Name: 평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min
Description: 학습하세요 단일 분자 형광 현미경을 이용한 평면 지지 이중층 지질막의 제조 및 특성 분석 방법을. 이 기술은 막 단백질 역학 연구와 고해상도 이미징에 필수적인 플랫폼을 제공합니다.

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석사 재정 및 행정 지원을위한 오스트리아 과학 기금 (FWF, J3086-B11) 및 감사의 슈뢰딩거의 교제 막스 플랑크 협회에 의해 지원되었다. GS는 비엔나 과학 기술 기금 (WWTF, LS13-030)에 의해 지원되었다. JH 비엔나 과학 기술 기금 (WWTF, LS14-031)에 의해 지원되었다.

1. 생성 및 평면 SLB 수의 기능화 <ol><li> 지질의 혼합 <ol><li> 10 %의 Ni-NTA DGS / 90 % POPC 지질 조성에 도달하도록하는 250 mL의 둥근 바닥 플라스크에 클로로포름 POPC와 6.9 mg의 DGS의 Ni-NTA 45 mg을 용해. 다음 단계에서 클로로포름을 증발시켜 낮은 (단지 몇 ㎖)의 부피를 유지한다. 1 % DGS NTA - 니켈 / 99 % POPC 지질 조성물 49.5 mg을 POPC 및 0.69 mg의 DGS NTA - 니켈을 사용합니다. </li><li> 천천히 회전 증발기를 사용하여 클로로포름을 제거 - 주위 온도 이상 증가하는 것은 필요하지 않다. 대안 적으로, 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 기체의 스트림으로 화학 후드 안쪽을 날려. 이러는 동안 끊임없이 둥근 바닥 플라스크의 하반부에 건조 된 지질의 동등한 증착을 허용하도록 회전 플라스크. </li><li> 클로로포름의 대부분이 증발되면, 정량적으로 클로로포름을 제거하는 O / N 진공 플라스크를 연결합니다. 참고 :이 단계는 오염을 방지하는 것이 중요합니다나중 단계에서 독성 클로로포름으로 단백질과 세포의 지질 이중층 유동성을 보장합니다. </li></ol></li><li> 건조 지질에서 작은 단일 층 소포 (SUV의)의 생성 주 : 소형 단일 층 소포 (SUV 차량)는 직경이 20 nm 내지 100 nm의 사이에 용이하게 목욕 초음파에 의해 제조 할 수있다. 지질 압출, 대안적인 방법은, 압출 성형에 적용하는 필터의 세공 크기에 따라 SUV 차량을 야기 할 수 있으며, 또한 큰 단일 층 소포 (LUVs), 크기가 100 내지 1,000 nm의 어느. 그러나, 포드 SUV는 SLB 수 형성에 가장 적합하다. <ol><li> 목욕을 통해 초음파 SUV 차량 (비디오에 도시) : <ol><li> Degass PBS. 10 ㎖ 둥근 바닥 플라스크를 PBS 탈기 250ml를 건조 지질 혼합물을 중지. </li><li> , 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 가스로 채워 플라스크 마개를 닫은 후, 오토 클레이브 테이프 플라스크를 밀봉. </li><li> 목욕 초음파기로 밀봉 된 플라스크를 놓고 지질 현탁액을 초음파 처리T (120) 170 W로는 일반 설정 될 때까지. 이 30 사이에 60 분 소요됩니다. </li><li> 소포 형성 분광 광도 측정의 진행 상황을 모니터 : PBS에 비해 희석 유제의 흡수 (지질 농도에 대한 대략적인 지표로서) 234 nm에서 일정하게 유지하면서도 인해 비아 감소 빛 산란 (550 nm에서 현저히 떨어질 것을 찾다 큰 입자). </li><li> 연속 SLB의 형성을 방해 무거운 아닌 단일 층 소포를, 펠릿, 288,000 XG, 4 ℃에서 8 시간 동안 물을 25 ℃에서 1 시간 동안 150,000 XG에서 원심 분리에 의해 소포 현탁액을 펠릿. </li><li> 0.2 ㎛의 공경 주사기 필터를 통해 상청액을 필터. </li><li> 소포 제제의 명확성과 지질 좌측의 양을 모니터링하는 234 nm 내지 550 nm에서의 OD를 측정한다. </li><li> 아르곤 또는 질소 하에서 4 ° C에서 소포를 저장합니다. 선택적으로, 이중층 소포 제조 현탁액을 사용몇 개월. </li></ol></li><li> 지질 압출을 통해 포드 SUV : <ol><li> 요컨대, 0.1 ㎛의 세공 크기를 갖는 필터를 통해 지질 현탁액을 여러 번 통과한다. 에 관계없이 제조 방법의 두 번 소포 현탁액을 원심 분리 (1H, 150,000g, 25 ° C, 다음 8 시간, 4 ℃, 288,000g)을 무거워 아닌 단일 층 소포를 펠렛. 주 : 불활성 가스 하에서 4 ℃에서 저장 될 때, 소포는 수개월 이중층 제조에 사용될 수있다. </li></ol></li></ol></li><li> SLB의 형성과 단백질 충전 <ol><li> 30 분 동안 진한 황산 1 혼합물 30 % 과산화수소 : 3 24 X 50mm # 1.5 유리 슬라이드를 치료. 참고 : 비디오에서와 같이 혼합물의 적극적인 성격으로 인해 것은 특별한주의를 기울여야, 즉 실험실 코트와 안전 고글을 착용! </li><li> 물총 병에서 DDH 2 O의 스트림에서 유리 슬라이드를 씻어. 테프론 스탠드에 배치하고 건조하게10 ~ 30 분. </li><li> 8 또는 16 잘 챔버의 바닥 유리 슬라이드를 제거 에폭시 접착제로 바닥을 채우고 조심스럽게 접착제 덮인 실 바닥에 깨끗하고 건조한 유리 슬라이드를 놓습니다. 약 10 분 동안 경화 접착제를 보자. 바닥에서 여분의 접착제를 제거합니다. 주 : 유리 슬라이드와 챔버 사이의 기밀 밀봉은 또한 용이하게는 10 내지 30 분 이내에 경화 치과 이성 실리콘 모델링 페이스트의 사용에 의해 달성 될 수있다. 이 도장은 에폭시 접착제로 회사가 아니라 규칙적인 신체 부담을 견딜 수 있습니다. 실험 후 용이 미래 실험 후 재사용 챔버로부터 제거 될 수있다. </li><li> 8 (16)의 각 웰에 10 배 희석 PBS 지질 현탁액 120 μL 피펫 (60μl) - 20 분 동안하자 이중층 형태 (상기 기술 된 바와 같이 제조) 웰 챔버. 조심스럽게 15 ml의 PBS로 두 번 이중층을 씻어. 이중층이 형성되면, 그것은 항상 버퍼에 빠져들해야하며 공기에 노출되지 않습니다. </리&gt; <li> 330μl (8 웰 챔버) 또는 165μl (16 웰 챔버) 이륙 후, PBS로 각 웰 모든 방법을 채 웁니다. 잘 남아 350μl (175μl)가있다. 각 웰 (400 또는 200 μL 최종)에 PBS에 희석 그의 - 태그 단백질을 포함하는 칵테일의 50μl를 (25μL)을 추가하고 어둠 속에서 60 분 동안 실온에서 품어. 표면 단백질 농도는이 배양 단계 동안 단백질 농도를 변화시킴으로써 조절 될 수있다. </li><li> 15 ml의 PBS로 각 웰에 두 번을 씻어. 참고 : 일반적으로, SLB 수는 단백질과 충전 후 더 이상 6 시간 이상의 실험에 사용 될 수 없습니다. 이 기간 동안, 광표백 후 형광 복구는 95 %까지 유지하고 이중층 회합 단백질의 손실은 검출 될 수 없다. 단백질 밀도는 (아래 참조) 실험 이전에 결정되어야한다. </li><li> 옵션 단계 : SLB를 포함하는 단백질 DGS NTA - 니켈의 비 특이 적 결합을 테스트하기 위해, PBS 300 mM의 이미 다졸을 함유 한 번 SLB을 씻는다. 프로TEIN은 완전히 벗겨한다. </li></ol></li></ol> 2. 현미경 설정 <ol><li> 하나의 형광 색소의 형광을 검출 할 수있는 현미경 시스템을 구축하기위한 도입에 명시된 권고 사항을 참조하십시오. </li></ol> 3. 