단일 분자 이미징을위한 소형 양자 점

이 절차의 전반적인 목표는 단일 분자 이미징에 사용하기 위해 최적화된 밝기와 안정성, 최소화된 크기 및 비특이적 결합을 갖춘 형광 양자점을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 작은 카드뮴 셀레나이드 양자 점 코어를 준비하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 이러한 코어를 수은과 합금하여 형광을 적색 스펙트럼으로 전환하고 밝기를 높이는 것입니다.

다음으로, 형광 방출을 안정화하기 위해 나노 결정에 얇은 합금 쉘을 성장시킵니다. 마지막 단계는 생물학적으로 불활성인 폴리에틸렌 글리콜로 변형할 수 있는 다중 치상 폴리머를 사용하여 이러한 입자를 유기 용매에서 수성 완충액으로 옮기는 것입니다. 궁극적으로, 형광 분광법, 겔 크로마토그래피 및 겔 전기영동을 사용하여 이러한 입자가 밝은 형광, 컴팩트한 유체역학적 크기 및 생물학의 단일 분자 형광 이미징에 적합한 중성 정전기 전하 속성을 가지고 있음을 보여줍니다.

기존 상용 재료에 비해 이러한 양자점의 주요 장점은 이러한 나노 입자가 유체역학적 크기가 크게 감소한다는 것입니다. 더 작은 양자점은 형광 강도 감소, 형광 안정성 감소 및 청색 스펙트럼에서만 형광에 의해 부정적인 영향을 받지만, 당사는 수은 양이온 교환 프로세스를 사용하여 이러한 효과를 상쇄했습니다. 이러한 나노 결정은 혼잡한 생물학적 환경에서 단일 생체 분자의 동적 이미징을 가능하게 하여 생물 물리학 및 세포 신호전달의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

시작하려면 0.4ml에 셀레늄을 추가하여 상단에 셀레늄 50몰 용액을 준비합니다. 3개의 넥 플라스크, 고진공 상태에서 플라스크를 비우고 공기가 없는 조건에서 sch 생크 라인을 사용하여 아르곤으로 채웁니다. 상단 10ml를 넣고 섭씨 100도까지 가열하면서 1시간 동안 저어주면 투명한 무색 용액이 생성됩니다.

용액을 실온으로 식히고 플라스크를 따로 보관하십시오. 또한 서면 프로토콜에 나열된 양을 사용하여 250ml 3 넥 플라스크에 카드뮴 산화물 TDPA 및 ODE 용액을 준비합니다. 이 비디오와 함께 교반하는 동안 생크 라인을 사용하여 용액을 비우십시오.

온도를 섭씨 100도까지 올리고 추가로 15분 동안 대피합니다. 아르곤 가스에서 끓는점이 낮은 불순물을 제거하려면 혼합물을 섭씨 300도까지 1시간 동안 가열하여 카드뮴 산화물을 완전히 용해시킵니다. 용액은 붉은 색에서 투명하고 무색으로 변하여 용액을 실온으로 냉각시킵니다.

다음으로 카드뮴 용액에 HDA를 첨가하고 섭씨 70도까지 가열한 후 배출합니다. 일정한 압력에 도달하면 온도를 높이고 용액을 30분 동안 환류시킵니다. schlink 라인 밸브를 불활성 가스로 전환하고 열전대를 용액에 직접 삽입합니다.

공기가 없는 조건에서 카드뮴 용액에 DPP를 첨가하고 온도를 섭씨 310도까지 높입니다. 이제 16 게이지 바늘에 부착 된 일회용 플라스틱 주사기를 사용하여 0.4 몰 상단 셀레늄 용액 7.5 밀리리터를 제거합니다. 온도가 섭씨 310도로 평형을 이루면 온도 조절기를 섭씨 0도로 설정하고 상단 셀레늄 용액을 카드뮴 용액에 직접 신속하게 주입합니다.

