Name: 단일 세포 다중 오믹스 실험을 위한 마우스 경동맥 내강에서 내피 세포 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 마우스 경동맥에서 내피 세포와 핵을 분리하여 단일 세포 다중 오믹스 실험을 수행하는 방법을. 교반 혈류 조건에서 동맥경화증 관련 분자 경로를 연구하고 치료 표적을 식별할 수 있습니다.

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이 작업은 국립 보건원 보조금 HL119798, HL095070 및 HL139757에서 HJ에 대한 자금으로 지원되었습니다. HJ는 또한 Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship의 지원을 받고 있습니다. Emory Integrated Genomics Core (EIGC)가 제공 한 서비스는 Emory University School of Medicine의 보조금을 받았으며 National Institutes of Health의 Georgia Clinical and Translational Science Alliance에서도 부분적으로 지원되었습니다. UL1TR002378. 위에 제공된 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원의 공식 견해를 반영하지 않습니다.

아래에 설명 된 모든 동물 절차는 Emory University의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 비 고 콜레스테롤 혈증, 연령 및 성별 일치 C57BL / 6 마우스를 사용하여 성별에 따른 변이를 완화하고 고 콜레스테롤 혈증 상태의 합병증을 상쇄했습니다.
1. 부분 경동맥 결찰 (PCL) 수술
참고: LCA의 부분 경동맥 결찰은 이전에 기술되고 입증된 바와 같이 수행되었다3.
<ol><li>마취 기화기를 사용하여 절차 전반에 걸쳐 이소플루란 흡입(유도를 위해 산소에서 5% 이소플루오란, 유지를 위해 그 후 1.5%)으로 마우스를 마취합니다. 수술 중 체온 손실을 방지하기 위해 마우스 앙와위를 델타페이즈 등온 패드에 놓습니다.</li>
	<li>노출 각막염을 예방하기 위해 안구 연고를 바르고 발가락 핀치 반응이없는 경우 마취 깊이를 확인하십시오.</li>
	<li>부 프레 노르 핀 0.05 mg / kg을 피하 주사하여 통증을 선제적으로 관리합니다. 베타 딘과 이소프로판올 용액으로 3 번 도포하고 청소하여 제모 된 부위를 소독하십시오. betadine이 중앙에서 시작하여 측면에서 끝나는 수술 부위를 살균하는 마지막 단계인지 확인하십시오.</li>
	<li>무균 기술을 사용하여 목 부위에 복부 정중선 절개(~1cm)를 하고 무딘 해부로 LCA 분기점을 노출시킵니다.</li>
	<li>왼쪽 내 경동맥, 외부 경동맥 및 후두 동맥을 6-0 실크 봉합사로 결찰하십시오. 상 갑상선 동맥은 그대로 두십시오.</li>
	<li>피부를 근사화하고 조직 접착제 및/또는 봉합사로 절개 부위를 닫습니다.</li>
	<li>마우스를 예열된 회복 케이지(37°C로 유지)로 옮기고 수술 후 저체온증을 방지하기 위해 최대 1시간 동안 깨끗한 수건 위에 놓습니다. 참고: 우리의 경험에 비추어 볼 때, 부 프레 노르 핀 (0.05 mg / kg)의 선제 적 단일 용량은 일반적으로 수술 후 통증 관리에 충분합니다. Buprenorphine의 반복 용량은 동물이 처음 24 시간 후에 고통 스러울 경우 투여 할 수 있습니다. 올바르게 수행되면이 절차와 관련된 사망률이 없으며 마우스에 대한 수술 후 스트레스가 최소화됩니다. 마우스는 각각의 케이지로 돌아가 수술 후 매일 모니터링됩니다.</li>
	<li>관류 설정을 준비합니다.<ol><li>IV 백에 10 U / mL 헤파린을 함유 한 0.9 % NaCl (생리 식염수)을 사용하십시오. IV 백을 지면에서 244-274cm(8-9피트) 또는 해부 보드보다 약 122-152cm(4-5피트) 높은 곳에 걸습니다. 나비 바늘을 식염수 라인 끝에 부착하고 IV 라인에서 기포를 씻어냅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 희생 후 경동맥 분리
<ol><li>마우스를 기관 IACUC 프로토콜에 따른CO2 흡입으로 희생시켰다.</li>
	<li>마우스 피부에 70 % 에탄올을 뿌리고 흡착제 종이 타월이 들어있는 해부 보드의 앙와위 위치에 놓습니다. 접착 테이프 또는 21G 바늘을 사용하여 해부 보드의 흡착제 타월에 마우스 발을 고정합니다.</li>
	<li>한 쌍의 멸균 가위를 사용하여 복부에서 시작하여 흉부 상단까지 마우스의 피부를 제거하십시오.</li>
	<li>한 쌍의 가위를 사용하여 무딘 해부로 흉곽 아래의 복벽을 엽니 다.</li>
	<li>가위를 사용하여 횡격막의 길이를 따라 조심스럽게 절개하고 흉골을 들어 올릴 수있을 때까지 흉부 양쪽의 갈비뼈를 통해 계속하십시오. 한 쌍의 집게로 흉골을 부드럽게 들어 올리십시오. 그런 다음 흉곽을 제거하여 심장을 노출시킵니다.</li>
