기능화 비스 - 펩타이드의 고상 합성은 방법론 "을 안전 잡아라"사용

다음 실험의 전반적인 목표는 고체상 기술을 사용하여 기능화된 BSP 펩타이드를 합성하는 것입니다. 이는 보호된 BIS 아미노산을 하이드록시에틸 벤조산 수지에 적재함으로써 달성됩니다. 그런 다음 딥 프로텍션 커플링 사이클을 반복하여 BIS 펩타이드를 늘리고 원하는 기능을 나타내는 공정인 기능화된 bis 아미노산을 부착합니다.

마지막으로, 첫 번째 비스 아미노산은 DI 케토 피라진 형성에 의해 수지에서 BIS 펩타이드를 절단하기 위해 알파 아미노산으로 변형됩니다. 액체 크로마토그래피 질량 분석 분석을 기반으로 우수한 조순도와 약 10%의 일관된 분리 수율로 기능화된 BSP 펩타이드의 성공적인 합성을 보여주는 결과를 얻었습니다. 이 기술의 의미는 BIS 펩타이드의 병렬 및 라이브러리 합성으로 확장되는데, 이는 BIS 펩타이드가 고체 수지에 조립되어 용액 및 부산물의 반응이 여과에 의해 쉽게 제거되는 것보다 더 쉽게 조작할 수 있기 때문입니다.

모든 반응이 가능한 한 완료에 가깝게 접근하도록 하는 데 필요한 많은 중요한 세부 사항이 있기 때문에 많은 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 고체상 합성을 사용하면 중간체를 정제할 방법이 없습니다. 따라서 깨끗한 최종 제품을 얻기 위해서는 모든 반응을 가능한 한 멀리 유도해야 합니다.

단계가 본질적으로 반복적이므로 혼동을 피하기 위해 실험 절차의 체크리스트를 만드는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 첫 번째 BSP 펩타이드의 로딩, 첫 번째 BSP 펩타이드의 보호 및 동시 수지 캡핑으로 시작됩니다. 시작하려면 114mg의 H-M-B-A-A 수지 무게를 측정하여 첫 번째 BSP 펩타이드를 8ml 반응 용기에 로드하고 자기 교반 막대를 추가합니다.

용기 상단에 고무 격막을 씌우고 최소 5분 동안 아르곤으로 튜브를 퍼지합니다. 그 동안, 서면 프로토콜에 설명된 대로 활성화된 BIS 아미노산 용액을 준비합니다. 이 비디오와 함께 용액을 주사기를 통해 반응 용기로 옮기고 다음날 밤새 아르곤 아래에서 저어주고 격막을 제거하고 반응 혼합물을 배출합니다.

수지에 약 2ml의 클로로 메탄을 첨가하여 수지를 세척합니다. 30초에서 1분 동안 저어준 다음 물기를 뺍니다. DCM으로 이 과정을 4회 반복한 다음 디메틸포름아미드로 수지를 5회 세척합니다.

첫 번째 bis 아미노산 및 동시 수지 캡핑을 완벽하게 보호하기 위해 아세트산과 DCM의 33% 브로마이드수소 용액 2ml를 반응 용기에 천천히 첨가합니다. DCM에서 수지를 5회 배수하고 세척한 후 15분 동안 저어줍니다. D 보호 순서를 한 번 더 반복합니다.

다음으로, DMF에서 5 회 세척 한 후 DCM에서 수지를 5 회 세척하고 DMF에서 D-I-P-E-A의 5 % 부피, 부피 용액으로 2 회 세척하여 수지를 중화합니다. 그런 다음 DCM으로 5회 세척하고 DMF로 5회 더 한 번 세척합니다. 이제 보호된 기능화된 bis 아미노산의 커플링을 수행할 수 있습니다.

먼저, 무수 DCM으로 3회 세척하여 반응 용기를 포함하는 수지에 불활성 분위기를 재도입합니다. 그런 다음 격막과 아르곤 라인을 부착하고 무수 DCM 1-2ml를 첨가하고 30초 동안 교반하여 용기를 세척합니다. 그런 다음 아르곤 라인 버블러가 상승하기 시작할 때까지 용기를 배출합니다.

이 과정을 한 번 이상 반복합니다. 다음으로, 아르곤 분위기 하에서 화염 건조 시험관에 기능화된 bis 아미노산 용액을 준비합니다. DIC 47마이크로리터를 넣고 90분 동안 저어줍니다.

그런 다음 666 마이크로 리터에 35 마이크로 리터의 D-I-P-E-A를 넣고 수지에 DMF를 가하고 5 분 더 저어줍니다. 사전 활성화된 BIS 아미노산 용액을 주사기를 통해 용기로 옮기고 다음 날 밤새 저어줍니다. 반응 혼합물을 배출하고 아르곤 아래에서 무수 DCM으로 두 번 세척합니다.

이 절차에서 중요한 단계는 biz 아미노산 커플링입니다. 디 케토 피페라진 고리 폐쇄를 보장하기 위해 추가 활성화제와 함께 더 긴 반응 시간을 사용합니다. 디 케토 피라진의 폐쇄를 촉진하려면 HOAT 및 DIC 용액을 아르곤 아래에서 1시간 동안 저어줍니다.

다음으로, 격막을 제거하고 반응 혼합물을 배출합니다. DCM으로 수지를 5회, DMF로 5회 세척합니다. 이 섹션에서는 기능화된 BIS 아미노산의 심층 보호, F moc의 심층 보호 및 첫 번째 BIS 아미노산의 아실화에 대해 다룹니다.

