평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

이 동영상에서는 bio functionalized planar support lipid bilar를 준비하고 특성화하는 방법을 보여줍니다. 또한 단일 분자 검출 기능을 갖춘 전반사 현미경의 아키텍처에 대해서도 자세히 설명합니다. 우리는 여기 전력 밀도, 유동성 및 지질 블레이의 단백질 밀도를 측정할 것입니다.

평면 유리 지지 지질 블레이에 대한 간략한 소개부터 시작하겠습니다. 작은 uni lanar 소포가 깨끗한 유리 표면을 만나면 터지고 퍼져 연속적인 지질 이중층을 형성합니다. 물 쿠션에서 우리는 일반적으로 손바닥 재질을 선택합니다.

올레 포스포콜린(Ole phosphocholine) 또는 POPC는 실온과 섭씨 37도에서 유체 지질 이중층을 생성하기 때문에 지질이 우세합니다. 기능화를 위해 폴리 히스타민 태그 단백질과 결합하는 니켈 킬레이트 헤드 그룹을 가진 합성 지질인 니켈 안티옥스를 첨가합니다. 예를 들어, 여기에 표시된 바와 같이 공동 자극 분자 B 7 1, 접착 분자 ICAM 1 및 T 세포 인식을 위해 형광 표지 된 펩타이드가 적재 된 MHC 분자이지만,이 이중층 시스템은 원칙적으로 다양한 생물학적 시스템에서 완전히 다른 프로세스를 처리하는 데 사용될 수 있습니다.

평면 시스템의 특성으로 인해 형광 이벤트는 전반 내부 반사 모드에서 모니터링 할 수 있으며, 이는 세포 배경을 크게 줄이고 단일 분자 형광 현미경 검사에 매우 적합한 손입니다 지질 준비를 위해 지질, POPC 및 니켈 안티 옥스 클로로포름이 필요하며 깨끗한 둥근 바닥 플라스크는 지질을 원하는 비율과 클로로포름으로 용해하고 여기에 표시된 것처럼 진공 상태에서 건조시킵니다. 하룻밤 동안 고진공 처리 후 지질은 플라스크 내부에 필름을 형성합니다. 지질 재수화를 위해 건조된 지질 혼합물에 10ml의 Degas PBS를 사용하십시오.

섞지 마십시오. 이제 지질 산화를 방지하려면 플라스크에 질소와 같은 불활성 가스를 채우거나 아르곤을 플라스크를 회전시킵니다. 지질은 유백색 현탁액을 형성합니다.

다음 단계에서 가스 교환을 방지하기 위해 분광 광도계의 블랭크로 작은 샘플을 취하십시오. 지질 현탁액을 함유한 플라스크를 적절하게 밀봉하는 것이 매우 중요합니다. 예를 들어 열 안정성 접착 테이프를 사용하십시오.ample, 동봉된 초음파 수조를 사용하여 물리적 형성 중 공기를 보호하는 오토클레이브 테이프.

플라스크를 장착 한 후 최대 170 와트의 전력으로 초음파 처리 절차를 시작하십시오. 60분 동안 소닉 케이드. 물리적 형성으로 인해 탁도가 크게 떨어졌습니다.

이는 550나노미터의 분광 측광법으로 확인할 수 있습니다. 초음파 처리 전에 취한 부분 표본을 블랭크로 사용하십시오. 230 나노미터에서의 광학 밀도는 지질량을 나타내며 일정하게 유지되어야 합니다.

여기에서 우리는 작은 초원심분리 튜브에 1밀리리터 visl 현탁액을 채우고 탁상용 초원심분리기의 고정각 로터에 넣습니다. 이중층 준비를 위해 작은 uni laina 소포만 사용하는 것이 매우 중요합니다. 초음파 처리 중에 형성되는 더 크고 밀도가 높은 다중 라이나 소포는 이중층 유동성을 방해하므로 창백하게 하고 원심분리에 의해 제거해야 합니다.

먼저 실온에서 150, 000G로 1 시간 동안 회전합니다. 생성된 스내트는 그런 다음 섭씨 4도에서 288, 000G에서 추가로 8시간 동안 원심분리됩니다. 유리 조명은 지질 소포가 퍼지기 전에 매우 깨끗해야 연속적이고 유동적인 이중층을 형성할 수 있습니다.

이를 위해 우리는 커버 슬립을 테프론 마운드에 넣은 다음 유리 용기 운동에 넣습니다. 눈 보호, 보호 장갑 및 실험실 가운 및 화학 캐비닛에서 작업하는 경우 각별한 주의. 우리는 1 부 30 % 과산화수소를 첨가 한 다음 3 부 농축 황산을 첨가하여 매우 반응성이 높고 산화성 perio mono sulfuric acid를 생성합니다.