전력 측정 주 : 형광 발색단을 쉽게 초과 여기 광으로 포화 될 수있다. 이 방출에 더 이상의 이득 photobleaching에 가속화하고, 따라서 피해야한다. 여기 전력 밀도는 시료에서 직접적으로 측정되어야 샘플 조명을 최적화하기. 이러한 측정은 또한 미래의 실험에 대한 기준 역할을 할 수 있습니다. 광 이미징 시스템에서 손실된다 평가할 때 또한, 입력 및 출력 레이저 파워 사이의 비율을 아는 것은 유용하다. <ol><li> 이 90 ° 각도에서 대물 잎되도록 직립 위치로 여기 빔을 이동. </li><li> 상단 O의 전원 미터의 머리를 배치빔 F와 빔 (= P)의 힘을 측정한다. 결과를 문서화하십시오. </li><li> 잠망경을 사용하여 TIRF 위치와 이미지 그대로 균일 한 형광 이중층으로 빔을 켭니다. 감광 (ND)이 여기 광 경로로 2 내지 3의 광학 밀도 (OD)가 필터링 표백 및 CCD 신호의 포화를 피하기 위해 장소. <ol><li> 전체 조명 분야의 통합 계수 (= 나는 총)을 측정한다. 또한, 조명 영역 (= 총)의 크기를 측정한다. 통합 카운트를 측정 (= I 센터) 극대 조명 스폿의 중심뿐만 아니라 스폿의 크기는 (A 센터 =). </li></ol></li><li> 화소 당 배경 신호를 측정 (= B) 중 하나 또는 외부 조명 영역 샘플 조명없이. </li><li> 3. 측정 결과)로부터의 배경 신호를 뺀다. 배경으로 질문 (전체 조명 영역 또는 중앙 지점)의 영역의 픽셀 수를 곱하여이 작업을 수행픽셀 당 계산합니다. (- 총 .B을 나는 센터 - = 나는 총 센터 .B을). </li><li> 나누는 집적 및 배경 조명의 전체 필드의 통합 및 배경 보정 된 신호에 의해 중심 스폿의 신호를 보정. 참고 : 결과는 중앙 지점 (= (I 센터 - 센터 .B) / (내가 총 - 총 .B))에 위치한 총 전력의 비율을 나타냅니다. 빛이 중심 자리를 조명의 힘 2) 결과에서 측정 된 전력 P와이 결과의 곱셈. </li><li> 그 자리 μm²에서 센터의 크기를 결정합니다. 이 목적의 배율에 의해 μm의 카메라 화소 크기를 분할 들어, 픽셀 당 μm² 같은 결과의 제곱을 취. <ol><li> 대안 현미경에 배치 마이크로 슬라이드의 사용과 이미지 내의 픽셀 크기를 측정하고, 화소 당 면적으로서 결과의 제곱을 취. 배수iply 중앙 지점에 위치한 픽셀의 수에 의해이 값은 조명 스팟 지역에 도착합니다. </li></ol></li><li> 당 2 μm의 조명 세기를 계산하도록 μm², 중앙 센터의 스폿 크기가 중앙 지점을 조명 전력 P 나눈다. 예는 그림 6에 제시되어있다. </li><li> 비 TIRF 조명에서 측정 된 전력 밀도 값은 또한, 레이저 광이 전반사되는 정확한 각도에 의존하는 TIRF 조명 (13)에 존재하는 것과, 일반적으로보다 낮다. TIRF 조명 아래 현재 전력 밀도에 도달하기 위해, 이미지가 아닌 TIRF와 TIRF 모두 0.1 ㎛ 직경의 형광 구슬을 조정. TIRF 비 TIRF 모드로 측정 한 비드의 형광 강도의 비는 TIRF 조명 (수학 식 1)에 그 효과 하에서 측정 된 전력 밀도 값의 변환을 허용하는 변환 계수 C에 달한다. 전력 밀도 </eM&gt; TIRF = C • 전력 밀도 비 TIRF (식 1) C와 = 비드 강도 T IRF / 비드 강도 비 TIRF </li></ol> 4. 밀도 측정 <ol><li> 이중층에있는 각각의 형광체의 평균 신호를 결정합니다. 형광 펩타이드로드 이중층 부착 MHC 분자는 단백질 이후 이러한 목적을 위해 이상적입니다 : 레이블 화학 양론이 정확히 하나입니다. 필요한 표백제는 모든 시야에서 이중층에 라벨과는 형광 하나의 형광을 시각화하기 위해 복구 할 수 있도록합니다. <ol><li> 빠른 연속 기록 이미지 (예 : 스트리밍 획득 프로토콜을 적용) 및 여러 프레임에 걸쳐 단일 분자에게 이동성을 모니터링 할 수 있습니다. 자세한 내용은 그림 7을 참조하십시오. </li></ol></li><lI&gt; 마크 투자 수익 (ROI)과 이중층 내 중앙 조명 자리. ROI를 측정 (형광 강도에 비례한다), 조명 전력 밀도의 편차는 15 %보다 적이어야한다. <ol><li> 만이 투자 수익 (ROI) 내에서 단일 분자 및 대량 형광을 결정합니다. 단일 이미 터의 점 확산 함수의 99 % 이상을 포착하기에 충분히 큰 ROI의 신호를 통합하고있다. 16 ~ 20 ㎛의 화소 크기를 가진 카메라를 이용하는 경우 100 배의 배율과 동일하거나 또는 1.45보다 큰 개구 수를 가지는 대물 렌즈가 7 픽셀 (7)의 영역을, (제조사의 카메라 사양에 명시) 광장의 중심에 위치하고 강도 피크. </li><li> 배경 신호를 확인하려면 형광 신호를 포함하지 않는 이웃 (7) (7)에 의해 픽셀의 사각형의 수를 통합 할 수 있습니다. 단일 분자 불소위한 보정 값을 결정하기 위해 단일 ​​분자 신호로부터 배경 빼기escence. 여전히 다음 프레임에서 볼 수 있습니다 만 신호를 선택합니다. </li></ol></li><li> 수백 번 단계를 반복 4.2 오십. 배경 보정 신호를 평균. 원하는 경우, 히스토그램으로 단일 분자 세기 값을 플롯. 선택적 : 오픈 소스 소프트웨어 패키지의 적절한 플러그인 (예 ImageJ에)을 활용 또는 상업적 소프트웨어 (예 MetaMorph로부터, 분자 장치)를 사용하여 데이터를 처리한다. 숙련 된 사용자는 matlab에 또는 유사한 소프트웨어 패키지에서 자신의 분석 프로그램을 작성할 수 있습니다. </li><li> 여기 경로에 2 이상의 감광 필터를 놓고 동일한 형광 물질로 표지 된 단백질을 포함하는 이중층의 형광 화상을 받아. 단일 분자 세기 측정에 사용 된 것과 동일한 ROI 내의 평균 픽셀 강도를 기록한다. 벌크 형광 측정의 노출 시간을 기록한다. 배경 공제에 대한 조명없이 같은 자리를 측정한다. </li><li> BI 내의 단백질 농도를 결정층 평방 미크론 당 픽셀 (예 41.5), (100)에 의해 (2 OD와 ND 필터를 채용 한 경우) 또는 1,000의 수 (만약에 의해 단계 4에서 결정된 배경 보정 벌크 형광 평균 픽셀 강도를 곱 ND (3)의 OD와 필터 사용되었다)과 노광 시간이 2 단계에 사용하고, 단계 3에서 결정된 평균 단일 분자 신호로 나누면, 노광 시간이 2 단계에서 사용되는 단백질 당 형광체의 수. </li></ol> 5. 시험 이중층의 무결성 <ol><li> 형광 이중층을 준비하고 전술 한 바와 같이 현미경 스테이지에 배치합니다. </li><li> 초점을 조절하고 TIRF 모드에서 이중층의 이미지를 촬영. 작은 디스크 모양의 투자 수익 (ROI) 내에서 형광을 브레이션 비 TIRF 모드에서 짧지 만 강렬한 표백제 펄스를 적용합니다. </li><li> 즉시 표백 후 낮은 강도 TIRF 모드 이중층의 이미지를 촬영 한 후 매 5 초 10까지 형광 회복 속도를 모니터링. </li><li> 모이중층의 다른 영역으로했습니다 단계 2와 3은 표백제 펄스 후 낮은 강도 TIRF 모드에서 5 분을 다른 이미지를 가지고 따릅니다. I는 표백제 영역에 표백제를 게시하고 다음 (IF) 부동 분획을 계산하도록 (더 표백이 발생하지 않은한다) 실험의 처음에 I 0 표백 이전 강도와 비교 강도를 판정 : 움직이지 분율 (%) = IF (I 0 - 나는 표백제를 게시) / (I 0 - 배경) × 100 배경 = 아니오 여기 광과 투자 수익 (ROI) 내에서 측정 된 강도 적용 IF는 10 % 이하 (이상적으로는 5 % 이하) 여야한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금융 관심이 없다는 것을 선언합니다.