용액은 무색에서 노란색, 주황색으로 변하고 온도는 빠르게 떨어지고 다시 약 섭씨 280도까지 증가합니다. 이 절차에서 가장 어려운 단계는 가능한 한 빨리 주사기의 전체 부피를 카드뮴 용액에 주입하는 것입니다. 이것은 입자가 균일하게 핵을 형성하도록 합니다.

반응 1분 후 가열 맨틀에서 플라스크를 제거하고 온도가 섭씨 200도 미만이 될 때까지 공기 흐름으로 빠르게 냉각합니다. 온도가 약 섭씨 40도에 도달하면 30ml의 헥산으로 희석하면 나머지 카드뮴 전구체의 대부분이 용액에서 침전됩니다. 원심분리로 이 침전물을 제거합니다.

6개의 50밀리리터 폴리프로필렌 원뿔형 원심분리기 튜브 각각에서 12밀리리터의 원유 나노 크리스탈 용액을 희석합니다. 동일한 매개 변수로 원심 분리 후 40 밀리리터의 아세톤으로 상층액을 조심스럽게 디캔팅하고 폐기하십시오. 다음으로, 나노 크리스탈 펠릿을 헥산에 용해시킵니다.

상상(top phase)을 유지하는 동일한 부피의 메탄올로 용액을 추출합니다. 세 번째 추출에 대해 이 추출을 두 번 더 반복합니다. 메탄올의 부피는 대략 15 밀리리터로 조절되어 대략 200 마이크로몰에서 순수한 카드뮴 셀레나이드 양자 점의 농축된 헥산 용액을 얻을 수 있습니다.

이 반응의 일반적인 수율은 2 개의 3 나노 미터의 직경을 가진 3 개의 마이크로 몰 카드뮴 셀레나이드 결정이 서면 절차에 설명 된대로 자외선 가시 흡수 스펙트럼을 측정하여 나노 크리스탈 직경 및 농도를 결정하고, 나노 결정은 수은과 적색 편이, 흡수 및 형광 방출로 부분적으로 교환 될 수 있습니다. 이를 위해 20ml 유리 바이알에 헥산과 클로로포름을 섞은 교반 막대를 넣은 다음 카드뮴 셀레나이드 양자 점 용액 OLA와 수은 옥탄 바이올레이트를 추가합니다. 나노 결정을 정제하고 서면 절차에 설명된 대로 농도를 결정한 후 나노 결정을 껍질 성장을 위해 실온에서 최소 24시간 동안 노화시킵니다.

50 밀리리터의 0.1 몰 쉘 전구체 용액, 카드뮴 전구체, 아연 전구체, 황 전구체의 진공 가열 용액 3 개 목 플라스크를 1 시간 동안 환류시켜 맑은 용액을 생성 한 다음 아르곤으로 3 개의 목이 달린 플라스크에 충전합니다. topo ODE와 준비된 수은 카드뮴 셀레나이드 양자 점을 추가합니다. 측면 라인을 사용하여 실온에서 헥신을 배출합니다.

온도를 섭씨 100도로 높이고 15분 동안 환류합니다. 라인 밸브를 아르곤 가스로 변경하고 나노 크리스탈 용액에 열전대를 삽입합니다. 온도를 섭씨 120도까지 올린 후 0.5 단층 또는 140 마이크로리터의 황 전구체 용액을 첨가하고 15분 동안 반응을 진행시킵니다.

온도를 섭씨 140도까지 높입니다. 0.5 단층 또는 140 마이크로리터의 카드뮴 전구체 용액을 첨가하고 15분 동안 반응을 진행시킵니다. 그런 다음 반응 용액에 500 마이크로 리터의 무수 OLA를 첨가하십시오.

섭씨 160도를 추가하고 0.5 단층 또는 220 마이크로 리터의 황 전구체 용액을 추가 한 다음 섭씨 170도에서 각 첨가 사이에 15 분으로 동일한 양의 아연 전구체 용액을 추가합니다. 그런 다음 섭씨 180도에서 0.25 단층 또는 150 마이크로 리터의 황 전구체 용액과 아연 전구체 용액을 15 분 간격으로 첨가합니다. 시원하다. 실온에 대한 해결책과 이러한 입자에 대한 새로운 흡광 계수.

