과 오일 채널의 너비가 모두 27 µm로 동일하며, 이어서 22 µm의 노즐 수축 구간을 거쳐 너비 61 µm의 더 넓은 채널로 급격히 확장되는 구조를 보여줍니다. 장치의 높이는 52 µm입니다.수성 및 유성 유입구 모두에 유성 유입구의 확대 모식도에서 보여주는 바와 같이 정렬 채널 너비 수준의 간격을 가진 대형 이물질 필터가 설치되어 있습니다. 여기는 염료가 주입된 정렬 채널과 노즐의 실제 이미지입니다. 어두운 배경에 채널 부분이 투명하게 처리된 고해상도 투명 마스크를 Mylar 필름 또는 쿼츠 위에 인쇄하기 위해 외부 전문 업체를 이용하십시오.이어서 복제 성형(replica molding)을 위한 실리콘 및 SU-8 포토레지스트 마스터를 제작합니다. PDMS 복제 성형을 위해 마스터 몰드를 페트리 접시 바닥에 테이프로 고정합니다. 복제 성형이 완료되고 장치의 외곽선을 따라 절단한 후, 외경 0.75 millimeter 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 그림에 표시된 세 개의 원형 영역에 유체 포트를 뚫습니다. 플라스마 본딩 후에는 PDMS의 패턴 면에 스카치 테이프를 붙였다 떼어내어 먼지를 제거합니다.PDMS를 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 부착합니다. 장치 전체를 오븐에 넣고 온도를 120 °C까지 점진적으로 올립니다. 결합을 완료하고 PDMS를 원래의 소수성 상태로 되돌리기 위해 장치를 120 °C 오븐에 하룻밤 동안 둡니다.채널의 유리 표면을 소수성으로 만드는 대체 방법은 aquae와 같은 코팅제를 유체 포트로 주입한 후 공기로 퍼지(purge)하는 것입니다. 1 mL 주사기와 주사 바늘을 사용하여 공기 수백 µL를 흡입한 후, 금속 주사기 팁을 채울 정도의 아주 적은 양의 aquil을 흡입합니다. 주의 깊게, 하지만 단단하게 aquil을 주입한 다음 퍼지용 공기를 유체 포트로 주입하십시오. 이때 PDMS와 유리의 결합이 강하게 파손되지 않도록 주의하십시오.건조 시 채널을 막을 수 있는 침전물이 생기는 것을 방지하기 위해, 모든 유입구 및 유출구 포트의 공기 퍼지를 반복하면서 과도한 수분을 닦아냅니다. 적절한 수의 방울에 적절한 수의 세포가 포함되도록 하려면 세포 농도를 조절하는 것이 필수적입니다. 여기에는 두 가지 까다로운 요소가 있습니다.첫 번째는 적절한 농도를 사전에 추정하는 것이며, 두 번째는 실험 중에 해당 농도를 유지하는 것입니다. 본 연구에 사용된 특정 장치의 경우, 제어된 캡슐화를 위해 8~15 micron 크기의 세포 또는 입자가 적절합니다. 본 시연에서는 9.9 micron 크기의 polydiary 미세구체를 세포 대용물로 사용합니다. 이상적인 캡슐화를 달성하기 위한 수성 입자 현탁액 농도를 준비하려면, 완전한 정렬을 위한 이전 데이터를 사용하여 1% solids(중량 기준)의 미세구체 스톡 농도로 시작하십시오. 가이드라인으로서, 스톡 샘플 1 mL를 부드럽게 원심분리하여 상층액 250 µL를 제거하고, 볼텍스 믹싱 또는 더 부드러운 혼합 방식으로 입자를 재현탁함으로써 농도를 1.5% solids로 높이십시오.본 영상에는 나타나지 않았으나, 세포를 사용할 때 세포와 폴리스티렌 입자 모두 비중이 1보다 큽니다. 수 분에서 수 시간 정도 지속되는 장기 실험의 경우, 입자에는 염화칼슘과 같은 용질을, 세포에는 opti prep을 첨가하여 용액의 부력을 맞출 수 있습니다. 세포 또는 입자 현탁액이 준비되면, 15 mL 원심분리관에 10 mL의 연속상 플루오로카본 오일 샘플을 준비한 후 볼텍싱합니다.계면활성제와 플루오로카본 오일을 약 2.5% w/w 비율로 혼합합니다. 