단일 분자 현미경은 원시 세포 환경 내에서 단백질의 행동을 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. 분자 영상은 광범위한 과학계에 따라서 점점 더 매력적인되고, 아직 많은 생명 과학자는 여전히 멀리 기술과 전문 지식의 초기 투자 기피. 자신의 이미징 시스템의 조립으로 인한 주요 장점은 용이하게 사람의 특정 필요로 조절 될 수 있다는 것이다. 본 명세서에 제안 된 것과 같은 비 TIRF 여기 빔 쉽게 기존 TIRF 광로 이외에 구현 될 수 있고, 형광 물질과 리간드의 신속하고 정의 포토 블리치 (또는 -activation)가 필요한 경우, 예를 수행하는 FRAP 또는 리간드 uncaging 실험 14 . 방사 빔 스플리터의 도입은 적어도 2 개의 동시 녹화 및 형광 네 개 채널 일부 경우에 허용한다. 확장 기능의 목록은에 의해 제한 본질에자신의 상상력. 예를 들어, 배출 경로에 전동식 발광 필터 휠 구현은 최대 10 개의 서로 다른 형광 채널 간의 신속한 스위칭을 허용한다. 두 모터 발광 필터 휠 (18)을 조합 한 경우의 형광 채널을 판독 할 수 있고, 직렬로 (각 10 슬롯 필터 장착). TIRF 기반 이미징은 칼슘 이동 측정 및 제논 또는 수성 여기 램프 경로의 통합 후 간섭 반사 현미경 (IRM)로 보완 할 수있다. IRM은 세포가 유리 표면 또는 SLB 부착되고 TIRF 기반 이미징 데이터를 해석 할 때, 따라서 중요한 정보를 제공 할 수있는 정도를 시각화하는 선택 방법이다. 간단한 다이크로 익 미러를 사용하고 photoactivati​​on 현지화 현미경 (PALM) 또는 확률 적 광학 재구성 현미경 (STORM)를 도통 허용 내지 405의 추가 레이저, 즉 두 superresolut으로 넓어진 여기 빔을 수립가시 광선 (15, 16)의 회절 한계 이하의 위치 정밀도와 이온 방법. 그러나, 실험의 성공뿐만 아니라 해당 하드웨어의 문제이다. 잡음 감소 TIRF 기반 이미징을 충분히 활용하기 위해, 세포는 세포 표면 상에 제약을 부과 또는 그들의 세포막의 생리를 방해하지 않는 방식으로 표면에 접촉한다. SLB 수는 모든 SLB 매립 리간드 측 방향 이동과 결합하고 분리 역학 수용체에 응답하여 이중층 내에서 횡 방향 위치를 조정하기 때문에 세포 접착에 적합한 단백질은 이러한 목적에 적합 초과되는 작용 화. 재생 가능한 방식으로 SLB 수를 제조하기 위해서는 고순도의 SUV 차량으로 시작하는 것이 가장 좋습니다. 본원에 기재된 바와 같이, 이들 두 I로서 초 원심 분리 단계에서, 또한, 초음파 처리시에 발생되는 다중 층 소포를 제거하는 것이 중요높은 유동성을 갖춘 연속 SLB 수의 형성과 nterfere. 깨끗한 유리 표면에 고품질의 형태의 SLB 수. 한번 세정 된 유리 슬라이드를 즉시 사용 또는 진공에 저장되어야한다. 중요한 것은, SLB 수는 혼란으로 이어질 것이로 공기에 노출해서는 안됩니다. SLB 세척 이것이 저장할뿐만 아니라, 시간을 절약 할뿐만 아니라 절차로서, 버퍼 혈청 피펫을 사용하여 세정, 도시 된 바와 같이, 포함한다. SLB 상주 단백질 수확 및 정제 동안 세제의 사용은 피해야한다. 이는 세제 때에도 본 미량 크게 단백질의 이동성을 감소시킬 것이기 때문이다. 모두 함께 세제의 필요성을 회피하기 위해 분비되는 폴리 히스티딘 태그 장착 된 리간드의 수용성 발현은 포유 동물 또는 곤충 세포에 좋습니다. 대장균 봉입체로부터 폴딩 것이 필요한 경우주의 및 그 계량 대 폴딩 전에 봉입체로부터 효과적으로 세제를 제거하기 위해 적용되어야. 구체적으로는 세포 활성화 및 세포 유착에 대한 주어진 수용체 - 리간드 상호 작용의 역할을 절개 할 수 있도록 모듈화 및 reconstitutive 사이트, SLB 수로부터 결과를 이용하는 주요 장점. 이 점에있어서 그 DGS NTA-ni는 NI-NTA 결합 부위에 대해 경쟁하는 단백질을 방지하기 위해 SLB 내의 10 % 존재한다라고 언급하는 것은 중요하다. 1 % 2 % DGS NTA - 니켈, 주어진 폴리 히스티딘 - 태그 된 단백질 종의 협회의 감소를 은닉 SLB 수를 이용하는 경우 미발표 (특히 초 폴리 히스티딘 태그가 부착 된 단백질 종의 양을 증가 공동 배양하면 알 수있다 관찰). 10 % DGS NTA - 니켈을 갖춘 SLB 수로 작업 할 때 이러한 현상은 관찰되지 않는다. 우리가 DGS NTA - 니켈을 함유 SLB 수 테스트 폴리 히스티딘 태그가 어떤 단백질의 비특이적 결합이 관찰되지 못한 반면 처음 단백질을 도입 할 때,이 가능성을 테스트해야이를 위해 우리는 DGS NTA - 니켈 (단백질이 결합 안)없는 SLB 수의 사용을 권장합니다. DGS의 Ni-NTA를 함유 SLB를 사용하는 경우 둘째, 단백질은 PBS 300 mM의 이미 다졸을 함유하는 SLB 세척 후 완전히 이탈한다. SLB 수를 이용하는 또 다른 중요한 장점은 과도 상호 작용 및 신호 전달 사건이 향상된 시공간 해상도 17-19 모니터링 할 수 있다는 점이다. 입체 결합 공정은 본질적으로 특히 잡음 감쇄 TIRF 모드로 촬영을 할 때, 두 영상 사이즈로 축소되기 때문 적어도 일부이다. SLB 수의 사용은 단일 분자 신호 검출, 광 활성화 지역화 현미경 (PALM) 또는 확률 적 광학 재구성 ​​현미경 (STORM)의 전제 조건, 회절 한계 15,16 아래 해상도 즉 수퍼 해상도 현미경과 호환 가능하다. 이러한 특수 영상 방식은 단일 분자 포스터 공명 에너지 트라 가능nsfer 실험 시냅스 환경 (20)에서 개개의 단백질 - 단백질 상호 작용을 가시화하도록 설계. 이 방법은 &quot;측정 TCR-pMHC FRET 기반의 현미경 분석하여 결합&quot;(21)라고 조브 책에서 상당한 상세하게 설명한다. SLB 기반 실험을 해석 할 때 하나는 항상 살아있는 세포의 세포막의 모든 특성이 SLB 수에 의해 추천을 명심해야하며, 누락 된 특성의 일부는 조사중인 생리에 영향을 미칠 수있다. 결국, SLB-포함 된 단백질은 자유롭게 확산과 휴대 대응의 대부분은 5,6,22을 그대로 막 마이크로 도메인으로 구성되어 있지 않습니다. 어느 정도는 살아있는 세포의 세포막 구조를 보존 부착 세포로부터 유도 된 세포막 고정화 시트는 성공적 B 림프구 (23)에 의해 막 - 삽입에서 항원 흡수를 연구하기 위해 사용되었다. 그러나, 이러한멤브레인은 매우 역동적 인 세포 골격과 상호 작용하고 그들이 단단한 유리 표면에 의해 지원되는 어떠한 유연성을 특징으로하지 않습니다. 이러한 차이의 관점에서 조정 유연성의 표면 또는 로컬로 적용되는 광 펄스에 대한 응답으로 자신의 강성을 변경 표면에 의해 지원되는 정의 된 방식으로 단백질을 구획하는 수단을 제공하고 엔지니어링 SLB 수, 대한 요구가 분명히 존재한다.

행동의 자신의 모드는 종종 기존의 생화학 적 방법에 의해 감지하고 평가하기 어려운 선호도가 낮은 상호 작용에 의해 정의되기 때문에 막 단백질들은 세포 기능을 수행하는 메커니즘을 이해하는 것은 종종 어려운 작업이 될 수 있습니다. 막 단백질은 또한 고도로 원칙적 그들의 생물학적 활성 (7)을 변경할 수 특정 멤브레인 도메인 또는 5,6- 동적 고차 구조를 형성하고, 농축 될 수있다. 비 침습적 레이저를 이용한 단일 분자 형광 현미경은 이렇게 복잡한 세포 환경에서 단백질의 행동을 연구하는 선택의 방법이되고있다. 이러한 원리는 잡음 감소 전체 내부 반사 (TIRF) 모드에서 모니터링 될 수있다 이것은 특히 세포막에서 일어나는 생화학 적 과정 마찬가지이다. 여기에 샘플 조명 유리 SU 가까이에서 200 nm의 얇은 조각에 최대로 제한됩니다또한 형광 신호 강도 8,9 상당한 증가에 의한 소멸 여기 광의 특성, 셀룰러 백그라운드에서 상당한 손실을 초래하고 rface. 단일 분자 검출에 높은 위치 및 시간 해상도를 목표로 할 때 두 가지 측면이 중요하다. 평면 SLB 수는 TIRF 현미경과 호환되지 않습니다. 적절한 리간드와 함께 작용 화하면 그들은 또한 면역 세포 또는 다른 세포에서 발생하는 세포 - 세포 인식 분자 역학 연구에 직접 액세스를 제공한다. 그들은 또한 단순히 세포 매우 바람직하다 TIRF 조명에 이미징 될 수 있도록 유리 슬라이드에 충분히 가까이 운동성 달리 비 부착 세포를 위치 시키는데 이용 될 수있을 때 하나의 분자 추적 또는 단일 분자 기반 수퍼 해상력 관련된 도통 실험. 이를 위해 단백질은 고도로 이동 SLB에로드되어야한다. 사용 된 리튬의 고유의 장점<html> PID를 전혀 단백질에는 비특이적 결합이 없다고한다. 또한, SLB 수는 자체 치유 고유 용량 이차원 액체로서 간주 될 수있다; 유리 지지체 내의 요철을 어느 정도까지 보상된다. 단계별로 단계 프로토콜은 관심의 단백질과 충전이 높은 모바일 이중층을 생성하기 위해 제공된다. 평면 SLB 수의 형성은 주성분 (90~99%)과 합성 1- 팔미 토일 -2- 올레 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 (POPC)를 포함하는, 기재 및 지질을 1,2- dioleoyl-을 관능 -glycero SN-3 - {[N (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산] 숙시} 니켈 염 낮은 풍부 (1~10%)에서 (DGS NTA-NI). POPC 한 포화 지방산 모노 - 및 하나의 불포화 지방산을 수행하고 RT에서조차 높은 유동성의 지질 이중층을 형성한다. DGS NTA-NI는 폴리 히스티딘 꼬리에 그것의 헤드 그룹과 결합과 선택의 폴리 히스티딘 태그 단백질 (그림 1)에 대한 앵커 역할을합니다. &quot;&gt; 중요한 것은, 현미경 하드웨어가 제공하는 정보 및 광학 및 레이저 물리학 몇 가지 기본 지식을 바탕으로, 모든 생물은 하나의 분자 이미징 설정을 구축 할 수 있어야한다. 아래에 설명되어 주변의 수를 포함해야합니다. 샘플 여기 이상적으로해야한다 총 내부 반사 (TIRF) 모드에서 거꾸로 현미경에서 수행이 요법은이를 위해 특별 TIRF 지원 목적 (아래 참조). 가짜 가볍고 휴대 자동 형광 9 일부터, 그렇지 않으면 결과 과도한 배경을 줄이고 레이저 조명이 필요할 때. 일부 실험은 밀리 초 범위 내에서 조명 시간을 필요로하고 빠르게 연속적으로 동작한다. 조명 시간을 저장하거나 2 개 이상의 분광 채널들로 방출 된 광을 분할 종종 유용 반복적 조명으로 인한 불필요한 표백하지 않도록. 