하나 나노 미터의 정확도와 형광 이미징 (피오나)

이 절차의 전반적인 목표는 1나노미터 정확도 또는 Fiona 실험으로 형광 이미징을 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 필요한 장비를 설정하고 전반사, 형광, 현미경 또는 잔디를 위해 광학 장치를 정렬하여 수행됩니다. 다음 단계는 시료 챔버의 내부 표면에서 CY 3D NA를 고정시키고 CY 3D NA 단일 분자를 나노미터 정밀도로 국소화하는 것입니다.

그 후, Fiona는 양자점으로 표지된 단일 절단된 미오신 5 모터의 움직임을 연구하는 데 적용됩니다. 궁극적으로 미오신 (myosin)이 걸어 갈 때 Acton의 스텝 크기는 Fiona 분석에 의해 36 나노 미터로 측정되었습니다. 이 방법은 분자 모터에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 세포막의 수용체 추적과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 실험 세부 사항을 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 설정하는 동안 항상 레이저 보안경을 착용하는 것이 중요합니다. 내부 전반사, 형광, 현미경 또는 잔디용.

시작하려면 모든 광학 구성 요소의 높이를 현미경 중앙 높이, 후면 포트, 레이저, 레이저 셔터 및 ND 필터를 장착합니다. ND 필터를 사용하여 빔을 가시적으로 유지하면서 레이저 출력을 가능한 한 낮게 감쇠합니다. 적절한 육각 키로 나사를 조입니다.

파란색 점선으로 표시된 대로 빔 경로를 계획합니다. 이 회로도에서는 광학 테이블에 테이프 또는 마커로 빔 경로를 표시합니다. 미러 M1을 첫 번째 직각 회전에 배치하고 계획된 빔 경로의 두 번째 직선 단면을 따라 두 개의 아이리스를 배치합니다.

레이저가 홍채 장소 거울 M 2를 통과하도록 M1의 위치와 기울기를 모두 조정합니다. 두 번째 직각 회전에서 10 x 빔 확장기를 경로의 세 번째 직선 섹션을 따라 배치합니다. beam expander가 광학 테이블과 계획된 빔 경로 모두에 평행이 되도록 기울기를 조정합니다.

다음 단계는 레이저가 빔 익스팬더의 L 1과 L 2인 두 렌즈의 중심을 직선으로 통과하도록 M1과 M 2를 반복적으로 조정하는 것입니다. 흰 종이를 사용하여 빔 확장기 뒤의 빔을 차단하여 빔 프로파일을 눈으로 확인합니다. 확장된 빔의 빔 프로파일이 ED가 될 때까지 조정합니다.

가우시안은 빔이 대조 셔터가 되도록 L 1과 L 2 사이의 거리를 조정합니다. 레이저는 현미경 대물렌즈의 나사를 풀고 형광 정렬을 나사로 고정합니다. 타겟 플레이스 미러 M 3 및 M 4는 확장된 빔을 현미경 포트와 다이크로익 미러로 향하게 합니다.

포탑 내부. M 3을 조정하여 빔의 가장 밝은 부분을 형광 타겟의 중앙에 배치하고 M 4를 조정하여 빔이 수직으로 기울어지도록 하고 레이저를 셔터링한 다음 대물렌즈를 다시 나사로 고정합니다. 벌금. M 3 및 M four의 기울기를 조정하여 대물렌즈에서 레이저 출력과 빔 프로파일을 최적화합니다.

E-M-C-C-D 카메라를 현미경에 장착하고 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 카메라용 소프트웨어를 시작합니다. 형광 샘플을 장착합니다.amp현미경에

카메라의 밝은 형광 반점을 보십시오. 초점이 변경되어 화면에서 스폿이 이동하지 않는지 확인하십시오. TIR 렌즈를 XY, Z 평행 이동에 놓습니다.tage 초점 거리와 동일한 대물렌즈의 후면 초점면, 약 30cm인 L 3에서 거리를 둡니다.

레이저가 렌즈 중앙을 통과하도록 L 3의 위치를 조정합니다. 빔 경로를 따라 L 3을 이동하여 빔 콜레이션을 조정합니다. 빔이 여전히 모니터 중앙에 있고 모양이 대칭인지 확인하십시오.

L 3을 빔 경로에 수직으로 변환하여 빔을 대물렌즈 밖으로 기울입니다. Fiona를 수행하기 전에 TIR이 달성되도록 TIR 렌즈를 계속 번역하십시오. CY 3D NA의 국소화 및 동원에 대한 실험. 단일 분자는 프로토콜 텍스트에 자세히 설명된 대로 샘플 챔버를 구성합니다.

양면 테이프의 두 스트립이 긴 가장자리를 따라 슬라이드에 적용되어 중앙에 3-5mm의 간격을 남겨두고 청소 된 커버 슬립을 챔버의 슬라이드 측면 뷰 상단에 놓고 오른쪽과 전면에서 보여줍니다. 챔버의 열린 끝은 열린 상태로 유지되며 샘플 챔버의 내부 표면에서 SI 3D NA를 고정시키는 입구 및 출구 역할을합니다. 10마이크로리터의 BSA 비오틴을 챔버에 피펫팅합니다.

5분 동안 기다립니다. 40마이크로리터의 T 50 BSA를 챔버에 피펫팅하여 시료 챔버를 세척합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 중성자를 챔버에 피펫으로 넣고 5분 동안 배양합니다.