	<li>흉선과 심장 위의 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 주요 혈관을 시각화하십시오.</li>
	<li>혈액이 닫힌 순환에서 빠져 나갈 수 있도록 가위로 대정맥을 절단하십시오.</li>
	<li>심장의 정점을 통해 IV 라인에 연결된 21G 나비 바늘을 좌심실에 삽입하고 실온에서 일반 식염수로 2-3 분 동안 역행 관류를 허용합니다. 식염수 백을지면에서 8-9 피트 높이로 유지하여 일반 식염수의 일정한 유속이 유지되도록하십시오. 알림: 폐와 간이 창백해져 최적의 관류를 나타냅니다. 각 마우스에는 약 20mL의 관류 완충액이 사용됩니다.</li>
	<li>목 부위에서 피부를 제거하고 모든 지방, 근육 및 결합 조직을 제거하여 경동맥을 노출시킵니다 (그림 1A). 알림: 나머지 절차는 해부 현미경으로 수행됩니다.</li>
	<li>시야를 조정하여 결찰 부위를 찾습니다. 10mm 미세 해부 가위를 사용하여 LCA의 결찰 부위 아래에 작은 절개를하여 관류를 허용합니다.</li>
	<li>좌심실을 통해 추가로 1분 동안 다시 관류하고 LCA가 잘 관류되고 눈에 보이는 혈액 흔적이 없는지 확인합니다.</li>
	<li>가는 끝 집게와 작은 스프링 가위를 사용하여 경동맥이 몸에 붙어있는 동안 경동맥을 둘러싼 외막 주위 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 알림: 이 세척 단계에서 경동맥을 짜내거나 늘리지 않도록 매우 주의하십시오., 생존할 수 없는 세포의 수를 증가시킬 수 있으므로. 올바르게 수행되면 최종 세포 현탁액에서 세포 생존율은 일반적으로 >93%입니다.</li>
</ol>3. 생쥐 경동맥에서 내피 세포가 풍부한 단일 세포 분리
참고: 아래에 설명된 시약은 미리 준비하여 사용할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다: 표 1에 나열된 시약과 함께 1x 및 0.1x 단일 핵 용해 완충액; 단일핵 세척 완충액과 표 1에 열거된 시약; 단일 핵 핵 버퍼 제조법과 표 1에 나열된 시약. 이러한 완충액의 작업 재고는 제조업체의 프로토콜에 따라 준비되어야 합니다. 소화 완충액 조성 : 0.5 % 태아 소 혈청 (FBS) 함유 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 콜라게나제 II 유형 600 U / mL 및 DNase I 60 U / mL.
<ol><li>경동맥이 아직 붙어있는 동안 경동맥 외부를 일반 식염수로 씻어 혈액의 흔적을 씻어냅니다.</li>
	<li>29G 바늘이 장착 된 인슐린 주사기를 사용하여 ~ 50μL의 소화 완충액을 왼쪽 경동맥 말단부 내강에 주입합니다. 소화 완충액이 경동맥을 채우기 시작하면 경동맥의 근위 끝을 마이크로 클립으로 고정합니다(그림 1B). 15-20 μL의 분해 완충액을 루멘에 추가로 도입하고 분해 완충액의 방출을 피하기 위해 말단부를 자릅니다.</li>
	<li>마우스에서 경동맥을 조심스럽게 이식하고(그림 1B, C) 따뜻한 (37°C에서) Hepes 완충 식염수가 포함된 35mm 접시에 넣습니다. 알림: 두 cl이 모두 단단히 배치되었는지 확인하십시오.amps. 클램프가 느슨해지면 소화 용액이 루멘 밖으로 누출되어 얻은 세포 수에 영향을 줄 수 있습니다. 이 경우 경동맥의 열린 끝에서 29G 바늘이 장착된 인슐린 주사기를 사용하여 효소 용액을 추가하고 클램프를 다시 고정합니다(그림 1D). 효소 완충액이 다시 누출되면 이식 과정에서 경동맥이 절단 될 가능성이 있습니다. 이 경우 경동맥을 폐기하고 샘플에서 연구를 제외하십시오. 경동맥을 반복적으로 거칠게 취급하면 세포 생존율과 단일 세포 제제의 품질이 저하됩니다. 왼쪽 및 오른쪽 경동맥을 식별하고 올바르게 표시하도록주의하십시오.</li>
	<li>이식된 경동맥을 간헐적 흔들림과 함께 37°C에서 45분 동안 배양한다.</li>
</ol>4. 경동맥 세척
<ol><li>내강 효소 소화를 완료 한 후 35mm 접시에서 클램프와 함께 경동맥을 제거하십시오. 소화 완충액이 누출되지 않도록주의하면서 각 클램프를 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>1.5mL 미세 원심 분리기 튜브 위에 미세한 집게로 경동맥의 한쪽 끝을 부드럽게 잡습니다. 다른 손으로 100μL의 따뜻한 분해 완충액(37°C)이 들어 있는 인슐린 주사기가 장착된 29G 바늘을 루멘에 삽입합니다(그림 1D).</li>
	<li>경동맥의 내강을 미세 원심 분리기 튜브로 빠르게 플러시하십시오. 1.5mL 튜브에 0.3mL의 FBS를 첨가하여 효소 반응을 차단합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 참고: 플러싱에는 내강 효소 소화의 세포가 포함되어 있습니다. FBS를 추가하고 온도를 낮추면 효소 소화 과정이 중지됩니다. 제제의 세포 수가 많고 파편이나 지방 조직을 포함하는 경우 원치 않는 조직 파편을 걸러내기 위해 50 또는 70μm 세포 여과기를 사용하는 것이 좋습니다. 단일 세포 수를 늘리려면 여러 경동맥을 플러시하는 것이 좋습니다. 여기에서 최소 5,000 개의 세포를 얻기 위해 10-12 개의 경동맥을 플러싱하고 하나의 샘플로 풀링했습니다.</li>