이것은 동시 판독을 허용 conduc 때 중요한 요소가 될 수있는 두 개 이상의 발광 프로파일의포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 포함 팅 실험. 여기서 하나의 여기 광 펄스에 의한 발광은 모두 FRET 도너로부터 기록 (감응 방출로) 수용체를 FRET 수있다. 카메라는 조명 시간 동안 하나의 형광을 시각화하기 위해 충분히 낮은 배경으로 충분한 광자를 포착해야한다. 컴퓨터 소프트웨어는 여기 종료 및 이미지 수집을 동기화하는 작업까지해야합니다. 포괄적 인 개요는 아래 그림 2에 제시되어있다 : TIRF 가능 목적 : 대물 기반 TIRF 조명용 대물의 개구 수 (NA)가 동일하거나 또는 표준 유리 슬라이드를 사용하여 1.4보다 커야한다 (N = 1.515) 9. 배율은 150 배에 60 배 사이의 범위 수 있습니다. 목적은 색채 다른 형광 이미징 때 confocality 수 있도록 수정해야합니다. 레이저 : 자료 LASE의 수R 옵션이 상당히 지난 년 동안 증가했다. 전자적으로 조절 가능한 현대 연속파 레이저 다이오드는 비용 효율적이고 전례 주파수 속도로 동작 될 수있다. 더 비싼 가스 이온 레이저는 레이저 빔 품질이 탁월하지만, 냉각 외부 셧 (아래 참조) 종종 광범위한 (물)이 필요합니다. 여기 셔터 : 음향 광학 변조기 (AOM)을 연속으로 빠르게 10 빠른 셧 할 수 있습니다. 꽉 기계적 셔터와 AOM의 조합을 종료하는 것이 좋습니다. 때문에 연속 빛 노출에 AOM의이 방법은 광범위한 가열 피할 및 오프 위치에서 AOM에서 새는 빛이 상쇄된다. 렌즈는 레이저 빔을 확대하고, 대물의 초점면에 그들을 집중하기 위해 사용된다. 이렇게하면, 여기 광은 TIRF의 조명에 필요한 평행 광속 (도 3)와 같은 목적을 남긴다샘플. 대물 렌즈의 외주에 중심으로부터 초점면 내에 초점을 이동하는 것은 상기 빔이 상기 대물 잎되는 각도를 변경하지만, 함수 시료에 레이저 스폿의 위치 (도 3),하지되는 것 전체 빔 형상. TIRF 조명은 대물 렌즈의 초점면 내에서의 레이저의 초점을 번역 할 잠망경로서 기능하는 거울들의 세트를 사용하여 조절 될 수 임계각에서 계속된다. 렌즈 색도 보정되어야하며 두 개 또는 3 개의 렌즈의 집합으로 사용될 수있다. 세 렌즈계 대물 (도 4)의 후 초점면으로 넓어진 광을 집중하는 레이저 빔 (따라서 시료에서의 조명 스폿) 및 제 3 렌즈를 넓히는 망원경 역할 개의 렌즈로 구성된다. 두 함수 (망원경 초점)도 두 개의 렌즈의 조합에 의해 달성 될 수있다 (도 4 참조). 거울은 레이저 광의 손실을 방지하기 위해 적어도 95 % 반사되어야한다. 두 거울들의 세트는 일반적으로 이러한 구성으로 적용되는 각 빔 조정을 정확하게 레이저 빔의 각도와 위치를 조정하기에 충분하다. 다이크로 익 오버레이 반영 및 다른 특정 파장의 빛을 전송 및 중첩 또는 두 개의 레이저 빔을 분할하는 데 사용됩니다. Polychroic 필터 이색 필터보다 더 복잡하고 수신 된 여기 광을 반사하고 표본으로부터 발광 광을 출사 전송하는데 필요하다. 이들은 목적 및 현미경 튜브 렌즈 사이 필터 큐브에 배치된다. 필터 청소 : 레이저 직원당 D 레이저의 종류에 따라서는 레이저 잎 직후 레이저 빔을 배치해야 좁은 전송 대역폭으로 필터를 청소. 노치 필터효과적으로 좁은 대역폭을 갖는 레이저 광을 흡수하고 다른 모든 광을 전송하도록 설계된다. 이들은 임의의 스퓨리어스 레이저 여기 광을 필터링 방출 경로 내에 배치된다. 그러나, 노치 필터는 0 ° 들어오는 각도에서만 작동합니다. 노치 필터의 밴드 폭이 매우 날카로운 경우, 상이한 수신 각도는 더 이상 반영되지 않을 수있다. 시준 된 레이저 레이저 광의 차단은 영향을받지 않고, 후방 산란 광을 효율적 카메라 도달 방해해서는 안된다. 비율 계량을위한 크세논이나 수은 아크 램프의 전면에 배치 할 때 적절한 필터 휠이 장착 동력 필터 휠은 쉽게 여기 및 방출 경로에 넣고 다른 빛의 강도 (ND 필터를 장착하는 경우) 또는 형광 채널 (사이의 간단한 전환을 허용 할 수있다 칼슘 이미징 또는 카메라 앞에서)는 발광 형광을 위해 선택합니다. 50:50 큐브 빔 스플리터 C두 개의 분리 된 여기 빔 경로에 레이저 빔을 분할하기 위해 사용될 수 있으며 잠망경 앞에 그들을 결합. 빔 스플리터 (배출 경로) : 물리적 필터 변경 필요없이 빠른 이미지 수집의 경우, 방출 빔은 이동 - 청색과 적색 편이 채널로 분할된다. 원칙적으로, 빔 스플리터는 웨지 또는 이색 거울들의 집합 및 파장 - 의존성 방식으로 방출 된 빔을 분리하기 위해 이색 거울을 이용하여 구축 할 수있다. 두 방출 필터는 방출 채널을 정리하는 데 필요하다. 공간 필터 : 여기 빔의 공간 필터링은 때때로 낮은 품질의 레이저 빔으로부터 방출 비평 행 광선을 제거하기 위해 필요하다. 공간 필터는 모두 렌즈의 초점 위치에 정확하게 배치 작은 핀홀이있는 2 망원경 렌즈로 구성된다. 레이저 빔의 평행하지 않은 부분에 의한 방법이 스퓨리어스 광은 효율적으로 차단된다. 스와TIRF 기반 현미경을 설정할 때 채널 조건이 충족되어야합니다. 초점으로하고, 제 1 렌즈의 초점 거리보다 작은 위치 시키도록 더 어려운 작은 핀홀과 공간적 필터링 증가. 렌즈 수차에 의한 영향을 줄이기 위해 대신 간단한 렌즈 저배율 (10 배 또는 20 배) 높은 품질과 무한 보정 현미경 목표를 사용하는 것이 유리하다. 잠망경 : 잠망경 설치 목적, TIRF 이미징을위한 전제 조건의 초점면에서 포커스 된 레이저 빔을 번역 할 필요가있다. 이는 용이하게 2 개의 2 인치 미러, 제 1 미러 및 넓히고 현미경에 여기 빔을 집중 (도 5)를 반영하기 위해 2 미러를 위치시키는 포스트를 조정하기위한 병진 스테이지로부터 구축 할 수있다. 카메라 : 후면 조명 전자 - 배가 전하 결합 장치 (EMCCD)는 일상적으로 사용됩니다단일 분자 신호의 기록. 이는 높은 양자 효율의 높은 취득 속도 (95 %까지) (최대 30 메가 헤르츠)와 비교적 낮은 소음입니다. -80 ℃까지 냉각하여 열 잡음을 감소시키고, 현재 EMCCD 카메라들에 의해지지된다. EMCCD 기술의 한계는 카메라 노이즈 카메라 이득 모두 선형으로 증가시키고, 신호가 포착되고 있다는 점이다. 이는 sCMOS 칩의 특별한 구조에 훨씬 빨리 EMCCD 카메라보다 훨씬 저렴하고 동작 과학적 CMOS (sCMOS) 카메라와 그렇지 않다. 각각의 픽셀은 서로 다른 검출 감도를 갖추고 있기 때문에 CMOS 기술과 관련된 문제, 즉 화상 취득이 여전히 단일 분자 수준에서 정량적 판독 어느 정도의 결여이다. 원칙적으로이 화소를 통해 정규화 보상 될 수 있지만,이 절차는 11 사소한 것은 아니다. 이것은 우리가 아직 다시 주저 이유단일 분자 현미경 sCMOS 카메라 칭찬하지만,이 기술의 급속한 발전에 비추어, sCMOS 카메라는 즉시 선택 될 수도 카메라. 느린 스캔 CCD 카메라 카메라는 모두 함께 증폭 및 관련 잡음 화소 분산을 방지하고 이들이 소위 &quot;운동&quot;모드에서 동작 할 수있는 경우 빠른 획득 속도를 지원한다. 이 모드는 관심 영역 (ROI)의 영역을 제외하고 전체 카메라 칩 가능 저장 장치로 칩 자체를 채용 할 수있는, 마스크된다. ROI가 처음으로 노출 된 후, 생성 된 전하를 상기 화상 노광으로부터 보호되는 픽셀 라인에 의해 칩 픽셀 라인의 마스킹 영역으로 시프트된다. 마스킹 영역에 ROI의 모든 라인의 시프 팅 (서브 밀리 초 범위 내에서)이 완료되면, ROI 자체는 다음의 노광을위한 준비이다. CCD 칩의 모든 화소 라인이 충전 될 때까지이 사이클을 반복한다. 이 칩은 크게 redu 천천히 판독CED 판독 잡음. 1000 X 1300 픽셀 칩에 예를 들어, 50 × 50 픽셀의 20 개의 ROI가 연속해서 기록 될 수있다. 화상이 판독되기 전에 상당한 시간 동안 칩 상에 남아 있기 때문에, 과도한 열 잡음을 감소시키는 수단으로서 (액체 질소 등) 고품질 마스킹을 보장하고 카메라를 냉각하는 것이 중요하다. 일부 EMCCD 카메라는 또한 운동 모드를 지원한다. 소프트웨어 : 레이저, 셔터, 버튼 확장 박스 (AOM) 및 카메라 노출의 타이밍뿐만 아니라 적절한 이미지 저장이 성공적인 영상 실험에 필수적이다. 원칙적으로 많은 정의 동작은 카메라와 함께 사용 가능한 소프트웨어 패키지를 사용하여 프로그래밍 될 수있다. 상용 소프트웨어 패키지는 작은 노하우 기술로 구현 될 수있는 하드웨어 주변의 큰 수를 지원한다. 펄스 발생기는 데이터 수집 (DAQ) (아날로그 및 디지털 출력 채널) 보드와 오실로스코프 : 펄스 발생기는탁월한 선택 정의 된 시간과 전압의 펄스에 트리거 펄스를 변환합니다. 이 방법 레이저는 정확하게 출력 전력에 대한 제어 및 서브 밀리 초 범위 밀리 초에서 시간이 초과 될 수있다. 아날로그 출력 보드와 DAQ는이를 쉽게 달성 PCI 슬롯을 통해 컴퓨터의 마더 보드에 통합된다. 펄스 지속 시간, 진폭과 주파수는 오실로스코프로 확인됩니다. 전체 여기 빔 경로의 인클로저 : 인해 전체 여기 빔 경로는 실험실 환경에서 감싸 야 공기 대류에 여진 프로파일의 변동을 방지 할 수 있습니다. TIRF 현미경을 수행 할 때이 법안은 특히 중요합니다. 광학 부품은 먼지와 레이저 광선에서 인간의 눈으로부터 보호됩니다. 인클로저 쉽게 예술 공급 상점에서 구입하실 수 있습니다 블랙 카드 보드에서 구축 할 수 있습니다. Photobleac 후 SLB 형광 복구의 유동성을 확인하려면힝 (FRAP) 측정 (12)가 수행된다. FRAP 두 여기 빔 경로의 존재는 (도 3 참조) 것이 바람직하다. 제 1 빔의 경로 상에 이중층의 형광을 설계된다. 이 TIRF 구성과 낮은 조명 강도로 수행 할 수 있습니다. 이 광축을 따라 대물 잎되도록 제 2 빔 경로는 짧지 만 강렬 표백제 펄스 허용되어야하고 비 TIRF 모드로 구성되어야한다. 둥근 구멍이 여기 빔 경로에 배치 될 수있다 정의 가장자리 동그란 표백제 프로파일을 돌출 (도 8 참조). 화상하기 위해 물체면에이 개구는, 최적의 위치는 (도 3 참조)를 렌즈 (3)의 초점면에있을 것. 개구가 약간 시프트 된 위치에 배치되는 경우에는,이 때문에 렌즈의 장 초점 거리로, 충분한 품질의 화상 개구도 생성 될 수있다. 수행 (T)를 한 후그 원시 데이터가 적절하게 해석되어야 실험 촬상. 여러 단계별 프로토콜 데이터를 수집하고 분석하기 기본 설정 (예를 들어 조명 전력 및 시간, TIRF 각도)의 조정을 포함하는, 제공된다.

