Polyamine 기반 펩타이드 Amphiphiles (PPAs) 및 관련된 생체 자기 조립의 합성에 대 한 손쉬운 프로토콜

이 방법은 펩타이드 양서류를 폴리아민으로 장식하는 방법과 팔각형 보호 그룹의 사용에 대한 주요 질문에 답할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 여러 반응면을 포함하는 보호되지 않은 화학 빌딩 블록으로 하이브리드 펩타이드 양서류를 생성할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 콘다 셰리단 연구소(Conda Sheridan Laboratory)의 실험실 학생인 메흐디(Mehdi), 나탈리아(Nathalia), 크리슈나이아(Krishnaiah)입니다. 먼저, 2-Chlorotrityl chloride 수지의 무게를 조심스럽게 측정하고 수지를 50ml 용량의 중간 다공성 합성 용기에 넣습니다.

다음으로, synethesis 용기를 가변 속도 기계식 셰이커에 부착하고 용기를 45도 각도로 돌려 교반을 최대화합니다. 그런 다음 수지에 15ml의 DCM을 추가합니다. 수지 비드가 15분 동안 팽창하도록 한 후 원하는 폴리아민 8개를 수지에 첨가하고 5시간 동안 반응시킵니다.

5시간 후, 카이저 테스트를 수행하여 폴리아민과 수지의 성공적인 반응을 확인합니다. 그런 다음 무수 메탄올에 DDE의 4개 등가물을 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 흔들어 1차 아민기를 보호합니다. 다음 날, 카이저 테스트를 수행하여 수지 비드에 파란색이 없어 성공적인 보호를 확인합니다.

그런 다음 DCM을 배출하고 DCM과 DMF의 2:1 혼합물로 수지를 두 번 세척합니다. 이제 DCM의 Boc Anhydride 20 등가물을 수지에 첨가하고 3 시간 동안 반응을 진행하도록합니다. 2차 아민의 보호를 확인하기 위해 클로라닐 테스트를 수행한 후 용매 혼합물을 배출하고 DCM과 DMF의 2:1 혼합물로 수지를 두 번 세척합니다.

그런 다음 DMF의 2% 히드라진 용액 10ml를 수지에 첨가합니다. 1시간 동안 흔든 후 카이저 테스트를 수행하여 일차 아민의 성공적인 탈보호를 확인합니다. 다음으로, Fmoc 보호 아미노산 4개, HBTU 3.95개 당량, DIPEA 15개 당량을 혼합합니다.

DCM과 DMF의 일대일 혼합물을 추가하고 완전히 용해될 때까지 칵테일을 초음파 처리합니다. 혼합물을 수지에 첨가하기 전에 아미노산, 커플링제 및 DIPEA가 실제로 혼합되고 활성화되었는지 확인하십시오. 카르복실산 활성화를 확인하기 위해 3-5분을 기다린 후 수지가 들어 있는 용기에 반응 혼합물을 추가하고 상온에서 2-4시간 동안 반응을 진행하도록 합니다.

성공적인 커플링을 확인하기 위해 모든 단계에서 카이저 또는 클로라닐 테스트를 수행합니다. 성공적인 결합을 확인하기 위해 카이저 테스트를 수행한 후 DMF에 4-메틸피리딘의 20% 용액 10ml를 첨가하여 아미노산으로부터 Fmoc 그룹을 보호합니다. 반응이 완료되면 카이저 테스트를 수행하여 아미노산의 성공적인 탈보호제를 확인합니다.

그런 다음 10ml의 DMF로 수지를 두 번 세척할 때마다 5분 동안 지속하고 마지막으로 10mL의 DCM으로 10분 동안 세척합니다. 필요한 모든 아미노산을 결합한 후, HBTU 9.5 당량과 DIPEA 12 당량에 원하는 카르복실산 기능성 10 당량을 추가하여 소수성 꼬리를 마지막 아미노산에 접합합니다. 완전히 용해될 때까지 칵테일을 초음파 처리한 다음 칵테일을 용기에 추가합니다.

최소 5 시간 동안 반응을 수행하되 가장 높은 수율을 위해 밤새 수행하는 것이 좋습니다. 8ml의 DMF로 수지를 2분 동안 세척하고 8ml의 DCM으로 5분 동안 두 번 세척합니다. 추가하기 전에 용기에서 용매를 배출하십시오.

마지막 세척이 수행되면 진공 상태에서 수지를 15분 동안 건조시킵니다. 15ml의 분열 칵테일을 준비하려면 0.5ml의 물과 0.5ml의 트리이소프로필실란에 14ml의 TFA를 추가합니다. 이 분열 칵테일을 수지에 넣고 실온에서 2-4시간 동안 흔듭니다.

절단 반응이 완료된 후 50ml 둥근 바닥 플라스크에 용액을 수집합니다. 그런 다음, 감압에서 회전 증발기를 사용하여 TFA를 1-2 밀리리터로 진공 농축하고, 혼합물을 섭씨 40도에서 가열하면서 증발 후, 얻어진 TFA 용액을 15 밀리리터의 무수 저온 에테르가 들어있는 둥근 바닥 플라스크에 적가하여 PPA를 침전시킨다. 다음으로, 농축된 TFA 용액이 들어 있는 원래 플라스크에 5ml의 무수 콜드 에테르를 추가합니다.

추가 고형물을 회수하기 위해 초음파 처리합니다. 그런 다음 이전 단계의 에테르 용액과 결합합니다. 플라스크를 덮고 밤새 냉장고 안에 넣어 강수량을 최대화하십시오.

다음 날에는 미세하거나 중간 크기의 중앙 디스크 필터 깔때기를 사용하여 진공 여과로 침전된 물질을 수집합니다. 마지막으로, 침전물을 5-10 밀리리터의 차가운 에테르로 두 번 세척하여 잔류 유기물을 제거합니다. HPLC 추적 및 MALDI 스펙트럼은 재료 특성화 또는 생물학적 평가를 위해 순도가 95% 이상이어야 하는 PPA 제품의 존재를 확인합니다.

UV 기반 HPLC 트레이스에서 단일 날카로운 피크가 관찰되며 MALDI 스펙트럼은 플러스 또는 마이너스 1 달톤 내에서 계산된 PPA 분자량의 피크에 해당합니다. PPA의 자체 조립은 투과 전자 현미경, 원자력 현미경, 소각 X선 산란, 주사 전자 현미경 및 동적 광 산란으로 시각화하고 분석할 수 있습니다. 성공적인 자기 조립은 투과 전자 현미경과 원자력 현미경 모두에서 잘 정의된 나노 구조를 얻을 것입니다.

이 프로토콜은 일단 마스터하면 제대로 수행되면 3일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 후속 연구 전에 제품을 정제하고 순도를 평가하는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라, 펩타이드 양친매성, 펩티드 및 펩타이드-폴리아민 하이브리드와 같은 다른 분자를 제조할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 약물 전달, 이미징 또는 촉매와 같은 영역에서 폴리아민 나노 구조의 영향을 탐구하기 위해 자기 조립 펩타이드 양친매성 분야의 연구를 돕는 데 도움이 됩니다.이 비디오를 시청한 후에는 폴리아민 기반 펩타이드 양친매성 및 관련 펩타이드 양친매성의 합성을 수행하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 트리플루오로아세트산과 4-메틸피리딘은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑, 실험실 가운 착용 및 흄 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.