본 실험에서는 2.4 w/w 혼합물을 얻었으며, 이는 마이크로 캡슐화 실험을 설정하는 데 적절한 수치입니다. 먼저, 도립 광학 현미경과 고속 카메라의 전원을 켭니다.마이크로채널 층에 집중하여 채널 내에 막힘이나 떨어져 나올 수 있는 잔해물이 있는지 검사하십시오. 큰 잔해물이나 뚜렷한 막힘이 없는 채널을 선택하십시오. 데드 볼륨을 최소화하기 위해 수성 입구, 오일 입구 및 에멀젼 출구용으로 반투명 tigon PVC 튜빙을 세 개의 길이로 절단하십시오.시린지 펌프에서 현미경까지 닿을 정도의 튜브를 절단합니다. 유체 포트에 삽입하기 쉽도록 튜브 끝단을 45도 각도로 자릅니다. 핀셋을 사용하여 튜브 끝단을 유체 포트에 압입하여 고정합니다. 그런 다음, 수성 유입 튜브의 빈 끝단에 30 gauge 뭉툭한 팁의 스테인리스 스틸 시린지 바늘을 압입하여 고정합니다.오일 유입 튜브에 대해서도 동일하게 반복합니다. 장치를 이동시키고 튜브를 현미경 스테이지에 부착한 후, 20배 대물렌즈를 사용하여 장치 노즐의 정렬 및 초점을 맞춥니다. 초점 평면에서 최적의 조명을 제공할 수 있도록 현미경의 쾰러 조명(Kohler illumination)을 수동으로 조절합니다.고속 카메라 소프트웨어를 사용하여 노즐 주변의 시야를 크롭함으로써 프레임 속도를 높인 다음, 최적의 녹화에 필요한 프레임 속도, 노출 시간 및 기타 카메라 설정을 설정하십시오. 그다음, 이전에 준비하여 잘 혼합된 수상 용액을 1 mL 주사기에 채우십시오. 유상 용액은 3 mL 주사기에 채우십시오.충전된 주사기 중 하나를 수직으로 세우고 톡톡 쳐서 공기 방울을 주사기 배출구 쪽으로 이동시킵니다. 주사기를 수직으로 세운 상태에서 플런저를 천천히 눌러 공기가 주사기 팁까지 밀려 나갈 때까지 충분히 누릅니다. 주사기를 장치에 이미 장착된 해당 주사기 바늘에 연결합니다.플런저를 눌러 시린지 바늘의 데드 볼륨을 통해 공기를 밀어내어, 액체가 튜빙을 타고 장치 직전까지 도달하게 합니다. 시린지를 시린지 펌프에 단단히 고정하고 플런저 블록을 체결합니다. 두 번째 시린지도 동일하게 연결한 후 두 번째 시린지 펌프에 장착합니다. 각 시린지 펌프의 전원을 켜고 설정을 프로그래밍합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 초기 유량을 오일 상은 50 µL/min, 수용액 상은 5 µL/min으로 설정합니다.수성상 시작 시, 펌프는 각 유체가 장치에 진입하여 채널을 채우고 남아 있는 공기를 밀어낼 때까지 대기합니다. 초기 유속을 사용할 경우 이 과정에 수 분이 소요될 수 있습니다. 노즐에서 액적이 형성되는지 관찰하십시오.수용액 유량을 천천히 증가시켜 긴 수용액 솔루션 채널 내에서 입자들이 정렬되는 것을 관찰하십시오. 유량을 증가시킬 때, 다른 액적 생성 노즐을 사용한 이 예시에서 보이는 것처럼 노즐에서 수용액 흐름의 제팅(jetting)이 유발되는 지점까지 유량을 높이지 마십시오. 여기서 불안정한 흐름과 일관성 없는 액적이 나타납니다. 입자 농도가 너무 낮아 누락되는 입자가 상대적으로 적은 교차 열을 형성하지 못하고 샘플의 부력이 일치하지 않는 경우, 시린지 펌프를 시린지 배출구 쪽으로 물리적으로 기울여 입자들이 시린지 배출구 쪽으로 서서히 가라앉도록 하십시오.적절한 정렬이 이루어지면, 오일 유량을 조절하여 드롭의 생성 빈도와 크기를 조정합니다. 원하는 캡슐화율과 드롭 부피를 얻을 때까지 두 유량을 반복적으로 조절하십시오. 안정적인 정렬 캡슐화가 확인되면, 배출 튜브를 폐기물 저장조에서 꺼내 향후 사용을 위한 수집 저장조로 옮깁니다.