Name: Polyamine 기반 펩타이드 Amphiphiles (PPAs) 및 관련된 생체 자기 조립의 합성에 대 한 손쉬운 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 폴리아민 기반 펩타이드 양친매체(PPA) 합성 방법을 통해 보호기 없이 하이브리드 분자를 제조하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 생체 자기 조립 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 네브라스카 대학 의료 센터 (창업 자금, MC S);에 의해 투자 되었다 NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. Bronich) 및 미국 화학 학회, PRF # 57434-DNI7(MC-S).

1. 일반 프로토콜 PPAs의 합성에 대 한
<ol><li>종합 (보통 mmol)의 규모를 계산 합니다. 이 규모는 대상 PPA의 질량을 기반으로 합니다. SPPS의 반응 효율 아미노산의 증가 함께 점차적으로 감소 하는 유의 하십시오. 따라서, 정확한 반응 효율을 계산 하기가 어렵습니다.</li>
	<li>수 지의 로드에 따라 사용 되는 수 지의 무게를 계산 합니다. 로드는 컨테이너 또는 수 지의 분석 프로토콜 이며 mmol/g로 표현. 다음 수식은 수 지의 무게를 계산에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>2 chlorotrityl 염화 비닐 수 지에 밖으로 조심 스럽게 무게 (우리의 경우에는 로드는 ~0.85 mmol)</li>
	<li>다음 사양과 fritted 합성 용기에 수 지를 배치: 용량-50ml, Fritted 디스크-25 mm, 다공성-매체.</li>
	<li>수 지에 dichloromethane (DCM)의 15 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>가변 속도 기계 통 (플라스 크 쉐이 커/활동가), 합성 그릇을 부착 하 고 45 ° 각도 (또는 가로) 혈관 동요를 최대화 하기 위해.</li>
	<li>팽창 수 지 구슬 허용 15 분에 대 한 붓기 향상 반응의 수확량 분자 확산 및 활성 사이트 접근성 용이 하 게 결합 효율 향상.</li>
	<li>수 지에 원하는 polyamine (Spermine, Spermidine, Diethyelenetriamine, diaminopropane 1, 3, 등)의 8 등가물 (0.25 mmol 규모 2 mmol)을 추가 하 고 5 h에 대 한 반응을 수 있습니다. 참고: 덜 반응 기간 수익률을 줄일 것 이다.</li>
	<li>할는 카이 저 테스트 ( 재료의 표참조) 수 지에 polyamine의 성공적인 연결을 확인 합니다. 1 차 아민의 성공적인 결합 자유로운 아민에 해당 바이올렛/블루 색상을 생성 합니다.</li>
	<li>1 차 아민 그룹 반응 혼합물 하룻밤11떨고 무수 메탄올 (15 mL)에 녹 (Dde), 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl의 4 등가물을 사용 하 여 보호 합니다. 참고: 낮은 반응 시간 수확량을 감소 시킨다.</li>
	<li>카이 저 테스트를 수행 합니다. 수 지 구슬에서 파란색의 부재는 성공적인 보호를 확인 한다. 1 차 아민의 실패 보호 경우 이전 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>DCM을 배수 하 고 두 번 DCM와 DMF (2:1, 15 mL)의 혼합물으로 수 지를 세척.</li>
	<li>디-tert 부 틸 디-탄산 (Boc) DCM (20 mL)에서 20 등가물 (5 mmol)을 녹이 고 허용 3 h에 대 한 진행 하는 반응.</li>
	<li>chloranil을 할 2 차 아민의 완벽 한 보호를 확인 ( 재료의 표참조) 테스트. 긍정적인 시험 (보호) 무색 또는 밝은 노란색 컬러를 생성합니다. 무료 2 차 아민 주 아민에 게 붉은 색 어두운 녹색/파랑 색상을 제공 합니다.</li>
	<li>용 매 혼합물 배수와 DCM와 DMF (2:1, 15 mL)의 혼합물으로 두 번 세척.</li>
	<li>DMF (10 mL)에 히드라 진의 2% 솔루션을 추가 하 고 1 시간 흔들어.</li>
	<li>1 차 아민의 성공적인 deprotection를 확인 하는 카이 저 테스트지 않습니다.</li>
	<li>
역방향 시퀀스는 당신 것입니다 쓰기/그릴 그들에 원하는 아미노산을 추가 합니다. 펩 티 드 C 테르미니에 N 테르미니에서 얻을 수 있습니다 하지만 반대 방향으로 n C 합성 예를 들어 다음과 같은 펩 티 드를 필요로 하는 PPA에 대 한 코어-GLFD-, Aspartic 산 (D), 페닐알라닌 (F), 신 (L), 및 마지막으로 글리신 (G)를 추가. 참고: 대부분 아미노산에 대 한 다음 커플링 칵테일은 polyamine 로드 수 지에 첨부 파일에 대 한 적절 한입니다.<ol>
<li>Fmoc 보호 된 아미노산의 4 등가물 (1 mmol), 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexaﬂuorophosphate (HBTU)의 3.95 등가물와 15 diisopropylethyl 아민 (DIPEA)의 혼합.</li>
