높은 처리량 마이크로 캡슐 단일 셀 및 다중 셀

작은 피콜리터 크기의 방울로 캡슐화된 세포를 활용하는 응용 분야는 방울당 세포 수를 제어할 수 없기 때문에 종종 제한되었습니다. 이 프로토콜은 흐름 집중 마이크로 노즐에서 두 가지 뚜렷한 미세유체 현상, 유체 역학적 세포 주문 및 방울 생성을 결합하여 세포 캡슐화를 제어하는 방법을 보여줍니다. 업스트림 채널에서는 부유 셀 또는 입자가 있는 수용액의 충분히 높은 유속이 제공되어 하류 흐름 방향으로 동일한 간격을 가진 트레인을 형성합니다.

유량 집중 입자 생성 노즐은 계면활성제 안정화 허용 가능한 오일 운반체 유체에서 킬로헤르츠 속도로 수성 방울을 형성하는 데 사용됩니다. 그런 다음 정렬된 cell particle train은 수성 및 오일 유속을 조정하여 drop generation과 결합되어 입자가 cell surrogate로 사용되는 동안 종방향으로 정렬된 cell 또는 particle이 drop generation nozzle에 도착하는 것과 동기화되는 drop generation 속도를 제공합니다. 이 프로토콜을 입증하려면 유속이 유체를 제한할 수 있을 만큼 충분히 작아야 합니다.

생물학적 세포에 대한 순전한 스트레스, 세포 순서 드롭 생성 및 세포 생존력의 중복. Aqueous flow rate constraints는 단일 및 다중 세포의 제어된 캡슐화를 위한 이상적인 운영 체제를 제공합니다. 비디오 현미경 데이터 분석에 따르면 단일 및 이중 세포 또는 입자 캡슐화 효율이 모두 무작위 캡슐화 효율을 능가하고 원하는 수의 세포 또는 입자를 포함하지 않는 방울 수를 크게 줄일 수 있습니다.

세포와 방울의 감금은 세포 분비물의 희석을 제한하고 세포 이질성을 강조하며 벌크 현탁액과 비교할 때 세포 간 신호도 제어합니다. 이러한 세포를 방울로 캡슐화하는 효율적인 방법은 생물학 연구자가 이 절차를 시작하는 데 유용한 도구를 제공합니다. AutoCAD 소프트웨어에서 이 그림과 같이 마이크로채널 패턴을 설계합니다.

긴 채널 섹션은 너비가 27미크론인 수성 흐름 주문 채널을 나타냅니다. 확대된 노즐 회로도는 수성 주문 채널과 오일 채널에 대해 27미크론의 동일한 채널 폭을 보여주며, 그 후 22미크론의 노즐 수축과 더 넓은 61미크론 채널로의 갑작스러운 팽창을 보여줍니다. 장치 높이는 52미크론입니다.

수성 유입구와 오일 유입구 모두 오일 주입구의 확대된 회로도에서 볼 수 있듯이 주문 채널 너비 순에 갭이 있는 큰 파편 필터를 가지고 있습니다. 표시. 다음은 염료가 주입된 주문 채널과 노즐의 실제 이미지입니다. 타사 제조업체를 고용하여 채널이 어두운 배경에서 투명한 Mylar 필름 또는 석영에 고해상도 투명 마스크를 인쇄합니다.

그런 다음 복제 성형을 위한 실리콘 및 SU 8 포토레지스트 마스터를 만듭니다. PDMS 복제 성형을 위해 마스터 금형을 페트리 접시 바닥에 테이프로 붙입니다. 복제 성형이 완료되고 장치 윤곽을 잘라낸 후 0.75mm 외경 생검 펀치를 사용하여 이 그림에 표시된 세 개의 둥근 영역의 유체 포트를 펀칭하고 PDMS의 패턴 면에 스카치 테이프를 붙이고 플라즈마 본딩 후 먼지를 제거하여 제거합니다.