UV vis 스펙트럼을 사용하여 나노 결정의 수가 변하지 않았다고 가정하고 반응 용액을 조잡한 혼합물로 냉동고에 보관합니다. 이 단계에서 나노 결정은 전자 현미경, UV vis 흡수 분광법 및 형광 분광법을 사용하여 특성화 될 수 있습니다. 정제된 코어 쉘 퀀텀 닷을 50ml 3넥 플라스크에 넣고 고진공 상태에서 헥신을 제거합니다.

건조 필름을 만들려면 플라스크에 아르곤을 채우십시오. 나노 입자 필름에 무수 퓨린을 첨가하고 슬러리를 1-2 시간 동안 섭씨 80도까지 가열합니다. 나노 입자가 완전히 용해됩니다.

용액에 1 밀리리터의 FIO 글리세롤을 넣고 섭씨 80도에서 2 시간 동안 저어줍니다. 용액을 실온으로 냉각시킨 후 0.5ml의 트리에틸아민을 첨가하여 티오 글리세롤을 양성자화시키고 30분 동안 저어줍니다. 이 용매 혼합물에서 극성 나노 결정의 용해도가 좋지 않기 때문에 트리에틸아민을 첨가한 후 용액이 흐려질 수 있습니다.

양자점 용액을 20ml의 헥산과 20ml의 아세톤이 혼합된 50ml 원추형 원심분리 튜브로 옮기고 잘 섞습니다. 원심분리를 통해 침전된 나노 결정을 분리한 후 아세톤으로 펠릿 세척을 하고, 양자점 펠릿을 5ml의 DMSO에 용해시키고 수조 초음파 처리로 원심분리를 수행합니다. 가능한 응집체를 제거하려면 UV V 흡수 스펙트럼에서 나노 입자 농도를 측정하십시오.

순수한 양자 점의 용액은 표면이 공기 중의 주변 조건에서 천천히 산화될 수 있으므로 3시간 이내에 사용해야 합니다. 양자점 용액을 DMSO로 10마이크로몰 이하로 희석하고 50ml 플라스크로 옮깁니다. 준비된 DMSO에 팽창된 폴리아크릴산의 밀리리터당 5밀리그램 용액을 양자점 용액에 적가하면서 용액을 5분 동안 실온에서 교반하고 탈기합니다.

양자점 폴리머 용액을 아르곤으로 퍼지하고 섭씨 80도까지 90분 동안 가열합니다. 용액을 실온으로 냉각시킨 후 pH 8을 적가하고 10 분 동안 약동하는 50 밀리 몰 나트륨의 동일한 부피를 첨가하십시오. 서면 절차에 설명된 대로 양자점을 정제하고 4밀리리터 유리 바이알에서 UV vis 흡수 스펙트럼의 농도를 측정하고, 교반 막대가 있는 붕산염 완충액에 1몰 양자점을 40, 000배 이상의 750 Dalton 모노 아미노 폴리에틸렌 글리콜과 혼합합니다.

지침은 나노 결정에 특정 화학적 기능을 추가하는 방법에 대한 서면 절차에서 찾을 수 있습니다. 빨리 양자 점 해결책에 활성화 대리인 해결책의 새로 준비된 해결책의 25, 000배 어금니 과잉을 추가하고 30 분 동안 실내 온도를 약동하십시오. 이 단계를 4회 더 반복하여 나노 크리스탈 표면을 PEG로 포화시킵니다.