<table><tbody><tr><td># 1.5 유리 슬라이드</td><td>VWR</td><td>631-0853</td><td></td></tr><tr><td>250ml 둥근 바닥 플라스크</td><td>VWR</td><td>201-1357</td><td></td></tr><tr><td>50 : 50 빔 스플리터 큐브</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td></td></tr><tr><td>Acousto-opitcal modulator C1205-2</td><td>Isomet</td> <td>-</td> <td>변조 할 수없는 CW 레이저를 사용하는 경우 필요</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20009</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 647-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 테이프</td><td>VWR</td><td>489-1312</td><td>또는 기타 열 안정성 접착 테이브 Avanti</td></tr><tr><td>Mini-Extruder</td><td>, Avanti Lipids</td><td>610000</td>, <td>수조 초음파 발생기의 대안,</td></tr><tr><td>초음파 발생기, QSONICA Q700</td>, <td>QSONICA</td><td>Q700</td><td></td></tr><tr><td>빔 스플리터</td><td>케언</td><td>P280 / 210 / MLS</td><td></td></tr><tr><td>B & uuml; 치 회전 증발기</td><td>VWR</td><td>531-0837</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td>대안에 대한 원고 텍스트 참조</td></tr><tr><td>concentarted hydrogenperoxide</td><td>Roth</td><td>9683.1</td><td></td></tr><tr><td>진한 황산</td><td>Roth</td><td>X944.2</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 접착제</td><td>Uhu</td><td>45705</td><td>Uhu plus sofortfest 2min</td></tr><tr><td>필터 휠</td><td>셔터 계기</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>LabTek 챔버</td><td>VWR</td><td>734-2062</td><td></td></tr><tr><td>레이저&nbsp;</td><td>Toptica-different</td><td></td> <td>variants (파장 375 - 785 nm)를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>lens</td><td>Thorlabs, Newport-DGS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NTA-Ni (lipid)</td><td>Avanti Lipids</td><td>790404C</td><td>이미 Choroform에 의해 해결 된 전달 버전의 nicekl salt variant</td></tr> 권장 <tr><td>POPC (지질)</td> <td>Avanti Lipids</td><td>850457C</td><td>이미 Choroform에 해결 된 전달 버전이 권장됩니다.</td></tr><tr><td>현미경 Zeiss Axiovert 200</td><td></td> <td>Zeiss-mirrors</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>광학 필터</td><td>AHF, Chroma, Semrock</td><td>-</td><td>필터 세트는 염료의 다양한 조합에 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>BK Precision&nbsp;</td><td>2120C</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>사용 전</td></tr><tr><td>탈기 잠망경</td><td>Thorlabs</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>에폭시 접착제</td></tr><tr><td>전력계의 대안 Lasermate-Q</td><td>Coherent</td><td>-</td><td>사용된 스펙트럼 범위에서 민감한 모든 전력계는 다음을 수행합니다</td></tr><tr><td>.펄스 발생기</td><td>스탠포드 연구 시스템</td><td>SRS DG535&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>공간 필터</td><td>Thorlabs</td><td>KT310/M</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 0.2&micro; m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 가능 아포크로맷 대물렌즈 100x, NA 1.46</td><td>Zeiss</td><td>440782-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>트리클로로메탄/클로로포름</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>튜브 초원심분리 폴리카보네이트 1.00 mm, 11 mm x 32 mm&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>45237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall 초원심분리기&nbsp;</td><td>써모 피셔</td><td>RC M150GX</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 로터</td><td>써모 피셔</td><td>S120-AT2</td><td></td></tr><tr><td>UV 분광 광도계 나노드롭 2000c</td><td>써모 피셔</td> <td>진공</td><td></td></tr> <tr><td>펌프</td><td>VWR</td><td>181-0248</td><td></td></tr></tbody></table>

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

단 10년 동안 단일 분자 현미경은 광학 및 레이저 물리학에 대한 강력한 배경 지식을 가진 물리학자들만이 공유하는 외딴 영역에서 현재 모든 분야의 생명 과학자들에 의해 생생한 관심을 받고 있는 분야로 변화했습니다 1. 이는 단일 분자 이미징이 살아있는 세포의 현장 단백질 거동을 밝히고 가시광선 2의 회절 한계 이하의 전례 없는 해상도로 세포 조직을 밝힐 수 있는 고유한 잠재력을 가지고 있기 때문입니다. 유리로 지지되는 평면 지질 이중층(SLB)은 현탁액에서 자라는 세포를 유리 슬라이드에 충분히 가깝게 가져와 노이즈 감소 전반사(Total Internal Reflection) 조명 모드 3,4에서 쉽게 이미지화할 수 있는 강력한 도구입니다. 그들은 세포-세포 접촉 형성, 세포내이입, 외세포작용 및 면역 인식과 같은 다양한 원형질막 관련 사건에서 단백질 역학을 연구하는 데 매우 유용합니다. 재현 가능한 방식으로 이동성이 높은 단백질 기능화 SLB를 생성하는 방법, 내 단백질 이동성을 결정하는 방법 및 단일 분자 검출을 사용하여 단백질 밀도를 측정하는 방법 등 간단한 절차가 제시됩니다. TIRF 조명 기능을 갖춘 비용 효율적인 단일 분자 현미경 시스템을 구성하는 방법과 실험에서 작동하는 방법을 보여줍니다.