보호된 기능화된 비스 아미노산을 심층적으로 보호하려면 TFA 및 TIPS 용액 2ml를 반응 용기에 천천히 첨가하고 배출 후 1시간 동안 저어준 후 DCM으로 수지를 약 30초 동안 세척한 다음 DCM 세척을 5회 반복합니다. 그런 다음 A-D-C-M-D-M-F 세척 후 전체 딥 프로텍션 수지 세척 순서를 반복합니다. DMF에서 D-I-P-E-A의 5% 부피 용액으로 두 번 세척하여 수지를 중화합니다.

그런 다음 다른 D-C-M-D-M-F 세척을 수행합니다. 여기에서 BIS 펩타이드는 다른 기능성 bis 아미노산과 함께 연장하거나 주요 질소 카르복실산 또는 둘 다에서 기능화할 수 있습니다. FM 그룹을 보호하기 위해 DMF에 20% 파이프 파리딘의 2밀리리터 용액을 넣고 20분 동안 반응을 혼합합니다.

배수를 빼고 DMF에서 수지를 5 번 씻습니다. 수지를 추가로 세척한 후 이 과정을 한 번 더 반복합니다. A는 제조된 아미노산 용액을 반응 용기에 첨가하여 첫 번째 비스 아미노산을 분리하고 최종 단계로 6시간 동안 교반합니다.

DCM으로 수지를 5회, DMF로 5회 세척합니다. 이 프로토콜의 마지막 부분에는 수지 결합 아미노산에서 Bach 그룹을 제거하고 수지에서 절단하는 것이 포함됩니다. 먼저 반응 용기에 2ml의 T-F-A-D-C-M 용액을 넣고 30분 동안 저어줍니다.

DCM에서 수지를 5번 배수하고 세척합니다. 그런 다음 이 과정을 한 번 더 반복합니다. DCM으로 5회, DMF로 5회, 총 30초 동안 수지를 세척하고 배수합니다.

다음으로, 무수 DMF에 10% D-I-P-E-A 용액 2ml를 넣고 24-48시간 동안 저어줍니다. 마지막으로, 반응 혼합물을 미리 계량된 둥근 바닥 플라스크에 수집합니다. 이 용액 30마이크로리터를 lc MS 파일의 Tetra Hydro FU 450마이크로리터로 옮기고 분석을 위해 제출합니다.

DMF의 추가 분취액으로 수지를 세척하고 둥근 바닥 플라스크에 수집합니다. 다음 방법을 사용하여 합성 전반에 걸쳐 수지 화학적 변형을 모니터링할 수 있습니다. 유리 하이드록실기를 검출하려면 먼저 일회용 피펫을 통해 약 1mg의 건조 수지를 제거하여 메틸 레드 테스트를 수행합니다.

4ml 반응 용기에 헹굽니다. 본문에 설명된 대로 준비된 메틸 레드 용액을 넣고 5-10분 동안 저어줍니다. 수지를 배수하고 DCM으로 5 번 세척하십시오. 주황색 또는 빨간색 수지 비드는 유리 수산기의 존재를 나타냅니다.

이 테스트는 첫 번째 bis 아미노산 및 수지 캡핑 단계의 부하를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 2차 수단을 검출하려면 일회용 피펫을 통해 약 1mg의 건조 수지를 작은 바이알에 옮겨 클로랄 테스트를 수행합니다. DMF 용액에 0.8 밀리몰 클로랄을 3방울 떨어뜨리고 DMF 용액에 2%산 알데히드를 추가합니다.

그리고 5분에서 10분 정도 실온에 앉아 둡시다. 이 경우, 파란색 또는 자주색 수지 비드는 수지 결합 화합물에 자유 2차 수단이 존재한다는 표시입니다. 활성화 효율을 확인하기 위해 활성화 트랩 테스트를 수행하고, 합성 중 활성화 화합물을 5-10 마이크로 리터의 활성화 용액을 50 마이크로 리터의 올레인이 들어있는 액체 크로마토 그래피 질량 분석 바이알로 손으로 혼합하여 평가할 수 있습니다.

몇 초 동안 용액이 노랗게 변한 다음 450마이크로리터의 테트라 하이드로 우란으로 희석하고 lc MS 분석을 위해 제출해야 합니다. 최종 생성물 및 활성 중간체는 C 18 역상 컬럼이 장착된 LCM S 시스템과 0.1% 포름산이 함유된 물 아세틸 니트릴의 용매 시스템을 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 L-C-M-S-U-V 트레이스는 원유의 우수한 순도에 대한 예를 제공합니다.

21.3분에서 발견된 스펙트럼의 주요 피크는 예상 제품 질량과 일치하는 마스크를 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 이는 조제품의 질량 스펙트럼에서 시각화할 수 있으며, 피크는 질량에 해당하는 주요 피크와 나트륨 이온의 질량, 질량에서 IV DDE 보호 그룹의 질량을 뺀 값을 나타냅니다. 여기에 표시된 것은 정제된 스펙트럼의 LCMS UV 트레이스로 21.3분에 매우 순수한 생성물을 나타내고 질량 스펙트럼은 이 정제된 트리어 피크의 정체를 확인합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 고체면 기법을 사용하여 개발 후 기능화된 비스 펩타이드를 합성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 비즈 펩타이드 분야의 연구자들이 단백질-단백질 상호 작용 및 촉매 작용의 응용 프로그램을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 4-5일 내에 기능화된 비즈 펩타이드 트라이머의 합성으로 이어질 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때 비드를 반응 및 세척 용액에 담그고 이 절차를 따르는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 병렬 또는 라이브러리 합성과 같은 다른 방법은 단백질 결합 또는 촉매 활성에 대한 입체화학 또는 대체 기능의 효과와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 유기 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행할 때 항상 적절한 개인 안전 장비 및 흄 후드의 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.