마지막으로, 투석 원심 필터 또는 초원심 분리를 사용하여 나노 결정을 정제하기 전에 반응을 담금질하기 위해 200 마이크로 리터의 1 몰 트리스 버퍼를 첨가하고, 생성 된 나노 크리스탈은 액체 크로마토 그래피, 겔 전기 영동 및 형광 현미경을 사용하여 단일 분산성, 유체 역학적 크기 및 표면 전하에 대해 분석 할 수 있습니다. 여기에 도시된 것은 카드뮴 셀레나이드 나노 결정, 수은, 카드뮴, 셀레나이드, 카디온 교환 후 나노 결정, 그리고 쉘 성장 후 코어 수은 카드뮴 셀레나이드, 쉘 카드뮴, 황화아연 나노 결정에 대한 대표적인 흡수 및 형광 스펙트럼입니다. 코어 카드뮴 셀레나이드 나노 결정은 15%에 가까운 형광 양자 수율을 갖지만 이 효율은 수은 교환 후 1% 미만으로 떨어지는데, 이는 표면 원자 파괴를 통해 도입된 전하 캐리어 트랩 때문일 수 있습니다.

카드뮴 황화아연의 얇은 껍질이 성장하면 이 효율이 70% 이상으로 증가하며, 이는 물로 전달된 후에도 대부분 유지됩니다. 대조적으로, 수은이 통합되지 않은 코어 카드뮴 셀레나이드, 쉘 카드뮴, 황화아연 나노 결정은 두꺼운 쉘이 성장하지 않는 한 물에서 양자 수율의 상당 부분을 잃습니다. 카드뮴 황화아연으로 캡핑하면 전자 전하 운반체가 쉘 물질로 누출되어 스펙트럼이 빨간색으로 이동한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

이러한 변화는 코어 카드뮴 코어의 경우 약 20-30나노미터이며 코어의 수은 함량이 증가함에 따라 증가합니다. 따라서 수은을 코어 나노 결정에 통합함으로써 나노 크리스탈의 작은 크기를 밝기를 희생하지 않고 유지할 수 있습니다. 이 작은 크기는 코어 수은, 카드뮴, 셀레나이드, 쉘 카드뮴, 황화아연 나노 결정의 투과 전자 현미경 및 입자 크기 분포에서 입증되며, 평균 직경은 3.2 ± 0.6 나노 미터입니다.

물로의 2단계 상 전달을 사용하는 것은 클러스터를 제거하고 크기 배제를 응집하기 위해 추가 크기 분류가 필요하지 않은 균일한 나노 결정 집단을 얻는 데 중요합니다. 여기에 묘사된 크로마토그램은 크기가 콘 알부민의 크기와 유사하다는 것을 확인합니다. 75 킬로달톤에서 750 달톤 아미노 PEG로 변형한 후 크기가 IgG 항체와 유사한 12나노미터로 증가합니다.

PEG 변형은 여기에 묘사된 aros gel 전기영동 실험에서 확인된 바와 같이 표면 전하를 중화하며, 웰은 화살표로 표시되며, 전극 극성은 오른쪽에 표시되어 접합 전에 나노 결정이 온 입자로 이동하고 pegylated 나노 결정이 정전기 중성임을 보여줍니다. 여기에 표시된 것은 유리 커버 슬립에 증착되고 545 나노 미터 가시 광선으로 여기되는 이러한 나노 결정의 에피 형광 현미경 사진입니다. 이러한 나노 결정은 전자 증식 CCD 카메라를 사용하여 초당 30프레임의 단일 분자 수준에서 쉽게 관찰할 수 있습니다.

이 플롯은 각 프레임에서 관찰되는 형광 입자의 수가 연속 여기(excitation)에 따라 시간이 지남에 따라 변동한다는 것을 보여줍니다. 이것은 깜박임과 사진 품질 저하의 조합 때문입니다. 처음 7분 동안은 눈을 깜박이는 것이 우세한 후 산화적 광의 열화가 서서히 명백해집니다.

이 동영상을 시청한 후에는 양자점을 화학적으로 합성하는 방법, 양자 점을 수성 완충액으로 전달하는 방법, 바이오이미징 응용 분야를 위해 양자점을 수정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 카듐과 수은을 함유한 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 개인 노출을 방지하기 위해 추가 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.