	<li>고정 각도 로터가 장착된 원심분리기를 사용하여 4°C에서 5 분 동안 500×g에서 셀을 원심분리합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>상청액을 버리고 세포 해리 시약이 들어 있는 소화 완충액( 재료 표 참조)에 세포 펠릿을 37°C에서 5분 동안 재현탁시켜 모든 세포를 단일 세포로 분리합니다. 알림: 준비물의 셀 수가 적 으면 원심 분리기 속도를 최대 2,000-3,000 ×g까지 높여 셀을 스핀 다운하십시오. 또한 0.5mL 원심분리 튜브를 사용하면 튜브 바닥에서 세포 펠릿을 더 잘 시각화할 수 있습니다.</li>
	<li>0.5mL 튜브에 0.15mL의 FBS를 첨가하여 효소 반응을 차단합니다.</li>
	<li>단세포 현탁액을 500 ×g에서 4°C에서 5 분 동안 원 심분리하고, 단계 4.4에서와 같이 고정각 로터가 장착된 원심분리기를 사용한다.</li>
	<li>상청액을 버리고 세포를 0.2mL 마이크로 원심분리 튜브의 PBS 중 100μL의 얼음처럼 차가운 1% 소 혈청 알부민(BSA) 용액에 재현탁합니다. 참고: 0.2mL 원심분리 튜브를 사용하면 튜브 바닥에 있는 단일 셀 펠릿의 시각화가 향상됩니다.</li>
</ol>5. 단일 세포 및 단일 핵 분석
<ol><li>scRNAseq에 대한 단일 세포 제제를 다시 일시 중단하고 제출합니다.<ol><li>단일 셀 펠릿을 0.2mL 튜브의 PBS에 얼음처럼 차가운 1% BSA 100μL로 재현탁합니다.</li>
		<li>단일 세포 캡슐화를 위해 세포를 재현탁시킨 후 즉시 미세 유체 기반 단일 세포 분할 및 바코드 시스템을 사용하여 단일 세포 캡슐화 및 바코드를 진행합니다 ( 재료 표 참조).</li>
		<li>샘플을 유전체학 코어에 제출하기 전에 단일 세포 제제를 세고 검사하십시오. 세포 응집체가 없는지 확인하십시오. 참고: 단일 셀의 응집은 BSA 양을 최대 2%까지 증가시켜 더욱 최소화할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>scATACseq에 대한 단일 세포 제제를 다시 중단하고 제출하십시오.<ol><li>세포 펠렛을 빙냉 1x PBS 중 0.04% BSA 중 100μL에 재현탁하고 4°C에서 500× g에서 단일 세포 현탁액을 원심분리합니다.</li>
		<li>단일 세포 현탁액을 얼음처럼 차가운 0.1x 용해 완충액(표 1)으로 용해하고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>용해물을 P-20 피펫으로 10회 혼합하고 추가로 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>용해된 세포에 500μL의 냉장 세척 완충액(표 1)을 추가하고 피펫을 사용하여 5회 혼합합니다. 알림: 70μm 세포 여과기를 사용하여 세포 현탁액에서 파편을 걸러내고 2mL 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>용해물을 500 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 핵-펠렛을 희석된 핵 완충액(150 μL)에 재현탁시킨다( 재료 표 및 표 1 참조). 혈구계11을 사용하여 단일 핵 제제를 계수하고 검사합니다.</li>
		<li>단일 핵 전이, 핵 분할, 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위해 단일 핵 샘플을 Genomics Core에 제출합니다. 참고: 초기 세포 수가 낮으면 핵을 따라 파편을 관찰하는 것이 일반적입니다. 따라서 높은 셀 번호로 시작하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow%2C+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li>
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<li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li>
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<li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491(2020).</li>
<li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
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<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180(2021).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210(2019).</li>
</ol>