		<li>DCM와 DMF (1:1, 15 mL)의 혼합물에 그들을 녹이 고 (완전 한 해체)까지 2 분 동안 칵테일을 sonicate.</li>
		<li>아미노산에 carboxylic 산의 활성화 되도록 추가 3-5 분을 기다립니다.</li>
		<li>그릇에 반응 혼합물을 추가 합니다. 주위 온도에 2-4 h 반응 수행 합니다. 참고: 우리는 다음 발견 효율적인 대 안으로 HBTU (일반적으로 낮은 양의 아미노산와 커플링 에이전트 요구): DIC/Oxima, HATU, PyBOP, COMU.</li>
		<li>성공적인 연결을 확인 하는 카이 저 테스트지 않습니다.</li>
		<li>드 DMF에 4-메 틸 piperidine (10 mL)의 20% 솔루션을 추가 하 여 아미노산에서 Fmoc 그룹을 보호 합니다. 그것을 두 번, 각각의 시간 15 분에 대 한 반응 혼합물을 떨고. 참고: Fmoc 제거에 대 한 효율적인 대안 piperazine/DBU12입니다.<ol>
<li>추가 사이 DCM (15 mL) 세척을 수행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>아미노산의 성공적인 드 보호를 확인 하는 카이 저 테스트지 않습니다.</li>
		<li>4-메 틸의 모든 흔적을 제거 철저 하 게 수 지를 세척. DMF (10 mL), 각 세척 5 분 지속으로 두 번 수 지 세척 그리고 마지막 10 분 동안 DCM (10 mL)와.</li>
		<li>커플링을 연속적으로 반복 하 여 모든 나머지 아미노산을 추가 하 고 드 보호 단계.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마지막으로, 모든 필수 아미노산을 결합 후 polyamine 펩 티 드 구성의 마지막 아미노산을 소수 성 꼬리 켤레:
	<ol>
<li>DCM와 DMF 혼합물 (1:1, 20 mL)에 녹아 있는 원하는 carboxylic 산 기능을 DIPEA의 HBTU의 9.5 등가물와 12의 10에 해당 추가 합니다. 참고: 명심 보다 일부 꼬리 용 매 (일반적으로: DCM의 큰 %) 또는 추가 또는 다른 용 매 N-methylpyrrolidone (NMP) 등의 다른 비율을 할 수 있습니다.</li>
		<li>(우리 본 완전히 해산 꼬리에 대 한 소요) 해산 때까지 5-10 분에 대 한 칵테일을 sonicate 선박 추가. 참고: 여러 반응 사이트를 포함 하는 꼬리에 대 한 그들은 그들을 결합 하기 전에 보호 될 필요 합니다.</li>
		<li>수행이 반응 (소수 성 꼬리 커플링) 적어도 5 시간, 비록 그것이 하룻밤 높은 수율에 대 한 그것을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PPA 분열 고체 지원에서
이 단계의 목적은 고 아미노산과 polyamine 잔류물에서 Boc 보호 그룹을 제거 하는 수 지에서 PPA의 분열 이다.
<ol><li>DMF (8 mL 2 분)와 함께 두 번 DCM (8 mL, 5 분 동안 각 시간) 수 지를 세척. 각 추가 전에 용기에서 용 매 드레인. 마지막 세척을 수행 15 분 동안 진공에서 수 지를 건조.</li>
	<li>다음 혼합 비율을 사용 하 여 절단 솔루션 준비: 28:1:1 trifluoroacetic 산 (TFA): H2O: Triisopropyl silane (팁). 15 mL 칵테일 분열의 H2O 0.5 mL 및 팁의 0.5 mL, TFA의 14 mL를 추가 하십시오.</li>
	<li>수 지에이 분열 솔루션을 추가 하 고 실 온에서 2-4 h 흔들.</li>
	<li>25에 솔루션을 수집 또는 50 mL 둥근 바닥 플라스 크.</li>
	<li>TFA vacuo에서 40 ° C에 혼합물을가 열 하는 동안 감압 회전 증발 기를 사용 하 여 1-2 mL에 집중 (PPA의 분해를 피하기 위해 55 ° C를 능가 하지 마십시오).</li>
	<li>증발 후 무수 차가운 에테르 (15 mL)를 포함 하는 둥근 바닥 플라스 크를 얻은 TFA 솔루션을 (dropwise) 추가 합니다. 이 즉시 PPA 침전 됩니다.</li>
	<li>또한, 원래 플라스 크는 TFA는 집중을 무수 차가운 에테르 (5 mL)을 추가 합니다.</li>
	<li>이 플라스 크 추가 솔리드 복구 단계 2.6에서에서 에테르 솔루션 결합을 sonicate합니다 참고: 전송 피 펫 DCM의 작은 양으로 세척 될 수 있다. 젤 같은 물질을 형성 하는 경향이 있기 때문에 과정에서 DMF를 소개 하지 마십시오.</li>
	<li>(적용) 냉장고 내부에 플라스 크를 놓고 그것은 강수량을 최대화 하기 위해 밤새 서 보자.</li>
	<li>소 결된 디스크 필터 퍼 널을 사용 하 여 진공 여과 의해 침전 된 자료를 수집 합니다. 이상적인 기 공 크기 또는 매체는.</li>
	<li>모든 잔여 유기 물 제거를 차가운 에테르 (5-10 mL)로 두 번 침전을 세척.</li>
</ol>3. MALDI 건조 드롭 메서드를 사용 하 여 원유 제품의 식별
<ol><li>
매트릭스 긍정적인 모드에서 분석을 위한 준비:
	<ol>
<li>분자량 분석 매트릭스 보조 레이저 탈 착 또는 이온화 (MALDI) 질량 분석을 사용 하 여 시작, microcentrifuge 튜브를 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산의 10 ~ 20 mg을 추가 합니다.</li>