단일 분자 형광 현미경 시스템의 구조는도 2에서 상당히 상세 개략되어있다. 그러한 광학 구성 요소들 및 다른 하드웨어 구성 요소와 같은 개별 부품은 서론에서 설명된다. TIRF 비 TIRF 조명에 정의 된 방식으로 발생시키는 광 여기 빔 경로는, 도시 및도 5 내지도 3에 설명되어있다.에 위치하는 제 잠망경 거울 앞 50:50 빔 스플리터의 위치를주의 마이크로 미터 번역 단계 (그림 5). 이 빔 스플리터 (녹색 표시) 이미징에 사용되는 TIRF 빔 (빨간색 표시) 비 TIRF 빔 (그림 3에 설명 된대로) 표백 또는 로컬 조리개 정의 빛을 매개 샘플 활성화에 사용되는 중첩. (오렌지색으로 나타낸도 5)가 결합 된 광 통로의 MICR 반전 포트에 다시 초 잠망경 미러를 통해 반사된다oscope. 도 4에서 설명되고도 2에서 설명한 바와 같이, 2 또는 3 개의 볼록 렌즈의 구현은 레이저 빔 프로파일을 넓히고 TIRF에서 샘플을 조명 개의 평행 빔을 야기 할 목적의 초점면 상에 레이저 빔을 집중하고 각각의 비 TIRF. 시험편의 전력 밀도를 계산에 필요한 측정 된 강도 값에 대한 예는도 6에 도시되어있다. 평균 배경 신호 (촬상 사용됨) 조명과 중앙 영역에서 측정 된 강도로부터 감산하는, 내부 영역 판정 레이저 빔 (여기에 7089 카운트)에 의해 조명되지 않은보기의 필드. 조명 (1684 카운트)의 백그라운드 보정 된 평균 강도 및 중앙 영역 (4830 카운트)를 통합 한 다음에 강도 상승 (1.471주고 해당 영역 크기 곱조명 영역에 대한 × 10 (8) 수와 중앙 지역에 대한 3.424 × 10 7 카운트). 중앙 및 조명 된 영역 내에 통합 강도의 비는 중앙 영역 (0.23 또는 23 %)를 조명하는 전체 전력의 비율을 산출한다. 영화에 도시 된 바와 같이, 전체 전력이 아닌 TIRF 조명 모드에서 파워 미터의 사용과 대물에서 결정되어야한다. 우리의 예에서는 따라서 중앙 지역에서 5 mW의 X 0.23 = 1.15 mW의의 전력 상승을주고, 5 mW의 조정됩니다. 1 ㎛ 내지 2 예에서 41.5 픽셀 량 때문에, 중앙 영역은 7089 픽셀 /41.5 μm의 화소 × 2 = 170.8 ㎛의 (2)의 크기를 갖는다. 이 영역 (170.8 ㎛의 2)에 의해 중앙 영역 (1.15 Mw)이 조명하는 광의 전력을 나누면 평균 전력을 산출중부 지역에서 0.7의 kW / cm (2)의 밀도. 그림 7은 이미지와 빠른 연속 획득 한 형광의 대응 강도 결과를 (10 밀리의 시간 프레임 즉, 초당 100 프레임)이 있습니다. 강도 정량 형광 신호를 커버 칠 (= 49) 화소의 일곱 의해 직사각형 영역의 평균 신호가 결정된다. 또한 배경의 평균 신호는 단일 분자 신호의 근접한 픽셀 일곱 일곱의 사각형 영역 내에 결정된다. 배경 보정 된 평균 신호 (굵게 표시) 단일 분자 신호를 야기하는 영역 (= 49) 내의 픽셀들의 개수에 의해 곱해진다. SLB-관련된 형광 표지 된 단백질의 이동도를 평가하기위한 대표적인 실험 FRAP는도 8에 도시되어있다.도 8a repeti 참고낮은 강도 넓어 촬상 빔보다 좁은 제의 단일 사용의 용도적인 제로 초 시점에서 신속 형광 색소 박리 용 고강도 빔 조리개 정의. 표백제 펄스에 앞서 초기 평균 강도 값에 의해 정규화 된 노란색 원 내의 배경 감산 된 평균 강도를, 속도 및 정도 형광 회복을 기록하는 시각에 대하여도 8b에 그려진다. 도시 된 바와 같이, 초기 강도의 이중층 (녹색 선으로 표시)이 90 % 이상은 형광 색소 절제 다음 75 초 이내에 회복. 결과적으로 도시 SLB에 매립 단백질의 10 % 이하가 움직이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> SLB 시스템의 도식 개요를 그림. (A)는 SLB 수 POPC (90-99%) 및 지질 합성 DGS NTA-N 이루어지는I (1-10%). 깨끗한 유리 표면이 해당 지질로 구성된 포드 SUV로 충전 할 때 그들은 자발적으로 형성한다. (B) 일단 형성되면,이 SLB 수 쉽게 어느 한쪽 C- 또는 (12H를 열두 히스티딘을 포함하는 N- 말단 태그에 대한 확장 수용성 단백질로 장식 할 수 있습니다 예를 공동 자극 분자 B7-1 및 접착 분자 ICAM-1) 또는 단백질 이량 체는 두 개의 태그 예 αβMHC 클래스 II 이량 체).에 대한 각 (2x6H 여섯 히스티딘을 포함하는 확장 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> 도 2 여기 및 발광 빔 경로의 개요. 가스 이온 레이저 (예를 들면 아르곤 또는 Kr을 + +), 음향 광학 (MO)의 사용과 함께 신속한 셧 동작 될 수있다<html> dulators. 레이저 다이오드는 여러 파장에서 현재 사용할 수 있으며, 그들은 전자 마이크로 분노 변조 할 수있는 훌륭한 대안을 나타냅니다. 레이저 빔이 용이하게 두 (이색) 거울 및 분할로 조정하고 두 개 이상의 빔 경로를 야기 할 수있는 간단한 빔 스플리터의 사용과 결합 될 수 있다는 점에 유의하라. 이 예에서 TIRF 영상 빔 (이벤트를 모니터링하기 위해) 및 표백제 빔 (표백 형광 또는 중 하나에 사진이 활성화 구경 정의 방식으로 갇힌 분자하는) 사용됩니다. 두 자극 경로는 추가의 셔터를 사용하여 서로 독립적으로 조작 될 수있다. 잠망경 시료 TIRF 조명을 생성하는 목적의 초점면 내에 집속 된 레이저 빔을 변환을 허용한다. 형광 이미지는 스펙트럼 초 고감도 카메라 (예 EM-CCD 또는 CMOS 카메라 과학)의 사용으로 획득하기 전에 발광 빔 스플리터를 이용하여 분할 될 수있다..COM / 파일 / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> 도 3 목적의 초점면 내에 집속 된 빔을 변환하여 TIRF 조명을 조정하는 단계를 포함한다. 상기 레이저 빔의 초점 위치를 도시하는 바와 같이 빔의 전좌를 통해 주위로 중심으로부터 목적의 초점면 내에 시프트 (잠망경 미러 배열을 사용). 임계각은 전반사의 발생에 도달 할 때까지 그 결과는 평행 광 조명으로 기울어 목적을 남긴다. 산장은 전반사가 발생 유리 - 미디어 인터페이스에서 발생한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">이 파이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a><html> gure. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> 도 4 간단한 광학 시스템은 대물 렌즈의 초점면에 레이저 빔을 집중시키기 위해. 어느 세 개의 렌즈는 레이저 빔을 확대하고 TIRF 대물 렌즈의 초점면에 집중할 필요가있다. 두 렌즈 시스템은 세 개의 렌즈 시스템보다 적은 렌즈 관련된 오류를 포함하고 TIRF 촬상 된 빔을 생성하기위한 더 적합 할 수도있다. 정의 빔 확대와 날카로운 모서리와 조명 지점을 목표로 할 때 사진을 활성화 또는 -bleaching을 사용하는 연구에 필요한 것 3 개의 렌즈가 바람직 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; 도 5는 형광 현미경의 뒤에 빔 경로의 사진에 주석. 이미 쉽게 두 여기 빔 TIRF 한 (녹색 표시) 비 TIRF 모드에서 다른 구현도 2 하나 지팡이에 설명 된 바와 같이 (표시된 빨간색). 이들은 50:50 빔 스플리터 (BS)를 이용하여 중첩된다. 볼록 렌즈 (L1 및 L2)은 대물의 초점면 상에 그들 각각의 초점 빔으로 위치된다 (도시하지 않음). 두 개의 거울 (M1 및 M2)로 구성된 잠망경은 현미경으로 항목의 포트를 통해 두 빔을 안내합니다. 제 1 미러 (M1)는 TIRF 위치로 빔 중 하나를 이동 (표시된 바와 같이 마이크로 미터 나사를 돌려서) 변환 스테이지 (TS)를 이용하여 이동 될 수있다. TIRF가 설정되면 (여기서는 적색으로 표시된 광 표백 또는 -activati​​on, 사용됨) 제 2 빔은 비 TIRF에 목적을두고 독립적 TIRF 빔을 조정할 수있다모드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> 조명 스폿의 중심 영역 내에서 전력을 측정하는도 6. 배경을 반영 관심 해당 영역을 선택 나타낸 바와 같이, 전체 조명 영역 (IA) 및 이벤트 후 기록한다 중앙 영역 (CA). IA 및 CA에 대해 이러한 배경으로부터 값을 빼고 각 영역 (= 집적 강도) 내에 존재하는 픽셀들의 수의 수정 평균 강도를 승산하여 강도를 통합. (: 23 %이 예에서) CA를 조명 빔 전력의 비율에 도착 IA의에 의해 CA의 통합 강도를 나눈다. 여기서 전체 빔 파워 (곱하여 CA 조명 광의 전력을 결정 : 5m을0.23) : 여기에 CA를 (조명 비율이 W). (1 / 41.5 μm의 2 화소 여기 -1), 화소 간 영역 크기 변환 인자 (여기 7089 화소) 영역을 곱 중앙 영역의 크기를 결정한다. CA의 크기에 의해 (1.15 mW의 여기에) 힘을 분할, CA를 조명 여기 빛의 평균 전력 밀도에 도달 할 수 있습니다. (여기를 : 170.8 μm의 2) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> 단일 분자 신호 그림 7. 정량. (A) SLB에 하나의 형광의 시간 코스. 관심 (ROI, 노란색)의 7 × 7 픽셀 크기의 영역은 정량에 대한 신호 주위에 배치된다. 배경은 이웃 7 × 7 픽셀에서 결정된다ROI (녹색). (B)의 정량화 된 평균 픽셀 강도가 나열됩니다. 단일 분자 신호를 결정하기 위해, 배경 값 (녹색 ROI)은 하나의 단일 분자 형광 강도를 시간에 대해 도시된다 신호 값 (옐로우 ROI)으로부터 감산 및 49 (C)에 의해 곱해진다. 형광 표백하는 과정에서와 같이 90 밀리 초 시점이 생략되어 있음을 유의하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> SLB의 무결성을 확인합니다 (FRAP) 분석을 광표백 후 8 형광 복구 그림. (A)는 FRAP 실험마다 10 화상이 도시되어 IEK / MCC-647 알렉사 형석 운반 이중층에서 수행 하였다. 실험에 도시의 (B) FRAP 정량 (A). 값이 표백 전 초기 강도 (I 오)로 나눈 값 (A)에 도시 황색 ROI 내의 평균 세기 (I)를 나타낸다. 레드 데이터 포인트는 (A)에 표시되며, 녹색 선은 원래 강도의 0.9 복구를 의미한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