HJ는 FloKines Pharma의 설립자입니다. 다른 저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

이 논문은 마우스 경동맥에서 단일 세포 제제를 분리하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. PCL 수술이 올바르게 수행되면 내피 세포에 대한 d-flow 의 영향을 정확하게 연구 할 수 있습니다. 외경동맥, 내경동맥, 후두동맥 및 상갑상선동맥과 같은 총경동맥의 가지를 정확하게 식별하는 것이 중요합니다. 초음파 검사에 의한 유동 패턴의 검증은 d-flow 조건의 성공적인 시작을 더욱 검증합니다. PCL 수술은 연령에 관계없이 마우스에서 수행 할 수 있지만 선호되는 연령은 10 ± 2 주입니다. 나이가 많은 생쥐와 고 콜레스테롤 혈증 배경을 가진 생쥐는 일반적으로 외막 주위 지방이 더 많고 피부가 뻣뻣한 경향이 있습니다. 
경동맥 내피가 풍부한 단일 세포 제제를 주변 조직과 외막 주위 지방이없는 조심스럽게 해부하는 것이 필수적입니다. 경동맥의 내강은 단일 세포 제제에서 혈액 세포를 오염시키지 않도록 철저히 관류되어야합니다. 부적절한 조직 식별 및 라벨링은...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Nicolas Villa-Roel1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments

이 실험실은 이전에 d-flow의 유도가 고지혈증 마우스 1,2에서 빠르고 견고한 죽상 동맥 경화증 발달로 이어진다는 것을 입증했습니다. d-flow-유도 죽상동맥경화증의 새로운 마우스 모델은 부분 경동맥 결찰(PCL) 수술을 사용하여 가능했습니다3. PCL 수술은 결찰된 좌경동맥(LCA)에서 낮고 진동적인 혈류 상태 또는 d-flow를 유도합니다. 대조적으로, 반대쪽 우경동맥(RCA)은 계속해서 안정적인 층류(s-flow)에 직면합니다. 이전에는 내피 세포에 대한 d-flow의 효과를 이해하기 위해 부분 결찰 수술 후 경동맥을 해부하고 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트 기반 용해제(내막 RNA/DNA 플러싱 방법)2,4로 플러싱하여 내피가 풍부한 "풀링된 벌크" RNA 또는 DNA를 제공했습니다. 이러한 풀링된 벌크 RNA 또는 DNA는 전사체 연구 또는 후성유전체 DNA 메틸롬 연구를 위해 각각 4,5,6으로 처리되었습니다. 이 연구는 내피 생물학 및 죽상 동맥 경화증에서 역할이 광범위하게 조사 된 여러 흐름에 민감한 유전자와 microRNA를 발견하는 데 도움이되었습니다 4,6,7.
그러나 내피 농축에도 불구하고 이러한 대량 RNA / DNA 연구는 d- 흐름 유발 죽상 동맥 경화증에서 동맥벽에서 각 세포 유형의 특정 역할을 구별 할 수 없었습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 내피-농축 단일세포(sc) 분리 및 scRNA 및 scATAC 시퀀싱 연구가 수행되었다8. 이를 위해, C57Bl6 마우스는 s-flow가 노출된 RCA를 대조군으로 사용하면서 LCA에서 d-flow를 유도하기 위해 PCL 수술을 실시하였다. PCL 수술 2 일 또는 2 주 후, 마우스를 희생시키고 경동맥을 해부하고 청소했습니다. LCA와 RCA의 내강에는 콜라게나 제가 주입되었고, ECs를 중요한 분획으로 함유하는 내강 콜라게나제 소화물과 다른 동맥 세포가 수집되었습니다. 단일 세포 현탁액(scRNAseq) 또는 단일 핵 현탁액(scATACseq)을 준비하고 10x Genomics 설정을 사용하여 각 세포 또는 핵에 대한 고유 식별자로 바코드화했습니다. RNA를 cDNA 라이브러리 제조를 실시하고 시퀀싱하였다.
scRNAseq 및 scATACseq 데이터 세트는 Cell Ranger Single-Cell Software를 사용하여 처리되었으며 Surat 및 Signac R 패키지 9,10에 의해 추가로 분석되었습니다. 각 세포와 핵은 이러한 분석으로부터 세포 유형을 할당하고 마커 유전자 및 고유 한 유전자 발현 패턴을 기반으로 세포 유형으로 클러스터링되었습니다. scRNAseq 및 scATACseq의 결과는 이러한 단일 세포 제제가 EC가 풍부하고 평활근 세포 (SMC), 섬유 아세포 및 면역 세포를 포함한다는 것을 입증했습니다.
추가 분석에 따르면 내강 소화의 EC 개체군은 매우 발산하고 플라스틱 (8 개의 다른 EC 클러스터)이며 혈류에 반응합니다. 가장 중요한 것은 이러한 결과가 d-flow 가 EC를 죽상 보호 항염증 표현형에서 전염증, 내피에서 중간엽으로의 전이, 내피 줄기/전구 세포 전이, 그리고 가장 놀랍게도 내피에서 면역 세포로의 유사 전이를 포함한 전이동맥 보호 항염증 표현형에서 전이형 동맥경화성 표현형으로 재프로그래밍한다는 것을 입증했습니다. 또한 scATACseq 데이터는 새로운 흐름 의존적 염색질 접근성 변화 및 전사 인자 결합 부위를 게놈 전반에 걸친 방식으로 밝혀 몇 가지 새로운 가설의 기초를 형성합니다. 마우스 경동맥으로부터의 단일 세포 다중 오믹스 연구를 위한 단일 내피 세포를 제조하기 위한 방법론 및 프로토콜은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td><td>Corning</td><td>21040CMX12</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Protein LoBind microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>022-43-108-1</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tube - 폼 랙, sterile</td><td>Fablab</td><td>FL4022</td><td></td></tr><tr><td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td><td>Labcon</td><td>3191-335-028</td><td></td></tr><tr><td>6-0 실크 봉합사 멸균</td><td>Covidien</td><td>s-1172 c2</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Cell Strainer, White, sterile, Individual-packaged</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Accutase solution, 멸균 여과</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>ATAC 버퍼(전치 혼합물의 구성 요소 I)</td><td>10x Genomics</td><td>2000122</td><td></td></tr><tr><td>ATAC Enzyme(Transposition Mix의 구성 요소 II)</td><td>10x Genomics</td><td>2000123/ 2000138</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>메드-벳 인터내셔널</td><td>RXBUPRENOR5-V</td><td></td></tr><tr><td>크롬 컨트롤러 & 다음: GEM 액세서리 키트</td>, <td>10X 유전체학</td>, <td>1000204</td><td></td></tr><tr><td>크롬, Next GEM 단일 세포 3' 시약 키트, v3.1</td>, <td>10X 게놈</td><td>학, 1000121</td><td></td></tr><tr><td>크롬, Next GEM 단일 세포 ATAC 시약 키트, v1.1</td>, <td>10X 게놈학</td><td>, 1000175</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소, II</td>, <td>MP Biomedicals,</td><td>2100502.5</td><td></td></tr>, <tr><td>디지토닌</td>, <td>시그마-알드리치,</td><td>D141-100MG</td><td></td></tr><tr><td>해부 펑</td>크 <td>Roboz 수술 기구 Co</td><td>RS-5005</td><td></td></tr><tr><td>Dnase1</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 (Benchtop-Model # 5425)</td><td>Eppendorf</td><td>22620444230VR</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼 - 프리미엄 셀렉트</td><td>R& D systems</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Angle Rotor</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffered saline</td><td>Millipore Sigma</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td><td>BD</td><td>305932</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson vet</td><td>789 313 89</td><td></td></tr><tr><td>MACS Smart Strainers (30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS 스마트 스트레이너 (100 &micro; m)</td><td>&nbsp; Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>일반 식염수 (0.9% 염화나트륨)</td><td>Baxter International Inc</td><td>2B1323</td><td></td></tr><tr><td>핵 버퍼 (20x)</td><td>10x Genomics</td><td>PN 2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>소형 가위</td><td>Roboz 수술 기구 Co</td><td>RS-5675</td><td></td></tr><tr><td>잠금 장치가 있는 집게를 적용하는 스테인리스 스틸 마이크로 클립</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5480</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>Tissue Mend II</td><td>Webster Veteinanry</td><td>07-856-7946</td><td></td></tr><tr><td>Type II Collagenase</td><td>MP biomedicals</td><td>2100502.1</td><td></td></tr><tr><td>Deposited Data</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scATACseq FastQ 파일</td><td>NCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>scRNAseq FastQ 파일</td><td>NCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject 등록 # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger 3.1.0</td><td>10X Genomics</td><td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td><td></td></tr><tr><td>Cicero</td><td>Pliner et al., 2018</td><td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td><td></td></tr> <tr><td>Ggplot2 v3.2.1</td><td>Hadley Wickham</td><td>https://cran.r-project.org</td><td></td></tr><tr><td>Harmony</td><td>Korsunsky et al., 2019</td><td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Schneider et al., 2012</td><td>https://imagej.nih.gov</td><td></td></tr><tr><td>Monocle 2.8.0</td><td>Qiu et al., 2017</td><td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td><td></td></tr><tr><td>R version 3.6.2</td><td>R Foundation</td><td></td><td></td>https://www.r-project.org</tr><tr><td>Seurat 3.1.3</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/satijalab/seurat</td><td></td></tr><tr><td>Signac 0.2.5</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/timoast/signac</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 세포 다중 오믹스 실험을 위한 마우스 경동맥 내강에서 내피 세포 분리