		<li>물/이기 (1:1, 1.0 mL) 0.1 %Trifluoroacetic 산 (TFA)의 솔루션을 추가 합니다. Vortexing에 의해 철저 하 게 혼합. 참고:이 매트릭스는 충전 된 펩 티 드에 대 한 사용 해야 합니다. MALDI 부정적인 모드와 유사 하지만 용 매 첨가제로 0.1% 암모니아와 9-aminoacridine를 포함 하는 매트릭스를 요구 한다.</li>
		<li>MALDI에 대 한 샘플의 1-2 µ L 스테인레스 강판 대상에 추가 하 고 건조 한 공기에 샘플. 매트릭스의 1-2 µ L을 추가 하 고 다시 그것을 건조. 참고: 판 있다 원형 표시 대상 접시 특정 자리를 찾는 데 도움이 함께 gridded.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그들의 신원을 확인 MALDI 악기에 샘플을 분석 합니다. 분무 이온화 (ESI)는 PPAs의 id를 확인 하는 유효한 대안 이다.</li>
</ol>4. 대리점 역 상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 정화를 사용 하 여 PPAs의 정화
<ol><li>
이기와 물의 최소 금액에 PPA 침전을 용 해.
	<ol>
<li>엄지손가락의 규칙으로 서 100 mg 미만 이기와 물 5 mL에 건조 원유 PPA의 분해. 더 소수 PPAs 해산 이기의 더 큰 백분율을 필요할 수 있습니다 고 PPAs (표 1)의 net 요금에 따라 더 큰 양의 용 매를 일반적으로 요구 또한 수도 있습니다.</li>
		<li>완전 한 해체 되지 않는 경우 장소, 추가 1 %TFA (ACN 또는 H2O). 그것은 또한 상당량의 다른 호환 dimethylsulfoxide, 메탄올, 또는 소 프로 파 놀을 포함 하 여 추가할 수 (그들의 콘텐츠를 5%로 제한).</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>용 매</td>
			<td colspan="2">긍정적으로 위탁된 PPAs</td>
			<td colspan="2">PPAs 부정 청구</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0.1 물에 % TFA</td>
			<td colspan="2">0.1 물에 % NH3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0.1% TFA ACN에</td>
			<td colspan="2">0.1 ACN에 % NH3</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 용 매 시스템. 긍정적으로 그리고 부정적으로 위탁 PPAs에 대 한 용 매 시스템을 제안 했다.
<ol start="2"><li>48%의 Amp1와 10 s 펄스에서 20 분 동안 또는 2-3 h는 초음파 목욕에 대 한 경적 sonicator를 사용 하 여 PPA sonicate</li>
	<li>
그런 다음, 0.45 μ m 주사기 필터 여과 0.20 μ m 소계 (PTFE) 주사기 필터를 사용 하 여 다음을 사용 하 여 필터링 합니다. PPA 솔루션 명확 하 고 모든 미 립 자 물질의 무료 되어야 합니다.
	<ol>
<li>여과 너무 어려운 경우에, 시간의 연장된 기간에 대 한 sonicate. 그것은 좋습니다 PPA 솔루션 후 주사기 여과, 정화 즉시 는으로 장기간된 보관 될 수 있습니다 집계 하거나 gelate, 그것을 다시 쥡니다 그리고, 아마도, 다시 여과 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동안 그리고 정화 후에, HPLC 학년 용 매 또는 0.25 μ m 주사기 필터/멤브레인을 통해 필터링 된 것 들 중 하나를 사용 합니다. 참고: 가장 일반적인 용 매 조건 PPAs 정화 구성 H2의 그라데이션에서 O = 뉴스.</li>
	<li>표준 역 상 HPLC 악기를 사용 하 여이 프로토콜에 대 한. 그것은 차입 그라데이션 프로그래머, 이진 용 매 전달 시스템, 220 및 254 nm, 그리고 프로그래밍 가능한 분수 수집기에서 감지 수 있는 UV 검출기를 포함 해야 합니다. 최대 유량 50 mL/min 이어야 한다.</li>
	<li>사용 된 C-18 분리에 대 한 위상 열 반전. 다음 치수의 열 순화 되 고 고체의 질량에 따라 사용할 수 있습니다 그리고 그물 PPA (표 2)의 청구.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PPA 충전</td>
			<td>입자 크기</td>
			<td>열 크기</td>
			<td>원유 PPA의 질량</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ ve 부과</td>
			<td>5 μ m</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>-ve 부과</td>
			<td>5 μ m</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ ve 부과</td>
			<td>5 μ m</td>
			<td>150 x 21.2 m m</td>
			<td>90 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>-ve 부과</td>