본 영상에서는 바이오 기능화된 평면 지지 지질 이중층을 준비하고 특성화하는 방법을 보여드리겠습니다. 또한 단일 분자 검출 기능이 있는 전반사 형광 현미경의 구조에 대해 상세히 설명하겠습니다. 지질 이중층의 여기 전력 밀도, 유동성 및 단백질 밀도를 측정하겠습니다.평면 유리 지지 지질 이중층에 대한 짧은 소개부터 시작하겠습니다. 작은 단일층 소포가 깨끗한 유리 표면에 닿으면, 소포가 터지면서 퍼져나가 연속적인 지질 이중층을 형성합니다. 수분 쿠션 위에서는 일반적으로 팜 소재를 선택합니다.Ole phosphocholine 또는 POPC는 상온 및 37 °C에서 유동적인 지질 이중층을 형성하기 때문에 주요 지질로 사용됩니다. 기능화를 위해 니켈 킬레이트 헤드 그룹을 가진 합성 지질인 nickel antiox를 첨가하며, 이는 폴리 히스티딘 태그 단백질과 결합합니다. 예를 들어, 여기에서 보여주는 공자극 분자인 B7-1, 접착 분자인 ICAM-1, 그리고 T-세포 인식을 위한 형광 표지 펩타이드 로딩 MHC 분자 등이 있습니다. 하지만 이 이중층 시스템은 원칙적으로 다양한 생물학적 시스템의 완전히 다른 공정들을 다루는 데 활용될 수 있습니다.평면 시스템의 특성상, 형광 이벤트는 전반사 모드(total internal reflection mode)에서 모니터링할 수 있으며, 이는 세포 배경 잡음을 상당히 줄여주어 단분자 형광 현미경 관찰에 매우 적합합니다. 지질 준비를 위해서는 POPC 및 니켈-NTA 지질, 클로로포름, 그리고 깨끗한 둥근 바닥 플라스크가 필요합니다. 원하는 비율의 지질을 클로로포름에 녹인 후, 여기에서 보여주는 것과 같이 진공 상태에서 건조시킵니다. 하룻밤 동안 고진공 처리 후, 지질은 플라스크 내벽에 막을 형성합니다. 지질 재수화(rehydration)를 위해, 건조된 지질 혼합물에 10 mL의 탈기 PBS(Degas PBS)를 사용하십시오.혼합하지 마십시오. 지질 산화를 방지하기 위해 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 가스를 플라스크에 채우고 플라스크를 회전시킵니다. 그러면 지질이 우윳빛 현탁액을 형성합니다.다음 단계에서 가스 교환이 일어나는 것을 방지하기 위해 분광광도계용 블랭크(blank)로 사용할 소량의 샘플을 준비합니다. 지질 현탁액이 담긴 플라스크를 제대로 밀봉하는 것이 매우 중요합니다. 밀폐된 초음파 세척기를 사용하여 물리적 형성 과정을 거치는 동안 공기를 차단할 수 있도록 오토클레이브 테이프와 같은 내열성 점착 테이프를 사용하십시오.플라스크를 장착한 후, 최대 출력 170 W로 초음파 처리 과정을 시작합니다. 60분 동안 초음파 처리를 수행합니다. 물리적 형성으로 인해 탁도가 현저히 감소했습니다.이는 550nm에서 분광 광도법으로 확인할 수 있습니다. 초음파 처리 전의 분취액을 공시료(blank)로 사용하십시오. 지질 양을 나타내는 230nm에서의 광학 밀도는 일정하게 유지되어야 합니다.여기서 소형 초원심분리 튜브에 1 mL의 소포체 현탁액을 채운 후, 테이블탑 초원심분리기의 고정각 로터에 넣습니다. 이층막 조제를 위해서는 반드시 소형 단일층 소포체(unilamellar vesicles)만을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 초음파 처리 중에 함께 형성되는 더 크고 밀도가 높은 다층 소포체(multilamellar vesicles)는 이층막의 유동성을 방해하므로, 반드시 원심분리를 통해 침전시켜 제거해야 합니다.먼저, 상온에서 150,000 G로 1시간 동안 원심분리합니다. 생성된 snat을 4°C에서 288,000 G로 8시간 더 원심분리합니다. 지질 소포가 유리 슬라이드 위에 퍼져 연속적이고 유동적인 이중층을 형성하려면 유리 슬라이드가 매우 깨끗해야 합니다.이를 위해 커버슬립을 테플론 마운드에 넣고, 이를 다시 유리 용기에 넣습니다. 보안경, 보호 장갑 및 실험복을 착용하고 화학 물질 보관함 내에서 매우 주의하여 작업하십시오. 30% 과산화수소 1분량에 고농축 황산 3분량을 첨가하여 매우 반응성이 강하고 산화력이 높은 페로모노황산을 생성합니다.이 혼합물은 피부, 눈, 의복을 포함한 유기 물질과 격렬하게 반응하며, 즉시 가열됩니다. 슬라이드를 30분 동안 배양하십시오.포셉으로 커버슬립을 잡습니다. 증류수 또는 고품질의 탈이온수를 사용하여 깨끗한 커버슬립 양면의 산성 성분을 철저히 씻어냅니다. 그 다음, 여러 개의 개별 지질 이중층을 동시에 생성할 수 있도록 테플론 스탠드 위에 슬라이드를 놓고 10분 이내로 건조시킵니다. 건조된 커버슬립은 급경화 접착제로 접합합니다.8웰 또는 16웰 Lab Tech 챔버에 2성분 에폭시 접착제를 도포합니다. 먼저, 기존의 렙트(lept) 유리 슬라이드를 프레임에서 조심스럽게 제거합니다. 두 가지 접착제 성분을 1:1 비율로 혼합합니다.챔버 프레임의 바닥 홈에 고르게 펴 바릅니다. 깨끗한 커버 슬립을 접착제가 도포된 챔버 프레임 바닥 위에 놓습니다. 접착제가 유리 슬라이드와 플라스틱 프레임 사이에 고르게 펴졌는지 확인하십시오.접착제가 30분 동안 굳도록 둡니다. 지질 물리적 현탁액을 PBS로 1:10 비율로 희석하고 0.2 micron 필터로 여과한 후, 8-웰 챔버의 각 웰에 이 희석액 120 microliters를 넣거나 16-웰 챔버의 각 웰에 60 microliters를 넣습니다. 유리 표면 전체가 덮였는지 확인하고 20분 동안 기다립니다.이제 이층막이 형성되었습니다. 잔여물을 제거하기 위해 각 웰을 30 milliliters의 PBS로 헹굽니다. 어떤 경우에도 유리 표면이 공기에 노출되지 않도록 주의하십시오. 공기에 노출되면 이층막이 즉시 파괴됩니다. 다음 단백질 장식 단계를 위해 각 웰에 동일한 부피의 완충액이 포함되도록 웰을 완전히 채우고 액체 돔을 제거하십시오.330 µL를 취합니다. 이렇게 하면 각 웰에 약 350 µL가 남게 됩니다. 이중층을 단백질로 코팅하기 위해, 선택한 폴리히스티딘 태그 단백질이 포함된 마스터 믹스를 준비하고 각 웰에 50 µL씩 첨가합니다.단백질이 재현성 있는 결과를 보장하도록 다크 지질의 니켈 항 헤드 그룹에 결합하게 합니다. 충분히 하지만 조심스럽게 혼합하고, 결합하지 않은 단백질을 제거하기 위해 항상 60분 동안 배양하십시오. 30 mL의 PBS로 다시 세척합니다. 이제 현미경 하드웨어에 집중해 보겠습니다.먼저, 대물렌즈 기반의 TIRF 현미경을 위한 전반사 현미경의 요구 사항을 설명하겠습니다. 높은 개구수를 가진 오일 침강 대물렌즈가 필요합니다. 입사되는 레이저 여기 빔은 이색 거울에 의해 반사되어 2개 또는 3개의 렌즈 세트를 통해 대물렌즈의 후방 초점면에만 집중됩니다.그 후 레이저 광은 코팅된 빔 형태로서 광축을 따라 대물렌즈로 유도됩니다. 이러한 방식으로 형광 시료의 전체 깊이가 조명됩니다. 빔을 광축에 수직으로 이동시키면 빔은 콜리메이트 상태를 유지하지만, 대물렌즈를 기울어진 형태로 빠져나오게 됩니다.이동을 계속하면 어느 시점에서 유리 커버 슬립과 시료 사이의 인터페이스에서 빔이 전반사되는 임계각에 도달하게 됩니다. 이때 발생하는 소멸파(evanescent wave)의 강도는 지수함수적으로 감소하며, 인터페이스에서 수백 나노미터 이내의 매우 가까운 거리에 있는 바닥 층만이 여기됩니다. 이제 레이저 빔을 대물렌즈의 후초점면에 수동으로 집중시키는 방법을 설명하겠습니다.세 개 또는 두 개의 렌즈를 사용하는데, 처음 두 개의 렌즈를 통해 레이저 빔의 직경을 확대합니다. 이들의 초점 거리 비율에 의해 시료 평면에서의 조명 스폿 크기가 결정됩니다. 빔이 평행하게 유지되도록 하려면 두 렌즈 사이의 거리를 두 초점 거리의 합과 같게 조정하십시오.세 번째 렌즈는 확장된 빔을 대물렌즈의 후초점면에 집속하는 데 사용됩니다. 이 렌즈의 초점 거리는 현미경 본체 및 관련 페리스코프의 크기에 맞춰야 하므로, 본 실험의 경우에는 75 cm 정도로 훨씬 길어야 합니다. 렌즈 2와 3 사이의 거리는 빔의 특성에 영향을 주지 않습니다.따라서 그 사이의 무한 공간을 이용하여 왜곡 없이 정의된 방식으로 빔을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 조리개를 삽입하여 시료 평면에 정밀하게 투사할 수 있습니다. 