단일 및 이중 입자 또는 세포 캡슐화를 높은 효율로 달성할 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜을 이용한 대표적인 단일 입자 캡슐화 결과는 오일 유속 60 µL/min 및 수성 유속 9 µL/min 조건에서의 결과입니다. 방울당 평균 입자 수인 람다(Lambda) 값은 0.95입니다.완전히 정렬된 교차 입자의 경우 흐름 방향으로의 입자 간격은 약 17~18 microns입니다. 이 예시에서 액적 생성률은 6.1 kilohertz이며 평균 액적 크기는 24.4 picoliters입니다. 히스토그램은 단일 입자 캡슐화의 순서와 더하기(+)가 있는 경우의 액적 캡슐화 입자 효율을 비교하여 보여줍니다.통계적으로, 517개 액적의 표본 크기에 대한 무작위 캡슐화의 경우, 하나의 입자를 포함하는 액적의 평균 분율은 79.5%였으며, 이는 예측된 무작위 캡슐화 분율인 36.7%와 대조됩니다. 491개 입자의 표본 크기에서 적절하게 캡슐화된 액적에 포함된 입자의 분율은 83.7%로 관찰된 반면, 무작위 캡슐화 분율은 37.3%였습니다. 수성상 유량을 9 microliters per minute로 유지하면서 오일 유량을 30 microliters per minute로 줄임으로써 간단하게 이중 입자 캡슐화를 달성할 수 있습니다. 여기서 액적당 평균 입자 수인 lambda는 1.8입니다. 이는 단일 입자 캡슐화와 유사합니다.완전하게 정렬된 교대 입자의 경우 흐름 방향으로의 입자 간격은 약 17에서 18 µm입니다. 더 큰 액적의 평균 크기는 39.8 pL이며, 무작위 캡슐화와 비교하여 3.8 kHz의 속도로 형성되었습니다. 383개의 액적 샘플 크기에서, 두 개의 입자를 포함하는 정렬된 캡슐화 액적의 평균 분율은 71.5%였으며, 이는 예측된 무작위 캡슐화 분율인 26.8%와 대조됩니다. 689개의 입자 샘플 크기에서 올바르게 캡슐화된 액적에 포함된 입자의 분율은 79.5%로 관찰된 반면, 무작위 캡슐화 분율은 33.4%였습니다.종합하면, 이러한 결과는 단일 및 이중 입자 캡슐화 효율이 무작위 캡슐화 효율보다 2배 이상 뛰어나며, 원하는 수의 세포나 입자를 포함하지 않는 액적의 수를 크게 줄인다는 것을 보여줍니다. 높은 캡슐화 효율을 위해 적절한 입자 또는 세포 농도가 중요하다는 점이 이번 실험 과정에서 잘 나타납니다. 오일 및 수상 유속은 앞서 보여준 이중 입자 캡슐화 실행 시와 동일하지만, 액적당 평균 세포 수인 lambda는 1.57로 감소되었습니다.결과적으로 완전한 정렬이 일어나지 않아 트레인 내에 빈 공간이 생기며, 이로 인해 예상보다 적은 수의 입자를 포함한 선 드롭(sun drops)이 생성됩니다. 이 히스토그램은 Lambda 값이 낮아짐에 따라 두 개의 입자를 캡슐화하는 효율이 감소함을 보여줍니다. 324개 드롭의 표본 크기에서 두 개의 입자를 포함하는 드롭의 평균 비율은 55.9%였으며, 단일 입자 드롭의 수가 이중 입자 드롭의 수와 거의 비슷했습니다.이는 드롭당 캡슐화되는 입자나 세포의 수를 최대화하기 위해, 드롭당 허용 가능한 세포 수가 적은지 많은지에 따라 람다(Lambda) 값을 선택하여 람다가 원하는 드롭당 세포 수와 같거나 그에 가깝게 설정되어야 함을 나타냅니다. 본 시연에서는 부력 불일치를 이용하여 실험 중 농도를 실시간으로 제어합니다. 하지만 장기 실험의 경우, 세포를 수성 드롭 내에 캡슐화한 후 더 일관된 결과를 얻기 위해 부력을 맞추는 것이 권장될 수 있습니다.시간 의존적 실험은 원심분리 튜브 내에서 수행하거나, 미세유체 어레이에 액적을 다시 주입하여 현미경 하에서 수행할 수 있습니다.

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연구

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