평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

본 영상에서는 바이오 기능화된 평면 지지 지질 이중층을 준비하고 특성화하는 방법을 보여드리겠습니다. 또한 단일 분자 검출 기능이 있는 전반사 형광 현미경의 구조에 대해 상세히 설명하겠습니다. 지질 이중층의 여기 전력 밀도, 유동성 및 단백질 밀도를 측정하겠습니다.

평면 유리 지지 지질 이중층에 대한 짧은 소개부터 시작하겠습니다. 작은 단일층 소포가 깨끗한 유리 표면에 닿으면, 소포가 터지면서 퍼져나가 연속적인 지질 이중층을 형성합니다. 수분 쿠션 위에서는 일반적으로 팜 소재를 선택합니다.

Ole phosphocholine 또는 POPC는 상온 및 37 °C에서 유동적인 지질 이중층을 형성하기 때문에 주요 지질로 사용됩니다. 기능화를 위해 니켈 킬레이트 헤드 그룹을 가진 합성 지질인 nickel antiox를 첨가하며, 이는 폴리 히스티딘 태그 단백질과 결합합니다. 예를 들어, 여기에서 보여주는 공자극 분자인 B7-1, 접착 분자인 ICAM-1, 그리고 T-세포 인식을 위한 형광 표지 펩타이드 로딩 MHC 분자 등이 있습니다. 하지만 이 이중층 시스템은 원칙적으로 다양한 생물학적 시스템의 완전히 다른 공정들을 다루는 데 활용될 수 있습니다.

평면 시스템의 특성상, 형광 이벤트는 전반사 모드(total internal reflection mode)에서 모니터링할 수 있으며, 이는 세포 배경 잡음을 상당히 줄여주어 단분자 형광 현미경 관찰에 매우 적합합니다. 지질 준비를 위해서는 POPC 및 니켈-NTA 지질, 클로로포름, 그리고 깨끗한 둥근 바닥 플라스크가 필요합니다. 원하는 비율의 지질을 클로로포름에 녹인 후, 여기에서 보여주는 것과 같이 진공 상태에서 건조시킵니다. 하룻밤 동안 고진공 처리 후, 지질은 플라스크 내벽에 막을 형성합니다. 지질 재수화(rehydration)를 위해, 건조된 지질 혼합물에 10 mL의 탈기 PBS(Degas PBS)를 사용하십시오.

혼합하지 마십시오. 지질 산화를 방지하기 위해 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 가스를 플라스크에 채우고 플라스크를 회전시킵니다. 그러면 지질이 우윳빛 현탁액을 형성합니다.

다음 단계에서 가스 교환이 일어나는 것을 방지하기 위해 분광광도계용 블랭크(blank)로 사용할 소량의 샘플을 준비합니다. 지질 현탁액이 담긴 플라스크를 제대로 밀봉하는 것이 매우 중요합니다. 밀폐된 초음파 세척기를 사용하여 물리적 형성 과정을 거치는 동안 공기를 차단할 수 있도록 오토클레이브 테이프와 같은 내열성 점착 테이프를 사용하십시오.

플라스크를 장착한 후, 최대 출력 170 W로 초음파 처리 과정을 시작합니다. 60분 동안 초음파 처리를 수행합니다. 물리적 형성으로 인해 탁도가 현저히 감소했습니다.

이는 550nm에서 분광 광도법으로 확인할 수 있습니다. 초음파 처리 전의 분취액을 공시료(blank)로 사용하십시오. 지질 양을 나타내는 230nm에서의 광학 밀도는 일정하게 유지되어야 합니다.

여기서 소형 초원심분리 튜브에 1 mL의 소포체 현탁액을 채운 후, 테이블탑 초원심분리기의 고정각 로터에 넣습니다. 이층막 조제를 위해서는 반드시 소형 단일층 소포체(unilamellar vesicles)만을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 초음파 처리 중에 함께 형성되는 더 크고 밀도가 높은 다층 소포체(multilamellar vesicles)는 이층막의 유동성을 방해하므로, 반드시 원심분리를 통해 침전시켜 제거해야 합니다.

