다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑
May 27th, 2012
다중 표적 추적은 살아있는 세포의 플라즈마 멤브레인 내에 개별적으로 분류된 분자를 추적용으로 개발된 수제 알고리즘입니다. 효율적으로 검출 nanoscale 멤브레인 역학을 조사하기 위해 사용자 친화적인, 포괄적인 도구를 제공하는 고밀도에서 시간에 따른 분자를 추정하고 추적.
이 비디오 Hi.In 전체 단일 양자 추적 실험을 소개합니다. 전용 알고리즘은 전적으로 이미지 ISIS 전문가와의 협업을 통해 고안되었습니다. 이 비디오에서는 표피 성장 인자 수용체를 모델로 사용하여 이 기술의 방법을 설명합니다.
표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor)는 막관통 단백질(transmembrane protein)입니다. 이 수용체는 단클론 항체를 사용하여 태깅되며, 이 항체는 A a B 단편만 유지하도록 감소됩니다. A a B 단편은 비오틴화되고, 그 후 양자점의 스트렙타비딘(streptavidin)과 연결되어 벽 시스템이 EGF 수용체를 정확하게 인식합니다.
우리의 목표는 세포 표면 수용체 역학에 대한 포괄적인 관점을 제공하는 것입니다. 실제로, 분자 궤적은 나노 도메인 내에 국한되어 브로트 확산에서 벗어날 수 있습니다. 예를 들어, 이것은 예를 들어, 신호 파트너 또는 분자 스캐폴드와의 근본적인 상호 작용의 서명일 수 있습니다.
우리는 이러한 이벤트를 세포 전체에 매핑하여 철저하게 설명하는 것을 목표로 하며, 이를 위해서는 높은 라벨링 밀도와 함께 높은 SPECT 시간 해상도로 작업해야 합니다. 따라서 우리는 이 접근 방식을 다중 표적 추적이라고 부릅니다. 실험의 첫 번째 단계는 샘플을 준비하는 것입니다.
우리는 항생제를 사용하지 않고 살아있는 세포를 연구합니다. 여기서 우리는 EGF 수용체를 내인성으로 발현하는 7개의 세포를 사용합니다. 세포를 분리한 후 실험실의 h well에 동일한 수의 세포가 있도록 정확하게 확인해야 합니다.
정확한 셀 수는 셀당 퀀텀닷 수에 대한 예측 가능성을 높이기 위해 매우 중요합니다.H에서 셀을 분배한 후, 7%의 CO2로 37도에서 24시간 동안 labate를 배양해야 합니다. 다음 단계는 항체에 결합된 양자점을 제조하는 것입니다. 양자점은 작은 형광 나노 입자입니다.
이러한 입자는 고전적인 형광 프로브 및 신호에 비해 매우 밝고 안정적이기 때문에 여기에서 매우 큰 관심을 가지고 있습니다. 노즈 비율은 이러한 유형의 실험에서 매우 중요합니다. 이 경우, 우리는 완전한 매체를 사용하여 양자점 주위의 스트립 ides를 포화시키고 응집을 방지합니다.
그 후, 통계적으로 더 많은 1가 양자점을 갖기 위해 bioTE elated 단백질 또는 관심 항체의 양자점을 1:1 비율로 가졌습니다. 이 실험에서는 실험실에서 단클론 항체에서 생산되고 비오틴을 표적으로 하는 EGF 수용체에 대해 a a b 단편을 사용합니다. 약 15 분 동안 배양 중에는 1, 분당 200 회 회전 및 2 개의 5 도로 쉐이커를 사용하여 집계 및 균질성 상태에서 제어를 유지할 수 있습니다.
믹스가 준비되면 셀에 추가할 수 있습니다. 실험실 기술자에서 세포 분리를 방지하기 위해 웰에서 배지를 매우 부드럽게 제거하고 실험에 필요한 양의 혼합물을 추가합니다. 이 경우 웰당 100마이크로리터의 혼합물을 추가합니다.