PDMS를 깨끗한 유리 현미경 슬라이드로 이동합니다. 전체 장치를 오븐에 넣고 오븐을 섭씨 120도까지 서서히 예열합니다. 장치를 섭씨 120도의 오븐에 밤새 두어 접착을 완료하고 PDMS를 원래 소수성 상태로 되돌립니다.

채널의 유리 표면을 소수성으로 만드는 또 다른 방법은 아쿠아와 같은 코팅을 유체 포트에 주입한 다음 공기로 퍼지하는 것입니다. 1밀리리터 주사기와 주사기 바늘을 사용하여 수백 마이크로리터의 공기를 빨아들인 다음 금속 주사기 팁만 채울 수 있을 만큼 소량의 아퀼을 조심스럽게 주입하되 아쿠아를 단단히 주입한 다음 퍼지 공기를 유체 포트로 주입합니다. PDMS를 깨뜨리지 않고 유리를 공격적으로 접착합니다.

모든 흡입구 및 전망 포트에서 공기 퍼지를 반복하면서 건조 시 채널을 막을 수 있는 침전물을 방지하기 위해 과도한 아쿠아를 닦아내십시오. 세포 농도를 제어하는 것은 적절한 수의 세포에서 적절한 수의 방울을 달성하는 데 필수적입니다. 여기에는 두 가지 어려운 요소가 있습니다.

첫 번째는 사전에 적절한 농도를 추정하는 것이고, 두 번째는 실험 중에 해당 농도를 유지하는 것입니다.이 연구에 사용된 특정 장치의 경우 8-15미크론 세포 또는 입자가 제어된 캡슐화를 위해 적절하게 주문해야 합니다. 이 시연에서는 9.9 미크론 폴리 다이어리 마이크로스피어를 세포 대리물로 사용하여 이상적인 감사 캡슐화를 달성하기 위해 수성 입자 현탁액 농도를 준비하고, 전체 주문을 위해 이전 데이터를 사용하여 중량 기준 1%고형물의 마이크로스피어 스톡 농도로 시작합니다. 참고로, 1ml의 스톡 샘플을 부드럽게 원심 분해하여 농도를 1.5% 고형물로 높이고, 250마이크로리터의 수피네이트 액체를 제거하고, 소용돌이 혼합 또는 더 부드러운 혼합으로 입자를 현탁시킵니다.

세포를 사용할 때 세포와 폴리스티렌 입자 모두 1보다 큰 비중을 갖지만 이 비디오에는 표시되지 않습니다. 몇 분에서 몇 시간까지 지속되는 장기 실험의 경우, 입자에 대해 염화칼슘과 같은 용질을 추가하거나 세포에 대해 opti prep과 같은 용질을 첨가하여 용액을 일치시킬 수 있습니다. 세포 또는 입자 현탁액이 준비된 후 15ml 원심분리기 튜브 와류에서 연속 플루오로카본 오일 상의 10ml 샘플을 준비합니다.

계면 활성제와 플루오로 카본 오일을 약 2.5 % 중량으로 혼합합니다. 여기서 우리는 마이크로 캡슐화 실험을 설정하는 데 허용되는 2.4 중량의 중량 혼합물을 얻습니다. 먼저 도립 광학 현미경과 고속 카메라의 전원을 켭니다.

마이크로 채널 층에 초점을 맞추고 채널에 막힘과 이물질이 있는지 검사하십시오. 큰 파편이나 명백한 막힘이 없는 채널을 선택하십시오. 수성 입구 오일 입구와 에멀젼 출구에 대해 3가지 길이의 반투명 tigon PVC 튜브를 절단하여 데드 볼륨을 최소화합니다.