이 혼합물은 피부, 눈, 의복을 포함한 유기 물질과 격렬하게 반응합니다. 즉시 가열됩니다. 슬라이드를 30분 동안 배양합니다.

forcet로 커버 슬립을 잡고 W 증류수 또는 고품질 노조수를 사용하여 깨끗한 커버 슬립의 양쪽에 있는 산을 철저히 씻어냅니다. 그런 다음 슬라이드를 테프론 스탠드에 놓고 한 번에 여러 개의 개별 지질 이중층을 생성할 수 있도록 10분 이상 건조시키지 마십시오. 우리는 빠른 경화로 건조 된 커버 슬립을 접착합니다.

2액형 에폭시는 8웰 또는 16웰 실험실 기술 챔버에 접착제를 붙입니다. 먼저 프레임에서 원래 뗵쇠 유리 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다. 두 가지 접착제 성분을 1:1 비율로 혼합합니다.

챔버 프레임의 바닥 홈에 골고루 펴 바릅니다. 깨끗한 커버 슬립을 챔버 프레임의 접착제로 덮인 바닥에 놓습니다. 유리 슬라이드와 플라스틱 프레임 사이에 접착제가 고르게 펴져 있는지 확인하십시오.

접착제를 30분 동안 굳히십시오. PBS 1에서 10으로 지질 물리적 현탁액을 희석하고 0.2 미크론 필터를 통해 120 마이크로 리터의 희석액을 8 웰 챔버의 각 웰에 여과하거나 60 마이크로 리터를 16 웰 챔버의 각 웰에 여과합니다. 전체 유리 표면이 덮여 있는지 확인하고 20분 동안 기다립니다.

이중층은 이제 형성되었습니다 잔여물을 제거하기 위해 les 헹굼 각 웰 30ml의 PBS로. 어떤 대가를 치르더라도 유리 표면의 공기 노출을 피하십시오. 이렇게 하면 이중층이 즉시 파괴되어 각 웰에 동일한 부피의 버퍼가 포함되어 있는지 확인합니다.다음 단백질 장식 단계에서는 각 웰을 완전히 채우고 액체 돔을 제거합니다.

330마이크로리터를 꺼냅니다. 이렇게 하면 각각 약 350마이크로리터가 남게 됩니다. 이중층을 단백질로 장식하려면 선택한 폴리 히스타민 기술 단백질이 포함된 마스터 믹스를 준비하고 각 웰에 50마이크로리터를 추가합니다.

단백질은 재현성 있는 결과를 보장하기 위해 다크 지질의 니켈 안티 헤드 그룹에 결합하며, 철저하지만 신중하게 혼합하고 항상 60분 동안 배양하여 결합되지 않은 단백질을 제거합니다. PBS 30ml로 다시 씻으십시오. 이제 현미경 하드웨어에 초점을 맞추겠습니다.

먼저, 객관적인 기반 잔디 현미경을 위한 전반사 현미경의 요구 사항을 설명합니다. 높은 개구수를 가진 오일 이멀젼 대물렌즈가 필요합니다. 들어오는 레이저 여기 빔은 이색성 거울에 의해 반사되고 2개 또는 3개의 렌즈 세트를 통해 대물렌즈의 후면 초점면에만 초점을 맞춥니다.

그런 다음 레이저 광은 광축을 따라 코팅된 빔으로 대물렌즈를 리드합니다. 이런 식으로 형광 표본은 전체 깊이에서 조명됩니다. 빔을 광축에 수직으로 옮기면 빔은 정렬된 상태로 유지되지만 대물렌즈는 기울어진 방식으로 남습니다.

전위를 계속하면 어느 시점에서 유리 커버 슬립과 시편 사이의 계면에서 빔이 완전히 반사되는 임계각에 도달하게 됩니다. 결과 소멸파의 강도는 기하급수적으로 감소하고 최대 수백 나노미터의 계면에 가까운 4층만 여기됩니다. 이제 레이저 빔을 대물렌즈의 후방 초점면에 수동으로 초점을 맞추는 방법을 설명합니다.

처음 두 개의 렌즈와 함께 세 개 또는 두 개의 렌즈를 사용하면 레이저 빔의 직경이 증가합니다. 초점 거리의 비율은 표본 평면에서 조명 스폿의 크기를 결정합니다. 빔이 대조 상태를 유지하도록 하려면 두 초점 거리의 합이 같도록 이러한 렌즈 사이의 거리를 조정하십시오.

세 번째 렌즈는 넓어진 빔을 대물렌즈의 후방 초점면으로 초점을 맞추는 데 사용됩니다. 이 렌즈의 초점 거리는 현미경 본체의 치수와 관련 잠망경의 치수를 수용해야 하기 때문에 우리의 경우 75cm로 훨씬 더 길어야 합니다. 렌즈 2와 렌즈 3 사이의 거리는 빔 속성에 영향을 미치지 않습니다.