혼합물을 첨가한 후 15분 동안 세포를 배양할 수 있습니다. 이 경우 37도에서 7%의 CO2가 있습니다. 이 배양 후, 배지의 현탁액에서 많은 수의 빈번한 쌍둥이 점을 발견 할 수 있습니다.
이 양자 점은 이미징 전에 제거해야 합니다. 우리가 가져오는 소음 때문입니다. 그렇기 때문에 우리는 각각을 씻어야 하며, 이 경우에는 여러 번, 다섯 번 씻어야 합니다.
자가형광이 아닌 이미징 배지를 사용하십시오. 여기서는 aps와 함께 HBSS 버퍼를 사용합니다. 이제 세포가 준비되었습니다.
이제 인수를 위한 설정으로 이동할 때입니다. 셋업은 도립 현미경, 안구 민감 카메라, 강력한 수은 램프, 세포를 37도로 유지하는 인큐베이터의 4가지 주요 부품으로 구성되어 있습니다. 수은 램프의 빛은 샘플을 비추기 전에 섬유와 필터 휠을 통과합니다.
샘플의 독감 eSense는 왼쪽의 E-M-C-C-D 카메라에 의해 필터링되고 수집됩니다. 우리는 현재 대물렌즈의 1.3 및 1.49 개구수 오일 상인을 사용합니다. 이 실험의 핵심 단계는 그 자체로 획득하는 것입니다.
세포에 초점이 맞춰지면 강력한 레이블이 있는 대표적인 세포를 봅니다. 양자점에서는 먼저 투과된 백색광에서 단일 이미지를 획득하며, 이는 LA podia의 세포 측면과 특수 한계를 확인하는 데 추가로 사용할 수 있습니다. 그런 다음 일반적으로 전체 프레임에서 허용되는 가장 빠른 속도인 36밀리초 속도로 비디오를 획득합니다.
우리는 전자 곱셈 CCD를 사용하여 적어도 20 데시벨 이상의 북쪽 비율에 대한 충분한 신호로 단일 분자 감도에 도달합니다. 일반적으로 약 25데시벨에서 일반적으로 300프레임을 획득합니다. 지정된 데이터 세트를 평가하려면 비디오 파일이 포함된 디렉터리에 패스를 제공하기만 하면 됩니다.
그런 다음 명령을 입력하면 텍스트가 MetLab 또는 MTT 23 I 명령에 다시 연결되며, 먼저 그래픽 인터페이스 목록이 표시됩니다. 사용된 모든 매개변수는 완전히 자동화된 분석을 시작합니다. 핵심 MTT 분석은 각 프레임에 걸쳐 수행되며, 세 가지 주요 작업을 호출하는데, 첫 번째는 각 픽셀에 대한 대상 양자 부채의 존재 여부에 대한 감지입니다.
그런 다음 각 감지에 대해 픽셀 위치, 신호 강도 등과 같은 대상 관련 매개 변수를 추정합니다. 새 대상의 마지막 재연결. 모든 픽셀에 대해 이전 프레임에 이미 구축된 트레이스를 사용합니다.
국소 소영역을 고려하여 잡음만 존재하거나 신호의 존재라는 두 가지 가설을 비교합니다. 포인트 스프레드 기능을 사용하면 ModuLite는 hin 피크를 갖습니다. 감지된 모든 대상에 대해 프레임당 1회 미만의 perus 감지로 충분히 낮은 거짓 경보를 보장하는 임계값을 사용합니다.
다음으로 감지된 고센의 위치, 너비 및 높이를 추정하기 위해 최소 제곱 고스트 영양 피트를 수행합니다. 이는 염료의 스픽 셀 위치를 현저하게 제공하며, 일반적으로 약 10-20나노미터의 정확도를 제공하며, 고밀도 피크에서 일반적인 신호 대 잡음비는 종종 너무 닫힐 수 있으며 강한 피크는 가장 약한 피크가 이를 처리하는 데 방해가 될 수 있습니다. 실행 중인 초기 이미지에서 감지된 피크를 수축시킵니다.