			<td>5 μ m</td>
			<td>150 x 21.2 m m</td>
			<td>90 밀리 그램</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 제안 열: 열 크기, 입자 크기 및 C18 주입 당 최대 부하 용량 역 상 HPLC 열
<ol start="7"><li>열 용량에 의해 결정는 HPLC의 주사 루프의 볼륨으로 볼륨 PPA를 주사. 표 3 (차입 시간 40 분) 설정에 따라 HPLC 그라데이션 메서드를 실행 합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시간</td>
			<td>용 매 (이기)</td>
			<td>용 매 B (물)</td>
			<td>유량 (mL/min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
			<td rowspan="5">유량 열 패킹 및 크기에 따라 달라 집니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
<tr>
<td>35</td>
			<td>95%</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>38</td>
			<td>100%</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 제안된 그라데이션: 시간의 기간 동안 물 vs 이기의 상대 구성을 보여주는 역 위상 그라디언트를 제안 했다. 유량 열 사양에 따라 달라 집니다.
<ol start="8"><li>
MALDI를 사용 하 여 다양 한 테스트 튜브에 수집 된 분수를 분석 하 고 어떤 튜브 (또는 튜브) 포함 PPA 결정. 이것은 각 관에서 발견 하는 분자량을 공부 하 여 평가.
	<ol>
<li>분석 HPLC에 분수의 순도 확인 하십시오. 220에서 설정 하는 UV 검출기를 장착 하는 HPLC 그라데이션 시스템을 사용 하 여 nm.</li>
		<li>불순물 인 HPLC에 의해 정화의 추가 사이클을 할. 대리점 HPLC에 사용 되는 위의 그라데이션의 열 변환기 온라인 소프트웨어를 사용 하 여 분석 HPLC를 사용 하 여 확장할 수 있습니다. 각 분수는 많은 물리적 특성 또는 생물 학적 평가 대 한 순수한 ≥95% 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>큰 둥근 바닥 플라스 크 또는 증발 플라스 크에 분수를 수집 하 고 모든 이기와 물 대부분 제거. 최종 PPA 솔루션 10ml 더 이상 이어야 한다.</li>
	<li>이 집중 50 mL 원심 분리기 튜브에 전송. PPAs 세제와 같은 물질;는 권고 따라서, 거품 용 매의 증발 하는 동안 생성 됩니다. 우리는 에틸 알코올의 거품 형성 감소 나타났습니다.</li>
	<li>진공 집중 집중. 진공 증발 동안 많은 양의 PPA 컨테이너의 벽에 준수 수 있습니다. 반복적으로 HPLC 물 플라스 크 벽을 rinsing 하 여이 복구 합니다. 집중된 PPA와 이트는의 결합 된 볼륨 30 mL 더 이상 이어야 한다.</li>
	<li>50 mL 튜브 내 용액을 놓습니다.</li>
	<li>
플래시는 액체 질소에이 PPA 솔루션을 고정: 참고: 것입니다 숭 고 한 빨리는 lyophilizer에 있는 작은 얼음 결정에 동결 결과 플래시. 또한, 느린 냉동 supramolecular 자기 조립 구조의 형성을 허용할 수 있습니다. 또 다른 대안 (하지만 덜 바람직한)은 점차-80 ° C 냉장고에서 동결 또는 드라이 아이스 + 아세톤 혼합물을 사용 하 여 고정<ol>
<li>lyophilizer에서 원심 분리기 튜브를 배치 하기 전에 구멍 또는 수 분 샘플을 탈출 하 고 냉장 장치에서 수집 된 수 있도록 튜브의 뚜껑을 푸 세요. -54 ° C와 0.016 mbar 설정 동결은 단위를 설정 합니다. 참고: 다른 옵션은 제거 하는 모자 고 개통 위에 (고무 밴드)와 지우기. 또한, 우리는 각도에서 샘플을 동결 하거나 작은 부분으로 얼음을 깨고 표면적 증가로 인해 빠르고 더 나은 동결은 대 한 수 있습니다 나타났습니다.</li>
		<li>솔리드 녹기 시작 하는 경우이 유기 용 매 (일반적으로 이기)의 흔적이 있는지 나타낼 수 있습니다. 동결 단계를 반복 하 고 동결은의 상태.</li>
		<li>녹는 지속 되 면, 두 가지 잠재적인 솔루션은:<ol>
<li>분할 (튜브에 배치)를 두 부분에서 샘플, 물으로 희석 하 고 다시 동결. 사용 하지 마십시오이 솔루션 종종 있기 때문에 많은 양의 유기 용 매는 장비 손상 될 수 있습니다.</li>
			<li>또는 술병에 샘플을 배치 하 고 더 진공에서 유기 용 매를 증발. 일반적으로 액체 형태로 샘플 lyophilizing 지원 해주 손실과 PPA 화합물의 리드.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. PPAs의 저장
<ol><li>저장소는 모자-20 ° C에 PPAs 강화 하 고 적절 한 상표를 가진 튜브에 Parafilm으로 밀봉.</li>
	<li>사용 하기 전에 PPA 다시 가져올는 PPAs에 수증기의 응축을 피하기 위해 진공 챔버에 주위 온도.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언에 충돌의 관심을가지고

