태아 쥐의 내장 장기에서 자율 신경 Progenitors의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 절연을위한 최적화된 절차

이 절차의 전반적인 목표는 말초 신경계 신경절에서 정제된 신경 전구 세포의 집단을 유도하는 것입니다. 이것은 먼저 태아 마우스에서 관심 있는 장기 또는 특정 신경절을 해부함으로써 수행됩니다. 그런 다음 조직은 부분적으로 해리되어 개별 세포를 주변 매체로 방출합니다.

다음으로, 세포 현탁액을 여과하여 잔류 조직 덩어리 또는 큰 응집체를 제거합니다. 마지막으로, 세포 현탁액은 해당 세포 집단에서 형광 리포터의 발현을 기반으로 관심 집단을 분리하기 위해 흐름 분류됩니다. 궁극적으로, 유전자 발현 패턴은 서로 다른 발달 단계에서 분리된 전구 또는 서로 다른 신경 세포 유형의 정제된 집단 간에 비교할 수 있습니다.

항체 표지를 기반으로 세포 집단을 분리하는 것에 비해 이 기술의 주요 장점은 면역 시약을 사용할 수 없는 경우가 많다는 것입니다. 특정 유전자를 발현하는 세포를 라벨링하면 개별 신경 세포 하위 집합에서 형광 단백질을 생산하는 유전자 조작 마우스 계통이 이러한 세포 집단을 격리할 수 있습니다. 입의 장 및 신경겐 트랙에서 신경 전구 세포를 분리하기 위한 이 방법을 시연하는 한편, 형광 리포터를 발현하는 다른 모델 시스템에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 소스 조직을 과도하게 소화하는 경향이 있어 세포 생존력을 잃는 경향이 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 해부를 시작하기 전에 명시야 조명으로 배아를 보고 관련 구조에 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다. 그런 다음 형광 실체 현미경을 사용하여 형광 리포터의 발현을 스크리닝하여 전이유전자 양성 배아를 식별합니다.

안락사 후, 배아는 해부 접시에 최소한의 PBS를 추가하는 것으로 시작하므로 조직이 해부되는 동안 배아가 뜨지 않습니다. 배아의 피부를 몸의 측면을 따라 그리고 간 수준에서 복부를 가로 질러 엽니 다. 배아를 뒤로 굴리고 가는 집게를 사용하여 제자리에 고정합니다.

앞다리 높이에서 횡격막 높이에 다른 집게를 삽입한 다음 세게 삽입합니다. 내부 장기를 꼬리 쪽으로 당기고 등쪽 몸벽에서 멀어지게 하여 간에서 생식기 결절까지 내장을 제거합니다. 심장이나 폐와 같은 흉강에서 내장과 연결된 장기가 나오면 더 진행하기 전에 제거하십시오.

복부 내장이 사체에서 분리되면 간 아래, 위 근처에 집게를 삽입하고 간을 장에서 부드럽게 떼어냅니다. 그런 다음 뒷내장을 등쪽 요도에서 조심스럽게 해부하고 비뇨생식관에서 장을 제거합니다. 마지막으로 장을 뒤집어 위 아래의 비장이 보이도록 합니다.

비장과 췌장을 제거합니다. 약을 잡고 장의 고리를 잡아당겨 분리하십시오. 그런 다음 mesentary를 부드럽게 당겨서 내장에서 mesentary 및 동반 vasculature를 벗겨냅니다.

겸자로 장을 직접 잡지 마십시오. 장이 부서지면 해리 단계에서 분리된 조각을 모으기만 하면 됩니다. 조직 유형 및 배아 표현형 유형에 따라 얼음처럼 차가운 HBSS를 포함하는 15ml 원추형 튜브에 각 조직 유형을 함께 모읍니다.

펠릿화 후, 하위는 절개된 조직을 가능한 한 많은 HBSS를 흡인합니다. 그런 다음 조직 펠릿을 1-수 밀리리터의 ACU max에 재현탁합니다. 각 샘플 간 파이펫 팁 교체.

조직 유형의 교차 오염을 방지하려면 튜브를 섭씨 37도의 수조에 20-45분 동안 넣으십시오. 분리되는 조직의 단계에 따라 조직의 해리 및 필터링은 조직의 명백한 해리를 방지하기 위한 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 그 결과, 세포 생존율이 낮아집니다.

해리 시간을 제한하고 중간에 모든 조직 조각을 완전히 해리하려고 하지 마십시오. 그리고 해리 시간이 끝나면 튜브를 수조 측면에 세게 두드리고 손목을 찰칵하는 동작으로 튜브를 아래로 던져 조직을 수동으로 분해합니다. 이제 해리된 샘플을 얼음 위로 옮기고 각 샘플에 대해 새 피펫 팁을 사용하여 각 튜브에 새로 준비된 담금질 1ml를 즉시 추가하고 조직이 거의 완전히 해리될 때까지 샘플을 위아래로 트라이앵글합니다.