그러므로, 그 사이의 무한대 공간은 왜곡 없이 정의된 방식으로 빔을 수정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 조리개를 삽입하고 시편 평면에 정확하게 투영할 수 있습니다. 본질적으로 세 개의 렌즈 대신 두 개의 렌즈를 사용하여 동일한 결과를 얻을 수 있습니다.

two lens system은 덜 정의되어 있지만 렌즈 수차가 더 적습니다. 조리개와 같은 간단한 기능은 여전히 시간 변조를 위해 매우 잘 구현될 수 있습니다. 가스, 철 또는 고체 레이저는 예를 들어 기계식 셔터 또는 알루미늄 광학 변조기와 같은 밀리초 범위 셔터 앞에 배치해야 합니다.

좋은 대안은 전자적으로 변조될 수 있고 외부 차단이 필요하지 않은 다이오드 레이저입니다. 두 개의 미러는 빔을 어떤 장소와 방향으로든 조준하기에 충분합니다. 앞서 논의한 바와 같이, 두 개의 렌즈는 빔을 넓히고 현미경의 후방 초점면에 초점을 맞추는 데 사용됩니다. 목표.

광학 레일에서 잠망경의 하단 미러를 이동하여 잔디 구성을 위한 빔을 이동할 수 있습니다. 이미지 감지를 위해 고감도 카메라를 사용합니다. 예를 들어, 다른 파장의 전자 증식 전하 결합 소자 또는 em CCDA 제2 레이저 빔은 빔 경로에 정렬될 수 있습니다.

거울과 이색성 오버레이를 사용합니다. 동시 두 가지 색상 감지를 위해 시중에서 판매되는 빔 분할 장치를 방출 경로에 배치합니다. 실험의 경우 두 개의 독립적인 여기 빔 경로를 배치하는 것이 매우 유용합니다.

예를 들어, 하나는 잔디 이미징을 위한 것이고 다른 하나는 표적 광표백 또는 활성화를 위한 것입니다. 이것은 2 50 50 빔 스플리터 세트를 구현하여 쉽게 달성할 수 있습니다. 그림에서 볼 수 있듯이 두 개의 서로 다른 렌즈 및 미러 조정 시스템은 두 개의 개별 빔 프로파일과 빔 각도를 생성합니다.

예를 들어, 잔디에서 이미징하기 위한 확장된 것과 잔디가 아닌 잔디에서 표백 또는 활성화를 위한 더 집중된 것입니다. 조리개를 잔디가 아닌 빔에 배치하여 표백 또는 활성화 지점을 정확하게 형성할 수 있습니다. 각 빔 경로에 하나씩 있는 두 개의 추가 셔터 레이저 빔의 독립적인 제어 스위치를 활성화하여 대물렌즈를 기울어지지 않은 직선 경로에 둡니다.

파워 미터를 켜고 해당 레이저 파장으로 조정합니다. 대물렌즈에서 레이저 광의 세기를 측정하고 기록하십시오. 이제 현미경 뒤에 미러를 옮겨 대물렌즈의 레이저 빔을 잔디 위치로 기울입니다.

레이저 광선을 직접 쳐다보지 마십시오. 오른쪽 하단 모서리에서 형광 단백질로 장식된 이중층의 방출을 통해 시각화된 여기 레이저의 강도 프로파일을 볼 수 있습니다. 여기서는 잘못된 색상 표현을 사용하여 강도가 다른 영역을 강조 표시합니다.

충분히 큰 관심 영역 내에서 배경의 평균 강도를 측정합니다. 이 값은 EM 게인 및 판독 속도와 같은 특정 카메라 설정에 따라 달라지며 측정된 모든 강도에서 빼야 합니다. 전체 조명 영역 내의 평균 강도를 결정합니다.

주변부의 강도 값이 카메라 배경의 강도 값과 비슷하도록 충분히 큰 직경을 선택하고 중앙 영역의 평균 강도를 측정합니다. 이 영역은 나중에 현미경 실험이 수행될 관심 영역을 정의합니다. 이제 제거된 영역과 중심 영역의 강도에서 평균 배경 강도 값을 뺍니다.

다음으로, 배경 보정된 강도에 영역 크기의 해당 픽셀 번호를 곱하여 적분 강도에 도달합니다. 조명 영역의 통합 강도를 하나로 설정하고 중앙 영역의 분수를 계산합니다. 파워 미터로 측정한 전력입니다.

우리의 경우 5밀리와트는 전체 조명 영역의 통합 강도에 정비례합니다. 이 값에 중앙 영역의 전력 분율을 곱하여 중앙 영역 내의 전력을 결정합니다. 이 예에서 1.15밀리와트인 경우 픽셀 수를 제곱 미크론으로 변환하는 계수는 카메라 칩의 실제 픽셀 크기와 방출 경로의 배율에 따라 달라집니다.