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

죽상 동맥 경화증은 방해받은 혈류 (d- 흐름)에 노출 된 동맥 부위의 염증성 질환입니다. D-flow 는 전사체 및 후성유전체 수준에서 내피의 유전자 발현을 조절하여 전동맥경화 반응을 일으킵니다. 최근에는 마우스 부분 경동맥 결찰(PCL) 모델을 사용하여 단일 세포 분해능에서 전사체 및 염색질 접근성 변화를 결정하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq) 및 트랜스포아제 접근 가능한 염색질 시퀀싱을 위한 단일 세포 분석(scATACseq) 연구가 수행되었습니다. 내피 세포 (ECs)는 동맥벽의 전체 세포 집단의 작은 부분을 나타내기 때문에 내강 분해 방법을 사용하여 EC가 풍부한 단일 세포 제제를 얻었습니다. 이 연구를 위해 마우스는 오른쪽 경동맥 (RCA)을 대조군으로 사용하면서 왼쪽 경동맥 (LCA)에서 d- 흐름을 유도하기 위해 PCL 수술을 받았다. 경동맥은 PCL 수술 후 2일 또는 2주 후에 해부되었다. 각 경동맥의 내강을 콜라게나제 소화를 거쳐 내피가 풍부한 단일 세포 또는 단일 핵을 얻었다. 이러한 단일 세포 및 단일 핵 제제는 이후 10x Genomics 미세유체 설정을 사용하여 바코드화되었습니다. 그런 다음 바코드된 단일 세포 및 단일 핵을 고처리량 DNA 시퀀서에서 RNA 준비, 라이브러리 생성 및 시퀀싱에 활용했습니다. 생물정보학 처리 후 scRNAseq 및 scATACseq 데이터 세트는 주로 EC로 구성된 내강 분해에서 다양한 세포 유형을 식별했습니다. 평활근 세포, 섬유 아세포 및 면역 세포도 존재했습니다. 이 EC 농축 방법은 전체 동맥 소화 방법으로는 어려울 수 있는 혈류가 내피에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 되었습니다. EC 농축 단일 세포 준비 방법은 이러한 유전자에 대한 혈류의 영향이 연구되지 않은 EC- 녹아웃 및 형질 전환 마우스에서 단일 세포 체학 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 중요하게도, 이 기술은 유사한 기계론적 연구를 수행하기 위해 인간 동맥 외식편으로부터 EC가 풍부한 단일 세포를 분리하도록 조정될 수 있다.

부분 경동맥 결찰 수술은 44 마리의 마우스에서 수행되었으며, 부분 결찰 수술 후 하루 동안 초음파 검사를 수행하여 LCA에서 d- 흐름 의 시작을 검증했습니다. 성공적인 부분 결찰 수술은 LCA3에서 혈류 속도를 감소시키고 혈류 (방해 된 흐름)를 역전시킵니다. 경동맥은 결찰 후 2일 또는 2주에 해부되었습니다. 각 경동맥의 내강을 콜라게나제 소화를 실시하고, 내피가 풍부한 단일 세포 또는 단일 핵 현탁액을 제조하였다. 세포 수율을 증가시키기 위해 10개의 RCA 및 LCA로부터 단일 세포 현탁액을 풀링하였다. 준비된 세포/핵은 이후에 바코드화되고 시퀀싱되었습니다. sc-RNAseq 연구의 경우, 수득 된 단일 세포의 수는 ~ 9,700이었다. 4개의 샘플로부터의 세포의 분포는 표 2에 나타내었다.
마찬가지로, scATACseq 연구를 위해, 단일 세포를 제조 된 12 개의 RCA 및 LC...

우리는 단일 세포 체학 실험을 수행하기 위해 안정하거나 방해받는 흐름 조건에 노출 된 마우스 경동맥의 내강에서 내피 세포와 핵을 분리하는 방법을 제시합니다.