합성 파로 우물 및 펩타이드 기반 분자 (하이브리드 PA-peptoids) 등 관련 PPAs 하 여기에 설명 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다. SPPS를 사용 하 여 펩 티 드의 합성은 간단한 절차, 생물학 유도 분자를 포함 하는 펩 티 드의 종합 특히 도전 수 있습니다. Polyamines spermine, spermidine, diethyelenetriamine, 등, 유도 분자 암 세포13타겟팅으로 작동할 수 있습니다. PPAs 자체 다양 한 형태학6nanostructures로 조립할 수 있다. 그들의 긍정적인 요금 또한 긴 순환 시간 (때문에 endosomal 탈출)와 다른 신진 대사 프로필 (전통적인 PA와 비교) 하는 경우 도움이 됩니다. 그러나, PPAs 및 그들의 아날로그 합성 수 특정 도전 1 차 및 이차 아민의 존재 때문에. 제시 합성 전략 직각 보호 그룹의 합리적인 사용 하 여이 문제를 극복 한다. Dde ...

자가 조립 펩 티 드 amphiphiles (Pa)는 일반적으로 다음 세그먼트의 구성 하는 생체 재료의 클래스: (a) 친수성 머리, (b) 링커 지역, 및 (c) 소수 성 꼬리. 대부분 파 문학에 설명 된 충전 또는 극 지 아미노산 잔류물1,2,,34로 구성 된 친수성 머리를 소유한 다. 파 의학 등5, 재생 의학, 질병 진단, 약물 전달 등에서 다양 한 응용 프로그램을 발견 했습니다. 그들의 아미노산 서 열을 바탕으로, 파 nanostructures 구형 micelles 나노 필 라 멘 트 등의 다양 한을 형성할 수 있다. 우리 최근 하이브리드 polyamine 기반 펩타이드 amphiphiles, PPAs6나의 클래스를 보고 있다. 형태학, 자가 조립 속도 론, 그리고이 생체의 대사 저하 solubilizing 머리 그룹 그들의 관련을 발견 했다. 또한, PPA nanostructures 테스트 농도에 포유류 세포 (MiaPaCa2 그리고 HeLa 세포 라인)으로 독성을 보여주지 않았다. PPA 기반 nanocarriers는 매력적인 마약 배달 차량 때문에: (1) polyamine 통풍 및 대사 암 세포 증가 표시 되었습니다, (2) 양이온 nanostructures endosomal 탈출7,8을 달성할 수 있다 높은 순환 및 셀, 및 (3) 그들은 PA;와 비교할 때 다른 신진 대사 프로필 있어야 내 거주에 이르게 예를 들어 그들은 인간의 신체에서 발견 하는 프로 테아 제 쪽으로 더 안정 될 것입니다 (비록 그들은 어쩌면 아민 oxidases 같은 다른 효소에 민감한)9,10. 또한, PPAs 다양 한 형태학, 물리 화학적 특성, 나노 강성 및 길이 개별 PPA 분자6의 요금에 따라 조립 활동 발견 되었습니다. 여기, 우리는 합성, 식별 및 파 또는 유사한 하이브리드 펩 티 드 분자의 준비에도 적용 될 수 있는 PPAs의 정화에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
Polyamines는 일반적으로 그들의 보호 된 형태로 상업적으로 사용할 수 있기 때문에 고 이므로 polyamines의 1 차 및 이차 아민 보호 우리 설명 아미노산 및 다른 분자 들을 변화에 대 한 매우 중요 합니다 그들의 보호를 달성 하기 위해 합성 단계입니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표 polyamines 아미노산을 변화에 대 한 간단한 방법을 제공 하는 것입니다. Polyamines 부족 carboxylic 그룹; 따라서, 그들은 링크 아 미드 또는 왕 수 지에 결합 될 수 없습니다. 대신, 2 chlorotrityl 염화 비닐 등 수 지 합성 프로토콜에 대 한 권장 됩니다. PPA 합성에 대 한 주요 도전 1 차 및 이차 아민 기능적인 그룹의 존재 이다. 우리의 목적을 위해 우리는 커플링 반응 수 있도록 무료 polyamine에 기본 아미노 그룹을 유지 하면서는 polyamine에 모든 이차 아민 보호. 반응 고체 지원 각 커플링 및 deprotection 단계 후 작업 업 촉진 하기 위하여 단단한 단계 펩 티 드 종합 (SPPS)의 원칙에 따라 이루어졌다. 다음 프로토콜은 PPAs의 수동 및 자동 합성에 대 한 (비록 몇 가지 단계의 검증 자동화 시스템에 도전 것입니다). 이러한 분자의 합성도 실행 될 수 있다 밖으로 자동된 합성기에 또는 전자 레인지 반응 기의 도움으로 (자동 또는 반자동). 반응 체계는 그림 1에 요약 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig1.jpg"> 그림 1: (A) A PPAs의 합성에 대 한 일반적인 반응 체계. 하는 데 사용 될 수 있는 (B) 대표 polyamines PPAs 여기에 설명 된 합성. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>2-Chlorotrityl 클로라이드 수지&nbsp;</td><td>AappTec</td><td>RTZ001</td><td></td></tr><tr><td>SynthwareTM 합성 용기&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>SYNP120050M</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Acros</td><td>AC406920250</td><td>Fisher Sci. 카탈로그 #</td></tr><tr><td>Wrist Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>401000-2</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser 테스트 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS004772</td><td></td></tr><tr><td>무수 메탄올</td><td>아크로스</td><td>AC610981000</td><td>Fisher Sci. 카탈로그 #</td></tr><tr><td>Chloranil 테스트 키트</td><td>TCI</td><td>TCC1771-KIT</td><td>VWR 카탈로그 #</td></tr><tr><td>Di-tert 부틸 디카보네이트&nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC194670250</td><td>Fisher Sci. 카탈로그 #</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazine</td><td>Acros</td><td>AC296815000</td><td>FIsher Sci. 카탈로그 #</td></tr><tr><td>(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)</td><td>p3biosystems</td><td>31001</td><td></td></tr><tr><td>4-methyl piperidine&nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC127515000</td><td>Fisher Sci. 카탈로그 #</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>AappTec</td><td>CXZ035</td><td></td></tr><tr><td>트리이소프로필 실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>에테르</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>&알파;-시아노-4-하이드록시신남산</td><td>시그마-알드리치</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>9-아미노아크리딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>92817</td><td></td></tr><tr><td>피셔브랜드&nbsp; 주사기 필터: PTFE 멤브레인</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>09-730-21</td><td></td></tr></tbody></table>