주사기 펌프에서 현미경까지 닿을 수 있을 만큼만 튜브를 자릅니다. 45도 각도로 튜브 끝을 스테이지 절단 유체 포트에 쉽게 삽입할 수 있도록 핀셋을 사용하여 튜브 끝을 유체 포트에 압입합니다. 그런 다음 30 게이지 무딘 팁 스테인리스 스틸 주사기 바늘을 수성 입구 튜브의 자유 끝에 밀어 넣습니다.

오일 주입 튜브에 대해 반복합니다. 장치를 이동하고 튜브를 현미경 스테이지에 부착합니다.tage 20회 대물렌즈를 사용하여 정렬하고 장치 노즐에 초점을 맞춥니다. 초점면에서 최적의 조명을 제공하기 위해 Kohler 조명에 대한 현미경을 수동으로 조정합니다.

고속 카메라 소프트웨어 크롭을 사용하여 노즐 주변의 시야를 더 높은 프레임 속도를 허용한 다음 최적의 녹화를 위해 필요에 따라 프레임 속도, 노출 시간 및 기타 카메라 설정을 지정합니다. 다음으로, 1ml 주사기에 미리 준비된 잘 혼합된 수성 상 용액을 채웁니다. 3ml 주사기에 오일 상 용액을 채웁니다.

채워진 주사기 중 하나를 수직으로 기울이고 튕겨 기포를 주사기 배출구로 이동합니다. 주사기를 수직으로 잡고 있는 주사기 팁으로 공기를 밀어 넣을 수 있을 만큼 충분히 오랫동안 플런저를 천천히 누릅니다. 장치에 이미 부착된 해당 주사기 바늘에 주사기를 연결합니다.

플루이저가 주입기를 눌러 유체가 튜브를 통해 거의 장치에 밀려 들어갈 때까지 공기가 주사기 바늘 데드 볼륨을 통해 통과하도록 하고 주사기를 주사기 펌프에 단단히 장착하고 플런저 블록과 맞물립니다. 두 번째 주사기에 대해 연결을 반복하고 두 번째 주사기 펌프에 장착하고 각 주사기 펌프의 전원을 공급하고 각 펌프를 프로그래밍합니다. 제조업체의 프로토콜을 사용하여 초기 유속을 오일 상의 경우 분당 50마이크로리터, 분당 5마이크로리터로 설정합니다.

수성상 시작을 위해 펌프는 각 유체가 장치에 들어가 남아 있는 죽은 공기를 밀어내는 채널을 채울 때까지 기다립니다. 초기 유속을 사용하여 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 노즐에서 방울의 형성을 관찰하십시오.

긴 수용액 채널에서 입자의 순서를 관찰하기 위해 수성 유속을 천천히 증가시킵니다. 유속이 증가함에 따라 이 예에서 볼 수 있듯이 노즐에서 수성 유체 흐름의 분사가 트리거되는 지점까지 유속이 증가하지 않기 때문에 다른 방울 생성 노즐 노트를 사용하면 불안정한 흐름과 일관되지 않은 방울이 여기에 있습니다. 입자 농도가 너무 낮아 누락된 입자가 상대적으로 적은 교대 트레인을 제공할 수 없고 샘플의 부력이 일치하지 않는 경우, 실린지 펌프를 실린지 배출구 쪽으로 물리적으로 기울여 입자가 주사기 배출구 쪽으로 점진적으로 안정화

적절한 주문이 발생하면 오일 유량을 조정하여 생성 빈도와 방울 크기를 조정합니다. 두 유속을 반복적으로 조정하여 원하는 캡슐화 속도를 달성하고 볼륨을 떨어뜨립니다. 안정적인 주문 캡슐화가 확인되면 나중에 사용할 수 있도록 폐기물 저장소에서 배출 튜브를 수집 저장소로 이동합니다.

단일 및 이중 입자 또는 세포 캡슐화는 고효율로 달성될 수 있습니다. 여기에 표시된 이 프로토콜을 활용하면 오일 유속이 분당 60마이크로리터이고 수성 유속이 분당 9마이크로리터인 단일 입자 캡슐화의 대표적인 결과가 있습니다. 람다, 드롭에 대한 평균 입자 수는 0.95입니다.