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

혈관에서는 내피 세포의 수가 매우 적어 연구하기가 어렵습니다. 우리의 프로토콜은 이러한 한계를 제거하고 새로운 분자 경로와 치료법을 연구 할 수있게합니다. 우리의 프로토콜을 통해 내피가 풍부한 샘플을 얻고 급성 및 만성 교란 흐름이이 세포 유형에 어떤 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다.내피 세포를보다 자세히 연구 할 수있는 능력은 표적 유전자를 정의 할 수있게하고, 따라서 내피 세포를 표적으로하는 죽상 동맥 경화증에 대한 잠재적 인 치료제를 정의 할 수 있습니다. 경동맥 격리는 까다 롭고 인내와 경험이 필요합니다. 시작하려면 부 프레 노르 핀 킬로그램 당 0.05 밀리그램을 피하에 주사하여 동물을 준비하십시오.Betadine과 이소프로판올 용액을 사용하여 제모 된 부위를 3 회 멸균하십시오. 목 부위에서 약 1cm의 복부 정중선 절개를하십시오. 그런 다음 무딘 해부로 LCA 분기점을 노출시킵니다.왼쪽 내경동맥, 외경동맥 및 후두동맥을 6-0 봉합사로 결찰하여 상갑상선 동맥을 그대로 둡니다. 조직 접착제 또는 봉합사로 절개를 닫으십시오. 마우스를 섭씨 37도로 유지되는 예열된 복구 케이지로 옮깁니다.수술 후 저체온증을 피하기 위해 마우스를 깨끗한 수건에 최대 1시간 동안 두십시오. 심장의 정점을 통해 좌심실로 연결된 IV 라인에 21 게이지 바늘을 삽입합니다. 실온에서 일반 식염수를 사용하여 2-3분 동안 역행 관류를 허용합니다.IV 라인을 주입하거나 사용하는 동안 일정한 압력을 가하고 식염수 백을 8-9 피트 높이로 유지하여 일정한 유속을 유지하십시오. 모든 지방, 근육 및 결합 조직으로 목 부위의 피부를 제거하여 경동맥을 노출시킵니다. 그런 다음 경동맥 주위의 외막 주위 조직을 제거하여 경동맥이 몸에 붙어 있습니다.관류를 허용하기 위해 LCA의 결찰 부위 아래에 절개를하십시오. 좌심실을 통해 LCA를 1 분 더 관류하여 혈액 흔적을 제거하십시오. 경동맥 외부를 일반 식염수로 씻어 혈액의 흔적을 제거하십시오.29 게이지 바늘이있는 인슐린 주사기를 사용하여 50 마이크로 리터의 소화 완충액을 왼쪽 경동맥 말단부 내강에 주입하십시오. 마이크로 클립을 사용하여 소화 완충액으로 채워진 경동맥의 근위 끝을 고정하십시오. 15 내지 20 마이크로리터의 소화 완충액을 내강에 첨가하고, 소화 완충액의 방출을 피하기 위해 말단부를 클립한다.마우스의 경동맥을 섭씨 37도의 따뜻한 hepes 완충 식염수가 들어 있는 35mm 접시로 옮깁니다. 그리고 간헐적 인 흔들림으로 섭씨 37도에서 45 분 동안 배양하십시오. 내강 효소 소화가 완료된 후 35mm 접시에서 클램프로 경동맥을 제거하십시오.소화 완충액이 누출되지 않도록 클램프를 조심스럽게 분리하십시오. 경동맥의 한쪽 끝을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브 위에 놓습니다. 인슐린 주사기가 장착 된 100 게이지 바늘을 삽입하여 29 마이크로 리터의 따뜻한 소화 완충액을 루멘에 첨가하십시오.마이크로 원심 분리 튜브에서 경동맥 내강을 빠르게 세척 한 다음 0.3 마이크로 리터의 FBS를 튜브에 추가하여 반응을 중지합니다. 마이크로 원심 분리기 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리하고, 고정각 로터가 장착된 원심분리기를 사용하여 상층액을 버린다.세포 해리 시약이 들어있는 소화 완충액에 세포를 다시 현탁시키고 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양하여 단일 세포로 분리합니다. 0.5 밀리리터 튜브에 FBS 0.15 밀리리터를 첨가하여 효소 반응을 차단하고 원심분리를 반복한다. 상청액을 버리고 0.2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브의 PBS 중 100 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 1 % BSA 용액에 세포를 재현 탁시킵니다.단일 세포 분석을 위해 0.2 밀리리터 튜브의 PBS에 100 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 1 % BSA로 펠릿을 재현탁하십시오. 단일 핵 분석을 위해 얼음처럼 차가운 PBS에서 0.04% BSA의 100마이크로리터에 세포 펠릿을 재현탁하고 섭씨 4도에서 500G에서 5분 동안 단일 세포 현탁액을 원심분리합니다. 단일 세포 현탁액을 얼음 냉장 용해 완충액으로 분해하고, 얼음 상에서 5분 동안 배양한다.용해물을 P20 피펫과 혼합하고 10분 더 배양합니다. 그 후, 용해물을 0.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. ly 세포를 500 마이크로리터의 완충액으로 세척하고, 피펫을 사용하여 혼합한다.그런 다음 원심 분리를 반복하십시오. 상청액을 버리고, 희석된 핵 완충액의 150 마이크로리터에 핵 펠릿을 재현탁시킨다. 혈구계를 사용하여 단일 핵 제제를 세십시오.단일 핵 시퀀싱 연구에 이어 명시야 및 위상차 현미경으로 단일 세포 및 단일 핵을 얻고 시각화했습니다. 단일 세포 현탁액으로부터 단일 핵 준비의 효율성이 또한 입증되었다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 연구 후, 세포 당 유전자 분포, 세포 당 고유 한 분자 식별자, 세포 당 미토콘드리아 판독 및 시퀀싱 포화 데이터와 같은 다양한 매개 변수가 얻어졌습니다.단일 세포 ATAC 서열 연구를 위해, 뉴클레오솜 밴딩 패턴을 포함한 삽입 크기 분포가 관찰되었다. 정규화된 TSS 농축 점수도 관찰되었다. 또한 백분율 조각은 피크에서 읽습니다.피크 영역 단편, TSS 농축 점수, 블랙리스트 게놈 부위에서의 판독 비율, 및 뉴클레오솜 신호 비율을 결정하였다. 효소 소화는 세포에 대한 스트레스이므로 샘플을 얼음 위에 유지하고 가능한 한 빨리 절차를 수행하는 것이 중요합니다. 이 방법을 사용하여 마우스에서 내피 세포를 얻고 플레이트할 수 있습니다.이 기술을 사용하여 대량 Omix 기반 연구를 수행 할 수도 있습니다. 이 기술은 단일 세포 방식으로 생체 내 내피 세포에 대한 교란 된 혈류의 영향을 연구하기위한 길을 열었습니다.