polyamine 기반 펩타이드 amphiphiles (ppas) 및 관련된 생체 자기 조립의 합성에 대 한 손쉬운 프로토콜

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

펩 티 드 Amphiphiles polyamine 기반 (PPAs) 자가 조립 amphiphilic 펩 티 드 amphiphiles (Pa)에 바이오 관련의 새로운 클래스는. 전통적인 파 소유 그룹 (리 신, 아르기닌), 지질 세그먼트에 직접 연결 하거나 중립 아미노산의 링커 지구를 포함할 수 있습니다 solubilizing로 충전된 아미노산. 파의 펩 티 드 순서를 조정 하는 것은 다양 한 형태학 얻을 수 있습니다. 마찬가지로, PPAs 소수 성 세그먼트 및 중립 아미노산, 하지만 또한 물 (친수성) 그룹 solubilizing polyamine 분자를 포함. 파로 PPAs 때 물속에에서 녹아 있는 작은 봉, 트위스트 나노-리본, 및 융합된 나노 시트, 포함 한 다양 한 형태학에 자체 조립 또한 수 있습니다. 그러나, 단일 polyamine 분자에 1 차 및 이차 아민의 존재 PPAs 합성 때 상당한 도전 포즈. 이 문서에서 우리는 단단한 단계 펩 티 드 합성 (SPPS)을 사용 하 여 PPAs의 손쉬운 합성을 달성 하기 위해 문학 판례에 따라 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 우선권 및 다른 유사한 시스템의 합성에 확장할 수 있습니다. 우리는 또한 수 지, 식별 및 정화에서 분열에 필요한 단계를 보여 줍니다.

합성 및 정화 후 및 물리 화학적 또는 생물학적 평가 전에 PPAs의 대 중은 다시 확인 및 순도 분석 HPLC를 사용 하 여 확인 하는 것이 좋습니다. 소재 특성 또는 생물 학적 평가, PPAs 필요가의 순도 &gt; 95%. 그림 2 는 HPLC 추적 (맨 위) 및 제품의 존재를 확인 MALDI 스펙트럼 (아래). HPLC 분석 시스템 (AUC) 곡선 아래의 영역을 통합 하 고는 AUC &gt; 제품 순도 95%를 관련이 있을 수 있습니다. UV 기반 HPLC 시스템, 단일, 날카로운 피크를 보고 기대 합니다. MALDI 스펙트럼 (MALDI 분석 모드)에 따라 ± 1 다 내에서 PPA의 계산 된 분자량의 일치 해야 합니다.
자기 조립은 PPAs의 구상 될 수 있다 및 전송 전자 현미경 (TEM) (<str...

Polyamine 기반 펩타이드 amphiphiles (PPAs)의 합성은 이러한 반응 기능 마스크 그룹 보호의 사리 분별이 사용 여러 아민 nitrogens의 존재로 인해 중요 한 도전 이다. 이 문서에서 우리는 자기 조립 분자의 이러한 새로운 클래스의 준비에 대 한 손쉬운 방법을 설명합니다.

Polyamine 기반 펩타이드 Amphiphiles (PPAs) 및 관련된 생체 자기 조립의 합성에 대 한 손쉬운 프로토콜

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). ...