먼저, 상온에서 150,000 G로 1시간 동안 원심분리합니다. 생성된 snat을 4°C에서 288,000 G로 8시간 더 원심분리합니다. 지질 소포가 유리 슬라이드 위에 퍼져 연속적이고 유동적인 이중층을 형성하려면 유리 슬라이드가 매우 깨끗해야 합니다.

이를 위해 커버슬립을 테플론 마운드에 넣고, 이를 다시 유리 용기에 넣습니다. 보안경, 보호 장갑 및 실험복을 착용하고 화학 물질 보관함 내에서 매우 주의하여 작업하십시오. 30% 과산화수소 1분량에 고농축 황산 3분량을 첨가하여 매우 반응성이 강하고 산화력이 높은 페로모노황산을 생성합니다.

이 혼합물은 피부, 눈, 의복을 포함한 유기 물질과 격렬하게 반응하며, 즉시 가열됩니다. 슬라이드를 30분 동안 배양하십시오.

포셉으로 커버슬립을 잡습니다. 증류수 또는 고품질의 탈이온수를 사용하여 깨끗한 커버슬립 양면의 산성 성분을 철저히 씻어냅니다. 그 다음, 여러 개의 개별 지질 이중층을 동시에 생성할 수 있도록 테플론 스탠드 위에 슬라이드를 놓고 10분 이내로 건조시킵니다. 건조된 커버슬립은 급경화 접착제로 접합합니다.

8웰 또는 16웰 Lab Tech 챔버에 2성분 에폭시 접착제를 도포합니다. 먼저, 기존의 렙트(lept) 유리 슬라이드를 프레임에서 조심스럽게 제거합니다. 두 가지 접착제 성분을 1:1 비율로 혼합합니다.

챔버 프레임의 바닥 홈에 고르게 펴 바릅니다. 깨끗한 커버 슬립을 접착제가 도포된 챔버 프레임 바닥 위에 놓습니다. 접착제가 유리 슬라이드와 플라스틱 프레임 사이에 고르게 펴졌는지 확인하십시오.

접착제가 30분 동안 굳도록 둡니다. 지질 물리적 현탁액을 PBS로 1:10 비율로 희석하고 0.2 micron 필터로 여과한 후, 8-웰 챔버의 각 웰에 이 희석액 120 microliters를 넣거나 16-웰 챔버의 각 웰에 60 microliters를 넣습니다. 유리 표면 전체가 덮였는지 확인하고 20분 동안 기다립니다.

이제 이층막이 형성되었습니다. 잔여물을 제거하기 위해 각 웰을 30 milliliters의 PBS로 헹굽니다. 어떤 경우에도 유리 표면이 공기에 노출되지 않도록 주의하십시오. 공기에 노출되면 이층막이 즉시 파괴됩니다. 다음 단백질 장식 단계를 위해 각 웰에 동일한 부피의 완충액이 포함되도록 웰을 완전히 채우고 액체 돔을 제거하십시오.

330 µL를 취합니다. 이렇게 하면 각 웰에 약 350 µL가 남게 됩니다. 이중층을 단백질로 코팅하기 위해, 선택한 폴리히스티딘 태그 단백질이 포함된 마스터 믹스를 준비하고 각 웰에 50 µL씩 첨가합니다.

단백질이 재현성 있는 결과를 보장하도록 다크 지질의 니켈 항 헤드 그룹에 결합하게 합니다. 충분히 하지만 조심스럽게 혼합하고, 결합하지 않은 단백질을 제거하기 위해 항상 60분 동안 배양하십시오. 30 mL의 PBS로 다시 세척합니다. 이제 현미경 하드웨어에 집중해 보겠습니다.

먼저, 대물렌즈 기반의 TIRF 현미경을 위한 전반사 현미경의 요구 사항을 설명하겠습니다. 높은 개구수를 가진 오일 침강 대물렌즈가 필요합니다. 입사되는 레이저 여기 빔은 이색 거울에 의해 반사되어 2개 또는 3개의 렌즈 세트를 통해 대물렌즈의 후방 초점면에만 집중됩니다.