마이크로미터 슬라이드로 쉽게 확인할 수 있습니다. 이 예에서 중심 영역은 170.8제곱 미크론에 해당합니다. 전력 밀도는 측정된 전력을 면적으로 나눈 값을 나타내므로 1.15밀리와트를 170.8제곱 미크론 또는 제곱 미크론당 0.007밀리와트로 나눈 값과 같습니다.

그것은 평방 센티미터당 0.7 킬로와트입니다. 이중층의 유동성을 결정하기 위해 랩 실험의 광표백 후 형광 회수를 수행합니다. 왼쪽 하단 동영상에서 볼 수 있듯이 낮은 출력 밀도에서 형광 이중층을 이미지

오른쪽 하단 동영상에서 현미경에서 해당 실험실 기술 챔버를 볼 수 있습니다. 그런 다음 짧은 고출력 밀도 펄스로 원형 영역을 표백하고 낮은 전력 밀도에서 복구를 모니터링합니다. 다시 말하지만, 몽타주는 표백제 펄스가 0인 다른 시점에 대한 실험의 개요를 제공합니다.

마크 서클 내에서 보정된 평균 배경 형광 강도를 정량화하고 측정된 모든 강도를 실험 시작 시점의 강도로 정규화합니다. 표백제 펄스를 생성하기 전에, 우리는 시간에 대해 정규화된 intensity 값을 플로팅합니다. 채도 값은 90% 이상의 모바일 분수를 나타냅니다.먼저 낮은 여기 전력 밀도에서 이중층의 이미지를 촬영합니다.

예를 들어, 로그 감쇠 값이 2인 광학 밀도 필터를 배치하면 전력이 100배 감소합니다. 노출 시간은 전체 절차에 걸쳐 일정해야 하며 이 경우 감쇠되지 않은 전력 밀도(제곱센티미터당 0.7킬로와트에서 10밀리초)에서 단일 유체 힘을 이미지화하기에 충분해야 합니다. 잘못된 색상 표현을 사용하여 강도가 다른 영역을 강조 표시합니다.

나중에 단일 분자 측정이 수행될 관심 영역 하나와 동일한 크기의 영역 하나를 선택합니다. 배경 빼기의 경우, 배경을 뺀 적분 강도를 계산합니다. 이제 excitation beam path에서 optical density filter를 제거하고 해당 영역을 표백한 다음 이미지를 촬영합니다.

표백된 부위에서 개별 독감 힘이 확산되는 것을 볼 수 있습니다. 단일 독감 힘은 일반적인 직경이 2-3 픽셀로 회절로 제한되며, 각 단일 분자 신호 주위에 7 x 7 픽셀의 한 영역과 가까운 두 번째 영역을 취합니다. 배경 빼기의 경우 단일 Fluor force의 신호만 정량화하는 것이 중요합니다.

따라서 BI 계층에서 단백질 대 단백질 비율이 1 미만인 단백질을 이미지화하거나 SAT 특이적으로 표지된 단백질을 이미징하는 것이 가장 좋습니다. 우리의 예에서 볼 수 있듯이 하나의 식단 대 단백질 비율은 두 영역에 대한 통합 강도를 측정하고 신호에서 배경을 빼서 노출 평균 동안 백화가 발생했을 가능성이 있으므로 이 예에서 마지막으로 관찰된 이벤트를 취하지 마십시오. 여기에서 수정된 신호는 9개의 프레임에 걸쳐 관찰되는 4개의 독감 1개에 대해 이 작업을 수행합니다.

그러나 이 절차는 적어도 수백 개의 단일 분자 이벤트에 대해 수행해야 합니다. 감쇠된 여기 전력 밀도에서 관찰된 원래의 이중층 이미지로 돌아가 보겠습니다. 분자 밀도는 100을 곱하여 낮은 여기 전력 밀도에 대한 관심 영역의 통합 강도를 수정하고 이를 평균 단일 분자 강도와 면적으로 나누어 측정합니다.

우리는 평방 미크론당 421.4 Fluor force의 밀도를 다루고 있습니다. 이 예에서 식단 대 단백질 비율이 1인 경우 이는 제곱 미크론당 동일한 수의 분자와 같습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 단일분자 형광 현미경을 사용하여 단백질 기능화 지질 이중층을 준비하고 특성화할 수 있어야 합니다.

또한 이러한 목적을 위해 표준 현미경을 수정하고 업그레이드하기 위한 기본 원리를 숙지해야 합니다. 우리는 나중에 이 방법론을 사용하여 세포 결합 T 세포 수용체에 대한 이중층 결합 항원의 결합 동역학을 결정할 것이지만, 이를 기반으로 하는 다른 많은 응용 분야는 확실히 실현 가능합니다.