isolation-endothelial-cells-from-lumen-mouse-carotid-arteries-for

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이것은 일반적인 마우스 경동맥의 intraplaque 네오 - vascularization (4 주)와 방해 흐름 조건 및 후속 죽상 경화증 개발 (2 주) 원인 부분 경동맥 내고 수술을 설명합니다. 우리는 또한 고순도 내피 RNA를 제공하고, 경동맥 intima에서 RNA의 분리의 소설 방법을 설명합니다.

부분 결합하여 마우스 경동맥 동맥에있는 방해 흐름 유발 죽상 경화증과 경동맥 내피로부터 RNA 분리의 간단한 방법의 모델

우리는 원시 그대로의 미세 혈관 내피 세포의 칼슘 신호를 시각화하고 조작하기위한 준비를 제시한다. 내피 튜브 갓 골격 근육 주위의 세포 내와 사이에 생체 형태와 동적 신호의 유지 공급 마우스 저항 동맥에서입니다. 내피 튜브는 다른 조직 및 기관의 미세 혈관으로부터 제조 될 수있다.

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

심장 판막 내피 세포(VEC)를 분리하는 능력은 판막 발달, 유지 및 질병의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다.  여기에서는 FACS를 사용하여 배아 및 성인 Tie2-GFP 마우스에서 VEC를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 발달 및 질병 과정에서 VEC의 기여도를 결정하는 연구를 수행할 수 있습니다.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

혈관 내피 세포는 많은 중요한 심혈관 질환에서 중요한 역할을 합니다. 이 기사에서는 특별한 장비를 사용하지 않고 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

이 프로토콜은 이미징 또는 분자 생물학 실험을 수행하기 위해 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 공유하기 위해 준비되었습니다.

마우스 관상 내피 세포의 분리

이 프로토콜은 세포 수율, 순도 및 생존성에 최적화된 뮤린 출생후 망막 내피 세포의 단리를 위한 방법을 설명한다. 이 세포는 차세대 시퀀싱 접근법에 적합합니다.

차세대 염기서열분석을 위한 뮤린 망막 내피 세포의 분리

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

이 프로토콜은 인간 장간막 동맥으로부터 내피 세포의 분리, 배양 및 프로파일링을 기술한다. 추가적으로, 공간 전사체학을 위한 인간 동맥을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 단백체학, 전사체학, 및 기능적 검정은 단리된 세포 상에서 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 모든 중간 또는 대형 동맥에 대해 용도를 변경할 수 있습니다.

전사체 수준에서 인간 일차 장간막 동맥 내피 세포의 분리 및 프로파일링

이 프로토콜은 마우스 지방 저장소를 해부하고 각 동맥을 분리 및 소화하여 내피 세포 집단을 유리시키고 식별하는 방법을 자세히 설명합니다. 다운스트림 응용 분야에 사용되는 새로 분리된 세포는 혈관 세포 생물학 및 혈관 기능 장애의 메커니즘에 대한 이해를 발전시킬 것입니다.

다운스트림 적용을 위한 별개의 지방 저장소에서 혈관 내피 세포의 분리 및 식별

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

여기서는 마우스 경동맥의 단세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 프로토콜을 설명합니다.

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

배우세요 마우스 경동맥에서 내피 세포와 핵을 분리하여 단일 세포 다중 오믹스 실험을 수행하는 방법을. 교반 혈류 조건에서 동맥경화증 관련 분자 경로를 연구하고 치료 표적을 식별할 수 있습니다.

단일 세포 다중 오믹스 실험을 위한 마우스 경동맥 내강에서 내피 세포 분리

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