그 후 레이저 광은 코팅된 빔 형태로서 광축을 따라 대물렌즈로 유도됩니다. 이러한 방식으로 형광 시료의 전체 깊이가 조명됩니다. 빔을 광축에 수직으로 이동시키면 빔은 콜리메이트 상태를 유지하지만, 대물렌즈를 기울어진 형태로 빠져나오게 됩니다.

이동을 계속하면 어느 시점에서 유리 커버 슬립과 시료 사이의 인터페이스에서 빔이 전반사되는 임계각에 도달하게 됩니다. 이때 발생하는 소멸파(evanescent wave)의 강도는 지수함수적으로 감소하며, 인터페이스에서 수백 나노미터 이내의 매우 가까운 거리에 있는 바닥 층만이 여기됩니다. 이제 레이저 빔을 대물렌즈의 후초점면에 수동으로 집중시키는 방법을 설명하겠습니다.

세 개 또는 두 개의 렌즈를 사용하는데, 처음 두 개의 렌즈를 통해 레이저 빔의 직경을 확대합니다. 이들의 초점 거리 비율에 의해 시료 평면에서의 조명 스폿 크기가 결정됩니다. 빔이 평행하게 유지되도록 하려면 두 렌즈 사이의 거리를 두 초점 거리의 합과 같게 조정하십시오.

세 번째 렌즈는 확장된 빔을 대물렌즈의 후초점면에 집속하는 데 사용됩니다. 이 렌즈의 초점 거리는 현미경 본체 및 관련 페리스코프의 크기에 맞춰야 하므로, 본 실험의 경우에는 75 cm 정도로 훨씬 길어야 합니다. 렌즈 2와 3 사이의 거리는 빔의 특성에 영향을 주지 않습니다.

따라서 그 사이의 무한 공간을 이용하여 왜곡 없이 정의된 방식으로 빔을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 조리개를 삽입하여 시료 평면에 정밀하게 투사할 수 있습니다. 본질적으로 렌즈 3개 대신 2개를 사용하여 동일한 결과를 얻을 수 있습니다.

두 개의 렌즈 시스템은 정의도가 낮지만 렌즈 수차를 적게 유발합니다. 조리개와 같은 단순한 기능만으로도 시간적 변조를 매우 효과적으로 구현할 수 있습니다. 가스, 철 또는 고체 레이저를 밀리초 범위의 셔터(예: 기계식 셔터 또는 광학 변조기) 앞에 배치해야 합니다.

좋은 대안은 전자적으로 변조가 가능하며 외부 셔터가 필요 없는 다이오드 레이저입니다. 두 개의 거울만으로 빔을 원하는 위치와 방향으로 정렬하기에 충분합니다. 앞서 논의한 바와 같이, 두 개의 렌즈는 빔을 확장하고 이를 현미경 대물렌즈의 후방 초점 평면에 집중시키는 데 사용됩니다.

광학 레일 위의 페리스코프 하단 거울을 이동시켜 터프 구성을 위한 빔 위치를 변경할 수 있습니다. 이미지 검출에는 고감도 카메라, 예를 들어 전자 증배 전하결합소자(em CCD)를 사용합니다. 다른 파장의 두 번째 레이저 빔을 빔 경로에 맞춰 정렬할 수 있습니다.

거울과 다이크로익 오버레이를 사용하여 구성합니다. 두 가지 색상을 동시에 검출하기 위해, 상용 빔 분할 장치를 방출 경로에 배치합니다. 실험 시 두 개의 독립적인 여기 빔 경로를 갖추는 것이 매우 유용합니다.