흐름 방향의 입자 간격은 완전히 정렬된 교대 입자의 경우 약 17-18미크론입니다. 이 예제의 드롭 생성 속도는 6.1kW이며 평균 드롭 크기는 24.4피코리터입니다. 히스토그램은 단일 입자 캡슐화 순서의 방울 캡슐화 입자 효율을 플러스와 비교합니다.

통계에서 517 방울의 샘플 크기에 대한 무작위 캡슐화, 하나의 입자를 포함하는 방울의 평균 비율은 79.5%인 반면, 예측된 무작위 캡슐화 비율은 36.7%입니다.올바르게 캡슐화된 방울에 도달하는 입자의 비율은 491개 입자의 샘플 크기에 대해 83.7%로 관찰되었습니다. 무작위 캡슐화 비율은 37.3%였지만 이중 입자 캡슐화는 수성 유속을 분당 9마이크로리터로 유지하면서 오일 유량을 분당 30마이크로리터로 줄임으로써 달성됩니다. 여기서 람다, 방울당 평균 입자 수는 1.8입니다. 단일 입자 캡슐화와 유사합니다.

흐름 방향의 입자 간격은 완전히 정렬된 교대 입자의 경우 약 17-18미크론입니다. 더 큰 방울은 평균 39.8피코리터의 입자 크기를 가지며 무작위 캡슐화에 비해 3.8킬로헤르츠의 속도로 형성되었습니다. 383 방울의 표본 크기에 대해, 두 개의 입자를 포함하는 정렬된 캡슐화 방울의 평균 분율은 71.5%이며, 예측된 무작위 캡슐화 분율은 26.8%와 대조적입니다.올바르게 캡슐화된 방울에서 경향을 보이는 입자의 분율은 689개 입자의 표본 크기에 대해 79.5%로 관찰된 반면, 무작위 캡슐화 분율은 33.4%였습니다.

이러한 결과는 단일 및 이중 입자 캡슐화 효율이 모두 무작위 캡슐화 효율을 2배 이상 능가하고 원하는 수의 세포 또는 입자를 포함하지 않는 방울 수를 크게 줄인다는 것을 보여줍니다. 높은 캡슐화 효율을 위한 적절한 입자 또는 세포 농도의 중요성이 이 실험 실행에 설명되어 있습니다. 오일 및 수성 유속은 이전에 표시된 이중 입자 캡슐화 실행과 동일하지만 드롭 람다당 평균 셀 수는 1.57로 감소합니다.

결과적으로 완전한 순서가 발생하지 않으므로 열차의 구멍이 발생하여 예상보다 적은 입자로 태양 방울을 남깁니다. 이 히스토그램은 Lambda의 낮은 값으로 인해 두 개의 입자 캡슐화에 대한 효율성이 감소한 것을 보여줍니다. 324방울의 표본 크기에서 두 개의 입자를 포함하는 방울의 평균 비율은 55.9%였으며 이중 입자 방울과 거의 같은 수의 단일 입자 방울이었습니다.

이는 드롭당 더 적거나 더 많은 셀이 허용 가능한지 여부에 따라 올바르게 캡슐화된 입자 또는 선택한 람다의 정확한 값으로 셀을 최대화하기 위해 Lambda가 방울당 원하는 세포 수와 같거나 가까워야 함을 나타냅니다. 이 시연에서는 부력 불일치를 활용하여 실험 중 농도를 실시간으로 제어할 수 있습니다. 그러나 장기 실험의 경우 세포를 수성 방울로 캡슐화한 후 보다 일관된 결과를 위해 부력 일치를 사용하는 것이 바람직할 수 있습니다.

시간 의존적 실험은 원심분리기 튜브 또는 현미경 아래에서 방울을 미세유체 어레이에 다시 주입하여 수행할 수 있습니다.