40마이크로리터의 T 50 BSA 피펫, 20마이크로리터의 SI 3D NA로 챔버를 다시 세척하고 5분 동안 배양합니다. 마지막으로 80 마이크로 리터의 T 50 BSA로 챔버를 세척합니다. 이미징 절차를 시작하려면 잔디 M 피펫 아래에서 SI 3D NA 단일 분자를 샘플 챔버에 30마이크로리터의 이미징 버퍼를 넣고 8-10분 동안 기다립니다.

녹색 레이저, 100X 오일 이멀젼 대물렌즈 및 E-M-C-C-D 카메라가 장착된 잔디 현미경에 이미징을 위해 샘플을 장착합니다. 노출 시간과 EM 게인을 설정합니다. 1000 프레임에 대한 샘플의 동영상을 획득합니다.

Fiona 분석을 위해 Fiona Pro를 컴파일하고 실행합니다. 이 IDL 프로그램을 사용하여 획득한 이미지를 가져와서 유효 픽셀 크기와 강도에서 광자 수로의 변환 계수를 입력하고 Fiona 분석을 위한 스폿을 선택합니다. 마지막에는 2D 가우스 함수와 총 광자 수 및 국소화 정밀 컴파일 및 pH count pro를 실행한 피팅 결과를 출력합니다.

광자 수를 특성화하려면 이 DL 프로그램을 사용하여 식물군이 방출하는 평균 광자 수를 측정합니다. 광표백 전 4회, 획득한 이미지를 가져오고 강도에서 광자 수로의 변환 계수를 입력합니다. 이 프로그램은 형광 반점을 감지하고, 프레임 번호의 함수로 광자 수를 자동으로 계산하고, 광자 수의 흔적을 출력합니다.

이 실험을 위해 DD H2O 중 밀리리터당 1밀리그램의 비오틴화된 BSA 20마이크로리터를 샘플 챔버에 피펫팅하여 샘플을 준비합니다. 10분 동안 배양합니다. 30 마이크로 리터의 D ddh, 2 개의 O 피펫으로 중성 트라베인 0.5 밀리그램 당 헹구고 2 분 동안 배양합니다.

30 마이크로 리터의 M 5 PSA로 챔버를 세척하십시오. 이 실험을 위한 액톤은 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 전날에 준비해야 합니다. 제조된 f 액틴을 일반적으로 25회 희석하고, 액틴 완충액을 밀리리터당 약 0.004밀리그램의 최종 농도로 한다.

액틴 용액을 챔버에 피펫으로 넣고 10분 동안 기다립니다. 챔버를 30 마이크로 리터의 완충액으로 헹구고, 미오신 5 A를 30 씩 헹굽니다. M 5 버퍼를 최종 농도인 250나노 어금니로 접습니다.

1 마이크로 리터의 희석 된 myosin과 1 마이크로 리터의 Anti-Flag Q.Do 7 0 5를 혼합합니다. 8마이크로리터의 M 5를 추가하여 10마이크로리터로 채우고 위아래로 피펫하여 혼합합니다. 얼음 위에서 10분 동안 잘 배양합니다.

미오신 Q 도트가 포함된 20마이크로리터의 이미징 버퍼를 시료 챔버에 피펫팅합니다. 8-10분 동안 배양합니다. 잔디 현미경에서 30밀리초의 노출로 샘플을 이미지

최소 1000개의 프레임을 획득하여 데이터 분석을 시작합니다. 이미지 J에서 비디오 파일을 열고 움직이는 지점 주위에서 비디오를 자릅니다. 비디오를 통해 지점을 추적하여 비디오의 각 프레임에 Fiona 분석을 적용하여 시간 경과에 따른 X 및 Y 좌표를 픽셀 단위로 생성합니다.

프로토콜 텍스트에 설명된 대로 픽셀을 나노미터로 변환합니다. 초기 위치로부터의 변위를 시간 함수로 계산합니다. 변위에 대해 T-test를 실행하여 미오신 보행 단계를 구합니다.

단계 크기 열에서 모든 0 값을 삭제합니다. 원점 또는 matlab을 사용하여 스텝 크기의 분포를 플로팅합니다. 가우스를 히스토그램에 맞춥니다.

이 일반적인 표면 이미지에서 SI 3D NA를 고정합니다. 노란색 화살표는 점 확산 함수 또는 PSF가 여기에 표시된 단일 SI 3D NA 분자를 가리킵니다. PSF에는 2차원 가우스 함수가 피팅되어 있으며, 피팅 잔차도 표시되어 있습니다. 이 플롯은 프레임 수 대비 광자 수의 일반적인 추적이며, 지수 피팅은 단일 미오신 신호 대 잡음비가 양호한 비디오 파일인 미오신 단계 크기를 측정하기 위해 약 1.4 곱하기 10에서 6까지의 평균 광자 수를 제공합니다.

걸어가면서 액틴 필라멘트가 포착됩니다. 세 개의 예제 프레임이 표시됩니다. 각 프레임에 Fiona를 적용하면 빨간색으로 표시된 거리 대 시간 추적이 생성됩니다.

T-test를 기반으로 하는 단계 찾기 알고리즘을 사용하여 개별 단계를 추출하고 출력은 흰색으로 오버레이되며 단계 크기는 흰색으로 표시되고 나노미터는 흰색으로 표시됩니다. 여러 트레이스의 단계가 히스토그램에 결합될 때 측정된 단계 크기는 약 35.8 플러스 또는 마이너스 0.4 나노미터 분포입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 잔디 현미경 설정을 포함하여 Fiona 실험을 수행하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 이러한 절차를 통해 바닥 힘 사용 및 실험에 대한 광 손상을 최소화하는 것이 중요합니다.

잔디 현미경 검사와 Fiona로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 보안경과 같은 예방 조치를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.