예를 들어, 하나는 터프 이미지(turf imaging)용으로, 다른 하나는 표적 광퇴색(photobleaching) 또는 활성화를 위해 사용할 수 있습니다. 이는 2개의 50:50 빔 스플리터(beam splitter) 세트를 구현함으로써 쉽게 달성할 수 있습니다. 그림에서 보는 바와 같이, 두 개의 서로 다른 렌즈 및 거울 조정 시스템을 통해 두 개의 개별적인 빔 프로파일과 빔 각도를 생성할 수 있습니다.

예를 들어, 잔디 구역(turf) 내 이미징을 위해서는 확장된 빔을, 잔디 구역 외 지역의 표백 또는 활성화를 위해서는 더 집중된 빔을 사용할 수 있습니다. 비잔디 구역 빔 경로에 조리개를 배치하여 표백 또는 활성화 지점의 모양을 정밀하게 형성할 수 있습니다. 각 빔 경로에 하나씩 배치된 두 개의 추가 셔터는 대물렌즈를 기울어지지 않은 직선 경로로 유지하면서 레이저 빔의 스위치를 독립적으로 제어할 수 있게 합니다.

전력계를 켜고 해당 레이저 파장에 맞게 조정하십시오. 대물렌즈에서의 레이저 광 출력을 측정하여 기록합니다. 이제 현미경 뒤의 거울을 이동시켜 대물렌즈로 향하는 레이저 빔을 터프(turf) 위치로 기울이십시오.

레이저 광선을 직접적으로 쳐다보지 마십시오. 오른쪽 하단에는 형광 단백질로 장식된 이층막의 방출을 통해 시각화된 여기 레이저의 강도 프로파일이 표시되어 있습니다. 여기서는 서로 다른 강도 영역을 강조하기 위해 의사 색상(false color) 표현을 사용하였습니다.

충분히 큰 관심 영역(region of interest) 내에서 배경의 평균 강도를 측정하십시오. 이 값은 EM gain 및 판독 속도와 같은 특정 카메라 설정에 따라 달라지며, 측정된 모든 강도에서 차감해야 합니다. 조명 영역 전체의 평균 강도를 결정하십시오.

주변부의 강도 값이 카메라 배경값과 유사해질 정도로 충분히 큰 직경을 선택하여 중심 영역의 평균 강도를 측정합니다. 이 영역은 추후 현미경 실험이 수행될 관심 영역(region of interest)으로 정의됩니다. 이제, 제거된 영역과 중심 영역 모두의 강도 값에서 평균 배경 강도 값을 뺍니다.

다음으로, 배경 보정된 강도에 해당 영역 크기의 픽셀 수를 곱하여 통합 강도를 구합니다. 조사된 영역의 통합 강도를 1로 설정하고 중심 영역의 분율을 계산합니다. 파워미터로 측정한 전력입니다.

본 사례에서 5 milliwatt는 전체 조사 영역의 통합 강도에 정비례합니다. 이 값에 중심 영역의 전력 분율을 곱하여 중심 영역 내의 전력을 결정합니다. 본 예시에서는 1.15 milliwatt이며, 픽셀 수를 제곱 마이크론으로 변환하는 계수는 카메라 칩의 실제 픽셀 크기와 방출 경로의 배율에 따라 달라집니다.

마이크로미터 슬라이드를 사용하여 쉽게 측정할 수 있습니다. 본 예시에서 중심 영역은 170.8 square microns에 해당합니다. 출력 밀도는 측정된 출력을 면적으로 나눈 값이며, 따라서 1.15 milliwatt를 170.8 square microns로 나눈 값인 0.007 milliwatt per square micron과 같습니다.

이는 제곱센티미터당 0.7 Kilowatt입니다. 이중층의 유동성을 결정하기 위해, 광퇴색 후 형광 회복(FRAP) 실험을 수행합니다. 왼쪽 하단 영상에서 보는 바와 같이, 낮은 전력 밀도에서 형광 이중층을 이미지화합니다.