이 방법은 펩타이드 양서류를 폴리아민으로 장식하는 방법과 팔각형 보호 그룹의 사용에 대한 주요 질문에 답할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 여러 반응면을 포함하는 보호되지 않은 화학 빌딩 블록으로 하이브리드 펩타이드 양서류를 생성할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 콘다 셰리단 연구소(Conda Sheridan Laboratory)의 실험실 학생인 메흐디(Mehdi), 나탈리아(Nathalia), 크리슈나이아(Krishnaiah)입니다. 먼저, 2-Chlorotrityl chloride 수지의 무게를 조심스럽게 측정하고 수지를 50ml 용량의 중간 다공성 합성 용기에 넣습니다.다음으로, synethesis 용기를 가변 속도 기계식 셰이커에 부착하고 용기를 45도 각도로 돌려 교반을 최대화합니다. 그런 다음 수지에 15ml의 DCM을 추가합니다. 수지 비드가 15분 동안 팽창하도록 한 후 원하는 폴리아민 8개를 수지에 첨가하고 5시간 동안 반응시킵니다.5시간 후, 카이저 테스트를 수행하여 폴리아민과 수지의 성공적인 반응을 확인합니다. 그런 다음 무수 메탄올에 DDE의 4개 등가물을 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 흔들어 1차 아민기를 보호합니다. 다음 날, 카이저 테스트를 수행하여 수지 비드에 파란색이 없어 성공적인 보호를 확인합니다.그런 다음 DCM을 배출하고 DCM과 DMF의 2:1 혼합물로 수지를 두 번 세척합니다. 이제 DCM의 Boc Anhydride 20 등가물을 수지에 첨가하고 3 시간 동안 반응을 진행하도록합니다. 2차 아민의 보호를 확인하기 위해 클로라닐 테스트를 수행한 후 용매 혼합물을 배출하고 DCM과 DMF의 2:1 혼합물로 수지를 두 번 세척합니다.그런 다음 DMF의 2% 히드라진 용액 10ml를 수지에 첨가합니다. 1시간 동안 흔든 후 카이저 테스트를 수행하여 일차 아민의 성공적인 탈보호를 확인합니다. 다음으로, Fmoc 보호 아미노산 4개, HBTU 3.95개 당량, DIPEA 15개 당량을 혼합합니다.DCM과 DMF의 일대일 혼합물을 추가하고 완전히 용해될 때까지 칵테일을 초음파 처리합니다. 혼합물을 수지에 첨가하기 전에 아미노산, 커플링제 및 DIPEA가 실제로 혼합되고 활성화되었는지 확인하십시오. 카르복실산 활성화를 확인하기 위해 3-5분을 기다린 후 수지가 들어 있는 용기에 반응 혼합물을 추가하고 상온에서 2-4시간 동안 반응을 진행하도록 합니다.성공적인 커플링을 확인하기 위해 모든 단계에서 카이저 또는 클로라닐 테스트를 수행합니다. 성공적인 결합을 확인하기 위해 카이저 테스트를 수행한 후 DMF에 4-메틸피리딘의 20% 용액 10ml를 첨가하여 아미노산으로부터 Fmoc 그룹을 보호합니다. 반응이 완료되면 카이저 테스트를 수행하여 아미노산의 성공적인 탈보호제를 확인합니다.그런 다음 10ml의 DMF로 수지를 두 번 세척할 때마다 5분 동안 지속하고 마지막으로 10mL의 DCM으로 10분 동안 세척합니다. 필요한 모든 아미노산을 결합한 후, HBTU 9.5 당량과 DIPEA 12 당량에 원하는 카르복실산 기능성 10 당량을 추가하여 소수성 꼬리를 마지막 아미노산에 접합합니다. 완전히 용해될 때까지 칵테일을 초음파 처리한 다음 칵테일을 용기에 추가합니다.최소 5 시간 동안 반응을 수행하되 가장 높은 수율을 위해 밤새 수행하는 것이 좋습니다. 8ml의 DMF로 수지를 2분 동안 세척하고 8ml의 DCM으로 5분 동안 두 번 세척합니다. 추가하기 전에 용기에서 용매를 배출하십시오.마지막 세척이 수행되면 진공 상태에서 수지를 15분 동안 건조시킵니다. 15ml의 분열 칵테일을 준비하려면 0.5ml의 물과 0.5ml의 트리이소프로필실란에 14ml의 TFA를 추가합니다. 이 분열 칵테일을 수지에 넣고 실온에서 2-4시간 동안 흔듭니다.절단 반응이 완료된 후 50ml 둥근 바닥 플라스크에 용액을 수집합니다. 그런 다음, 감압에서 회전 증발기를 사용하여 TFA를 1-2 밀리리터로 진공 농축하고, 혼합물을 섭씨 40도에서 가열하면서 증발 후, 얻어진 TFA 용액을 15 밀리리터의 무수 저온 에테르가 들어있는 둥근 바닥 플라스크에 적가하여 PPA를 침전시킨다. 다음으로, 농축된 TFA 용액이 들어 있는 원래 플라스크에 5ml의 무수 콜드 에테르를 추가합니다.추가 고형물을 회수하기 위해 초음파 처리합니다. 그런 다음 이전 단계의 에테르 용액과 결합합니다. 플라스크를 덮고 밤새 냉장고 안에 넣어 강수량을 최대화하십시오.다음 날에는 미세하거나 중간 크기의 중앙 디스크 필터 깔때기를 사용하여 진공 여과로 침전된 물질을 수집합니다. 마지막으로, 침전물을 5-10 밀리리터의 차가운 에테르로 두 번 세척하여 잔류 유기물을 제거합니다. HPLC 추적 및 MALDI 스펙트럼은 재료 특성화 또는 생물학적 평가를 위해 순도가 95% 이상이어야 하는 PPA 제품의 존재를 확인합니다.UV 기반 HPLC 트레이스에서 단일 날카로운 피크가 관찰되며 MALDI 스펙트럼은 플러스 또는 마이너스 1 달톤 내에서 계산된 PPA 분자량의 피크에 해당합니다. PPA의 자체 조립은 투과 전자 현미경, 원자력 현미경, 소각 X선 산란, 주사 전자 현미경 및 동적 광 산란으로 시각화하고 분석할 수 있습니다. 성공적인 자기 조립은 투과 전자 현미경과 원자력 현미경 모두에서 잘 정의된 나노 구조를 얻을 것입니다.이 프로토콜은 일단 마스터하면 제대로 수행되면 3일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 후속 연구 전에 제품을 정제하고 순도를 평가하는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라, 펩타이드 양친매성, 펩티드 및 펩타이드-폴리아민 하이브리드와 같은 다른 분자를 제조할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 약물 전달, 이미징 또는 촉매와 같은 영역에서 폴리아민 나노 구조의 영향을 탐구하기 위해 자기 조립 펩타이드 양친매성 분야의 연구를 돕는 데 도움이 됩니다.이 비디오를 시청한 후에는 폴리아민 기반 펩타이드 양친매성 및 관련 펩타이드 양친매성의 합성을 수행하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 트리플루오로아세트산과 4-메틸피리딘은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑, 실험실 가운 착용 및 흄 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