이제 한 쌍의 에탄올 살균 겸자를 사용하여 새로운 15 밀리미터 원추형 튜브의 입구에 3 센티미터 정사각형의 38 미크론 나일론 메쉬 멤브레인을 놓습니다. 그런 다음 좁은 보어 팁을 사용하여 멤브레인 중앙으로 피펫팅하여 메쉬를 통해 개별 재현탁 세포 용액을 여과합니다. 세포 현탁액이 여과되면 1ml의 담금질 1-5로 샘플 튜브를 헹구고 남은 세포를 여과합니다.

그런 다음 여과되지 않은 조직 샘플이 튜브에 들어가지 않도록 주의하면서 멤브레인을 제거합니다. 펠릿화 후, 세포 현탁액은 상층액을 흡인하고 펠릿을 1 밀리리터의 담금질에서 5 밀리리터로 재현탁합니다. 그런 다음 그림과 같이 나일론 메쉬를 통해 각 세포 현탁액을 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 여과합니다.

먼저 EGFP 보상 제어를 위해 형광 샘플의 작은 부분 표본을 예약합니다. 그런 다음 야생형 조직 샘플을 두 부분으로 나누어 하나는 야생형만, 다른 하나는 A, d.Only라고 표시합니다. 이제 모든 샘플 튜브를 1에서 5로 채우고 펠릿 화 한 후 샘플을 각 튜브에서 마지막 200 마이크로 리터의 상등액을 제외한 모든 것을 흡입합니다.

마지막으로 정렬할 샘플에 7개의 a a d 를 추가하고 7개의 a a d 전용 컨트롤을 추가합니다. 그런 다음 0.75밀리리터 트리아졸 LS를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기에 추가합니다. 샘플 채취 튜브는 대조 샘플을 사용하여 보상 매개변수와 게이트를 설정하여 7개의 A, D 양성 데드 셀을 방지하고 높은 강도의 GFP 형광을 나타내는 세포를 수집하는 것으로 시작합니다.

보상 매개변수를 설정한 후 넓은 보어 노즐과 낮은 유량으로 가능한 가장 낮은 압력에서 분류를 시작하십시오. 최대 25의 각 마이크로 분리기 관으로 triol LS가 묽게 되지 않다 그래야 세포를 모으십시오. 소용돌이를 분류한 직후, 트리올 ls에 포착된 세포의 각 튜브.

이 첫 번째 그림에서는 명시야 조명 아래에서 복부로 본 성교 후 15.5일에 전체 유로 생식기 전체가 여기에 표시됩니다. TH EGFP 전이유전자 발현에 의해 확인된 부신 및 중간에 위치한 셀리악 신경절에서 EGFP 양성 세포의 분포를 입증하기 위해 형광 조명 하에서 동일한 샘플을 볼 수 있습니다. 15.5일 후 cotus TH EGFP sub 절제 방광의 측면 보기는 골반신경절, 방광벽 및 요도에서 이식유전자 발현으로 인한 형광을 보여줍니다.

동일한 EGFP의 이러한 등쪽 관점에서는 양성 세포가 전방, 등쪽 요도에서 명백하며, 세포 현탁액을 생성하기 위한 조직 해리, 유동 분류는 적절한 효소 소화와 낮은 세포 변동성을 초래할 수 있는 과도한 소화 방지 사이의 섬세한 균형입니다. 이 현미경 사진은 해리 시간의 중간에 하부 비뇨 생식기와 장 조직을 보여줍니다. 수동 전후에 적절하게 소화된 조직의 사진에서 볼 수 있듯이, 너무 오랫동안 또는 너무 높은 농도의 효소로 처리된 조직에서 하위 절개된 장기의 세 조각이 여전히 명확하게 나타납니다.

그러나 생성된 현탁액에는 잔류하는 큰 조직 조각이 부족하고 적절한 해리가 있으며 수동 필터링은 일반적으로 90% 이상의 생존 가능한 세포를 나타내는 유세포 분석 프로파일을 생성하고 이 생존 가능한 집단에서 리포터를 발현하는 세포는 고강도 EGFP 발현을 유지합니다. 흑인 집단은 죽은 단일 세포로 구성되며 7개의 a a d 형광 다이를 흡수하여 표지됩니다. 회색 집단은 7개의 a a d를 배제한 전방 및 측면 산란을 기반으로 하는 단일항 세포로 구성되며, 따라서 생존 가능합니다.

녹색 집단은 게이트 GFP 양성 영역에서 유래하며 7개의 A a d를 배제하고 EGFP 형광을 나타내는 단일 생존 세포로 구성됩니다. 이 절차를 통해 교감신경 사슬, 등쪽 뿌리, 신경절 또는 폐와 같은 다른 말초 조직에서 신경 전구 세포를 분리하여 개체군 간 유전자 발현 프로필의 차이 또는 뚜렷한 계통의 발달에 대한 질문에 답할 수 있습니다.