오른쪽 하단의 영상에서 현미경 위의 해당 랩테크 챔버(lab tech chamber)를 확인할 수 있습니다. 그런 다음, 짧고 높은 전력 밀도 펄스를 사용하여 원형 영역을 광탈색(bleach)하고 낮은 전력 밀도에서 회복 과정을 모니터링합니다. 마찬가지로, 몽타주는 0초를 광탈색 펄스 시점으로 하여 서로 다른 시간대의 실험 개요를 제공합니다.

표시된 원 내부의 평균 배경 보정 형광 강도를 정량화하고, 모든 측정된 강도를 실험 시작 시점의 강도로 정규화합니다. 광퇴색 펄스를 가하기 전, 정규화된 강도 값을 시간에 따라 도식화합니다. 포화 값은 이 경우 90% 이상의 이동 분율(mobile fraction)을 나타냅니다. 먼저, 낮은 여기 전력 밀도에서 이중층의 이미지를 촬영합니다.

예를 들어, 로그 감쇄 값이 2인 광학 밀도 필터를 배치하면 전력이 100배 감소합니다. 노출 시간은 전체 과정 동안 일정하게 유지해야 하며, 본 실험의 경우 감쇄되지 않은 전력 밀도에서 단일 유체 힘을 촬영하기에 충분한 0.7 kilowatt per square centimeter에서 10 milliseconds로 설정해야 합니다. 서로 다른 강도의 영역을 강조하기 위해 가색(false color) 표현을 사용하십시오.

나중에 단일 분자 측정을 수행할 관심 영역 하나와 동일한 크기의 영역 하나를 선택합니다. 배경 제거를 위해, 배경이 제거된 적분 강도를 계산합니다. 이제 여기 빔 경로에서 광학 밀도 필터를 제거하고, 해당 영역을 표백시킨 후 이미지를 촬영합니다.

탈색된 영역에서 개별 형광 분자가 확산되는 것을 확인할 수 있습니다. 단일 형광 분자는 회절 한계로 인해 일반적으로 2~3픽셀의 직경을 가지므로, 각 단일 분자 신호 주변의 7x7픽셀 영역 하나와 그 인근의 두 번째 영역을 지정합니다. 배경 제거를 위해서는 단일 형광 분자의 신호만을 정량화하는 것이 중요합니다.

따라서 BI 층의 단백질을 이미지화할 때는 단백질 비율을 1보다 작게 설정하거나, 특히 SAT로 표지된 단백질을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 당사의 예시와 같이 단백질 비율을 1로 설정한 경우, 두 영역의 통합 강도를 측정하고 신호에서 배경값을 빼십시오. 노출 평균 중에 표백이 발생했을 가능성이 크므로, 예시에서 보여주는 마지막 관찰 이벤트는 고려하지 마십시오. 여기서 보정된 신호를 구하며, 우리는 9개 프레임에 걸쳐 관찰된 4개 중 1개 형광-단백질에 대해 이 작업을 수행합니다.

하지만 이 절차는 최소 수백 개의 단일 분자 이벤트에 대해 수행되어야 합니다. 감쇠된 여기 전력 밀도에서 관찰된 원래의 이층막 이미지로 돌아가 보겠습니다. 분자 밀도는 낮은 여기 전력 밀도에 대한 관심 영역의 적분 강도에 100을 곱하여 보정한 후, 이를 평균 단일 분자 강도와 면적으로 나누어 결정합니다.

우리는 제곱 마이크론당 421.4 Fluor 힘의 밀도를 다루고 있습니다. 본 예시에서 지질 대 단백질 비율이 1인 경우, 이는 제곱 마이크론당 동일한 분자 수와 같습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 단일 분자 형광 현미경을 사용하여 단백질 기능화 지질 이중층을 제작하고 특성화할 수 있게 될 것입니다.

또한, 이러한 목적을 위해 표준 현미경을 수정하고 업그레이드하는 기본 원리를 숙지해야 합니다. 나중에 이 방법론을 사용하여 이중층 결합 항원과 세포 결합 T-세포 수용체의 결합 동역학을 결정하겠지만, 이를 기반으로 한 다른 많은 응용 분야 또한 분명히 가능합니다.