기본 장비 및 상용 시약과 관련된 단순하고 일반적인 수동 peptoid 합성 방법은 peptoids 쉽게 대부분의 실험실에서 합성 수있게 설명되어 있습니다. amphiphilic peptoid의 36mer의 합성, 정제 및 특성은 물론 높은 주문한 nanosheets로의 자기 조립과 같이 설명되어 있습니다.

높은 명령으로 Nanosheets에 Peptoid 폴리머 및 자기 조립의 고체 상 합성 Submonomer

이 논문은 자기 조립의 자연 프로세스에 의해 주문한 높은 펩타이드 기반 구조의 형성을 설명합니다. 이 방법은 시판 펩티드 및 일반적인 실험실 장비를 이용한다. 이 기술은 펩티드의 큰 다양성에 적용 할 수 있으며, 새로운 펩티드 어셈블리의 발견으로 이어질 수있다.

짧은 펩타이드의 자기 조립에 의해 주문 생체 고분자 구조의 형성

우리는 최소한의 비용 또는 전문 지식을 갖춘 ECM 단백질의 직접적인 결합을 허용 히드 록시 PAAm라는 새로운 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 제시한다. 마이크로 콘택트 프린팅 휴대 mechanostransduction을 연구 천연 세포 미세 환경의 많은 큐들의 독립적 제어를 용이하게하여 히드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔.

mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조

펩타이드 차 아미드 (학부모 교사 협의회)를 포함하지만, 펩티드, peptoids 및 N-메틸화 펩티드에 국한되지 않습니다 펩티 도미 메틱의 슈퍼 패밀리입니다. 여기에서 우리는 학부모 교사 협의회의 한 구슬 한 화합물 라이브러리를 합성하는 분할과 풀과 하위 단량체 전략을 결합 합성 방법을 설명합니다.

분할 및 풀 합성 펩타이드 급 아미드 도서관의 특성

동일한 순서로 양이온 기능이 혼합된 펩토이드를 합성하는 프로토콜이 제시됩니다(라이신 및 아르기닌 유형 단량체). 피부 리슈마니아증을 일으키는 원생동물 기생충인 Leishmania mexicana에 대한 이러한 화합물의 후속 테스트도 설명됩니다.

이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

우리는 합성에 대 한 프로토콜와 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 통합의 정화 수정 잔류물. 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법은 설명 합니다.

시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

1, 2-dithiolane의 합성에 대 한 프로토콜 펩 티 드와 펩 티 드에서 자기 조립 결과 supramolecular 구조의 특성 수정.

합성 및 특성 1, 2-Dithiolane의 수정 자가 조립 펩 티 드

이 프로토콜 lysine-티로신-페닐알라닌 (KYF) tripeptide로 안정 된 올레 acids-platinum(II) 공액 nanoemulsion 합성 하는 효율적인 방법을 설명 합니다. 된 KYF는 공액의 자기 조립을 통해 가벼운 합성 조건에서 nanoemulsion 양식.

올레산의 Tripeptide 안정 Nanoemulsion

정보 부호화 된 펩토이드 올리고머의 합성과 동적 공유 반응체 쌍 및 루이스 산성 희토류로 아민과 알데히드를 사용하여 분자 사다리로 이러한 펩토이드의 시퀀스 지시자가 조립하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 다중 역할 시약으로 금속 triflates.

정보 베어링 펩토이드의 합성과 시퀀스 지향 동적 공유자 자체 조립

이 문서는 유기 용매 혼합물에서 감마 변형 펩타이드 핵산 올리고머로부터 나노 구조의 설계 및 자체 조립을 위한 프로토콜을 제공합니다.

감마 변형 펩타이드 핵산의 자가 조립을 유기 용매 혼합물의 복잡한 나노 구조로

이 프로토콜은 환경 조건을 사용하여 펩타이드가 하이드로겔로 자가 조립되도록 하는 세 가지 빠르고 간단한 준비 방법을 제시합니다. 또한 펩타이드 하이드로겔의 특성 분석이 설명되어 이러한 간단한 조건에서 기계적으로 안정적인 펩타이드 하이드로겔을 형성할 수 있음을 보여줍니다.

기계적으로 안정적인 자체 조립 펩타이드 하이드로겔의 제조

배우세요 폴리아민 기반 펩타이드 양친매체(PPA) 합성 방법을 통해 보호기 없이 하이브리드 분자를 제조하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 생체 자기 조립 연구에 활용됩니다.

Polyamine 기반 펩타이드 Amphiphiles (PPAs) 및 관련된 생체 자기 조립의 합성에 대 한 손쉬운 프로토콜

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