본질적으로 렌즈 3개 대신 2개를 사용하여 동일한 결과를 얻을 수 있습니다.두 개의 렌즈 시스템은 정의도가 낮지만 렌즈 수차를 적게 유발합니다. 조리개와 같은 단순한 기능만으로도 시간적 변조를 매우 효과적으로 구현할 수 있습니다. 가스, 철 또는 고체 레이저를 밀리초 범위의 셔터(예: 기계식 셔터 또는 광학 변조기) 앞에 배치해야 합니다.좋은 대안은 전자적으로 변조가 가능하며 외부 셔터가 필요 없는 다이오드 레이저입니다. 두 개의 거울만으로 빔을 원하는 위치와 방향으로 정렬하기에 충분합니다. 앞서 논의한 바와 같이, 두 개의 렌즈는 빔을 확장하고 이를 현미경 대물렌즈의 후방 초점 평면에 집중시키는 데 사용됩니다.광학 레일 위의 페리스코프 하단 거울을 이동시켜 터프 구성을 위한 빔 위치를 변경할 수 있습니다. 이미지 검출에는 고감도 카메라, 예를 들어 전자 증배 전하결합소자(em CCD)를 사용합니다. 다른 파장의 두 번째 레이저 빔을 빔 경로에 맞춰 정렬할 수 있습니다.거울과 다이크로익 오버레이를 사용하여 구성합니다. 두 가지 색상을 동시에 검출하기 위해, 상용 빔 분할 장치를 방출 경로에 배치합니다. 실험 시 두 개의 독립적인 여기 빔 경로를 갖추는 것이 매우 유용합니다.예를 들어, 하나는 터프 이미지(turf imaging)용으로, 다른 하나는 표적 광퇴색(photobleaching) 또는 활성화를 위해 사용할 수 있습니다. 이는 2개의 50:50 빔 스플리터(beam splitter) 세트를 구현함으로써 쉽게 달성할 수 있습니다. 그림에서 보는 바와 같이, 두 개의 서로 다른 렌즈 및 거울 조정 시스템을 통해 두 개의 개별적인 빔 프로파일과 빔 각도를 생성할 수 있습니다.예를 들어, 잔디 구역(turf) 내 이미징을 위해서는 확장된 빔을, 잔디 구역 외 지역의 표백 또는 활성화를 위해서는 더 집중된 빔을 사용할 수 있습니다. 비잔디 구역 빔 경로에 조리개를 배치하여 표백 또는 활성화 지점의 모양을 정밀하게 형성할 수 있습니다. 각 빔 경로에 하나씩 배치된 두 개의 추가 셔터는 대물렌즈를 기울어지지 않은 직선 경로로 유지하면서 레이저 빔의 스위치를 독립적으로 제어할 수 있게 합니다.전력계를 켜고 해당 레이저 파장에 맞게 조정하십시오. 대물렌즈에서의 레이저 광 출력을 측정하여 기록합니다. 이제 현미경 뒤의 거울을 이동시켜 대물렌즈로 향하는 레이저 빔을 터프(turf) 위치로 기울이십시오.레이저 광선을 직접적으로 쳐다보지 마십시오. 오른쪽 하단에는 형광 단백질로 장식된 이층막의 방출을 통해 시각화된 여기 레이저의 강도 프로파일이 표시되어 있습니다. 여기서는 서로 다른 강도 영역을 강조하기 위해 의사 색상(false color) 표현을 사용하였습니다.충분히 큰 관심 영역(region of interest) 내에서 배경의 평균 강도를 측정하십시오. 이 값은 EM gain 및 판독 속도와 같은 특정 카메라 설정에 따라 달라지며, 측정된 모든 강도에서 차감해야 합니다. 조명 영역 전체의 평균 강도를 결정하십시오.주변부의 강도 값이 카메라 배경값과 유사해질 정도로 충분히 큰 직경을 선택하여 중심 영역의 평균 강도를 측정합니다. 이 영역은 추후 현미경 실험이 수행될 관심 영역(region of interest)으로 정의됩니다. 이제, 제거된 영역과 중심 영역 모두의 강도 값에서 평균 배경 강도 값을 뺍니다.다음으로, 배경 보정된 강도에 해당 영역 크기의 픽셀 수를 곱하여 통합 강도를 구합니다. 조사된 영역의 통합 강도를 1로 설정하고 중심 영역의 분율을 계산합니다. 파워미터로 측정한 전력입니다.본 사례에서 5 milliwatt는 전체 조사 영역의 통합 강도에 정비례합니다. 이 값에 중심 영역의 전력 분율을 곱하여 중심 영역 내의 전력을 결정합니다. 본 예시에서는 1.15 milliwatt이며, 픽셀 수를 제곱 마이크론으로 변환하는 계수는 카메라 칩의 실제 픽셀 크기와 방출 경로의 배율에 따라 달라집니다.마이크로미터 슬라이드를 사용하여 쉽게 측정할 수 있습니다. 본 예시에서 중심 영역은 170.8 square microns에 해당합니다. 출력 밀도는 측정된 출력을 면적으로 나눈 값이며, 따라서 1.15 milliwatt를 170.8 square microns로 나눈 값인 0.007 milliwatt per square micron과 같습니다.이는 제곱센티미터당 0.7 Kilowatt입니다. 이중층의 유동성을 결정하기 위해, 광퇴색 후 형광 회복(FRAP) 실험을 수행합니다. 왼쪽 하단 영상에서 보는 바와 같이, 낮은 전력 밀도에서 형광 이중층을 이미지화합니다.오른쪽 하단의 영상에서 현미경 위의 해당 랩테크 챔버(lab tech chamber)를 확인할 수 있습니다. 그런 다음, 짧고 높은 전력 밀도 펄스를 사용하여 원형 영역을 광탈색(bleach)하고 낮은 전력 밀도에서 회복 과정을 모니터링합니다. 마찬가지로, 몽타주는 0초를 광탈색 펄스 시점으로 하여 서로 다른 시간대의 실험 개요를 제공합니다.표시된 원 내부의 평균 배경 보정 형광 강도를 정량화하고, 모든 측정된 강도를 실험 시작 시점의 강도로 정규화합니다. 광퇴색 펄스를 가하기 전, 정규화된 강도 값을 시간에 따라 도식화합니다. 포화 값은 이 경우 90% 이상의 이동 분율(mobile fraction)을 나타냅니다. 먼저, 낮은 여기 전력 밀도에서 이중층의 이미지를 촬영합니다.예를 들어, 로그 감쇄 값이 2인 광학 밀도 필터를 배치하면 전력이 100배 감소합니다. 노출 시간은 전체 과정 동안 일정하게 유지해야 하며, 본 실험의 경우 감쇄되지 않은 전력 밀도에서 단일 유체 힘을 촬영하기에 충분한 0.7 kilowatt per square centimeter에서 10 milliseconds로 설정해야 합니다. 서로 다른 강도의 영역을 강조하기 위해 가색(false color) 표현을 사용하십시오.나중에 단일 분자 측정을 수행할 관심 영역 하나와 동일한 크기의 영역 하나를 선택합니다. 배경 제거를 위해, 배경이 제거된 적분 강도를 계산합니다. 이제 여기 빔 경로에서 광학 밀도 필터를 제거하고, 해당 영역을 표백시킨 후 이미지를 촬영합니다.탈색된 영역에서 개별 형광 분자가 확산되는 것을 확인할 수 있습니다. 단일 형광 분자는 회절 한계로 인해 일반적으로 2~3픽셀의 직경을 가지므로, 각 단일 분자 신호 주변의 7x7픽셀 영역 하나와 그 인근의 두 번째 영역을 지정합니다. 배경 제거를 위해서는 단일 형광 분자의 신호만을 정량화하는 것이 중요합니다.따라서 BI 층의 단백질을 이미지화할 때는 단백질 비율을 1보다 작게 설정하거나, 특히 SAT로 표지된 단백질을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 당사의 예시와 같이 단백질 비율을 1로 설정한 경우, 두 영역의 통합 강도를 측정하고 신호에서 배경값을 빼십시오. 노출 평균 중에 표백이 발생했을 가능성이 크므로, 예시에서 보여주는 마지막 관찰 이벤트는 고려하지 마십시오. 여기서 보정된 신호를 구하며, 우리는 9개 프레임에 걸쳐 관찰된 4개 중 1개 형광-단백질에 대해 이 작업을 수행합니다.하지만 이 절차는 최소 수백 개의 단일 분자 이벤트에 대해 수행되어야 합니다. 감쇠된 여기 전력 밀도에서 관찰된 원래의 이층막 이미지로 돌아가 보겠습니다. 분자 밀도는 낮은 여기 전력 밀도에 대한 관심 영역의 적분 강도에 100을 곱하여 보정한 후, 이를 평균 단일 분자 강도와 면적으로 나누어 결정합니다.우리는 제곱 마이크론당 421.4 Fluor 힘의 밀도를 다루고 있습니다. 본 예시에서 지질 대 단백질 비율이 1인 경우, 이는 제곱 마이크론당 동일한 분자 수와 같습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 단일 분자 형광 현미경을 사용하여 단백질 기능화 지질 이중층을 제작하고 특성화할 수 있게 될 것입니다.또한, 이러한 목적을 위해 표준 현미경을 수정하고 업그레이드하는 기본 원리를 숙지해야 합니다. 나중에 이 방법론을 사용하여 이중층 결합 항원과 세포 결합 T-세포 수용체의 결합 동역학을 결정하겠지만, 이를 기반으로 한 다른 많은 응용 분야 또한 분명히 가능합니다.

single-molecule-fluorescence-microscopy-on-planar-supported-bilayers

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 지질 bilyer의 위쪽 전단지에 버렸네 형성을 조절하고 TIRF 현미경을 사용하여 버렸네 형성을 시각화하는 것으로 알려진 세포 부착 단백질을 고정하는 방법을 보여줍니다.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

이 비디오에서는 전반사 형광 현미경을 사용하여 유리로 지지된 지질 이중층의 체외에서 셉틴 조직을 조사하는 절차를 보여줍니다.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: 생물학적 막 모방체에 대한 셉틴 어셈블리를 조사하기 위한 현미경 기반 체외 기술

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운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

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