다시 말하지만, 잔류물에 대한 검출은 일반적으로 피크의 10%를 다시 왜곡시킬 수 있습니다. 거의 완전한 감지에 도달하는 것은 정확한 재연결에 매우 유익합니다. 그런 다음 새 대상 집합이 이 학생에 대한 이전 추적 집합과 일치합니다.
가능한 경우 각 추적을 대상에 할당하고 가능한 깜박임을 처리하기 위해 감지 단계에서 얻은 사용 가능한 모든 통계 정보를 사용합니다. 따라서 대상은 가장 가까운 추적에만 할당되지 않습니다. 충돌이 있는 경우, 추적이 교차할 수 있는 경우, 즉 각 관련 연구 영역이 중복될 수 있는 경우, 추적과 대상 모두에 대한 강도, 속도, 너비 및 깜박임의 통계적 가치를 고려할 것입니다.
이렇게 하면 통계적으로 최적의 재연결 점수가 제공됩니다. 이 전략은 가능한 경우 피할 수 있으며, 가장 가까운 이웃, 즉 가장 느린 동작으로 재연결을 편향시킵니다. 다음으로 함수를 사용하여 궤적 내에서 가능한 일시적인 제한을 평가합니다.
이 기능은 Sexton Simpson과 공동 연구자들이 확립한 국소 확산과 반비례합니다. 임계값을 적용하면 제한된 에피소드 또는 not 에피소드를 정의할 수 있습니다. 이 전체 추적을 반복함으로써 우리는 마침내 일시적인 제한, 속도 저하 증거 측면에서 막 역학을 매핑할 수 있으며 이를 나타낼 수 있습니다.
또는 이 제한 인덱스의 이진 또는 불연속 값을 사용하여 기본적으로 MTT는 해당 작업을 자동으로 수행하여 각 비디오에 대해 저장하고, eski 파일의 각 피크에 대한 행 매개 변수를 저장하고, 추가 고급 조사를 위해 수행합니다. 각 셀에 대한 트레이스 맵과 같은 일반적인 결과와 관심 매개변수에 대한 히스토그램, 피크 강도, 신호 대 잡음비, 국소 결함 값 등을 표시하므로 이 측면은 모든 전용 조사에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 비디오는 이제 MTT에서 얻은 일반적인 결과를 요약합니다.
작업의 상당 부분은 알고리즘을 정교화하는 데 있으며, 이는 고통받는 동작 모드 또는 상호 작용과 같은 전용 조사에 적용되어야 할 수 있습니다. 그러나 MTT를 실행하는 것은 매우 간단합니다. 사용자는 공간 및 시간 제한과 같은 몇 가지 매개변수만 최적화해야 합니다.
MTT를 정교화할 때 우리는 각 작업에 사용되는 분석 옵션을 완전히 재고하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 두 가지 도전적인 축을 따라 프로세스를 최적화합니다. 첫째, 표면 표면에서 최상의 특수 정보를 얻기 위해 고밀도를 처리하는 것이고, 둘째, 일반적으로 낮은 제거 및 고속 구속에서 작업을 허용하는 약한 SNR을 처리하는 것은 기본 상호 작용의 서명으로 해석될 수 있습니다.
예를 들어, 막 수용체(membrane receptor)는 막하(sub membrane) 세포골격(cytoskeleton) 또는 프로 지질(pro lipid) 도메인과 상호 작용할 수 있습니다. 이러한 사건은 공간과 시간의 감금 변화를 통해 조사할 수 있습니다. 동적 측정은 FRA F, Cs 또는 화물과 같은 보완적 접근 방식과 비교할 수 있습니다.
오픈 소스 코드는 학술 연구에 사용할 수 있습니다. CML dot univ의 웹 페이지에서 다운로드 할 수 있으며, 팀 페이지에 S fr이 있으면 다운로드 할 수있는 링크를 제공합니다. 관심 있는 산업체도 저희에게 연락하실 수 있습니다.
우리는 지원과 유익한 토론에 대해 우리 팀과 공용 시설의 구성원들에게 특별히 감사드립니다. 이 프로젝트는 CNRS의 자금 지원으로 운영되며, MAA University Pac Region, National de La, Foundation Medical은 리그 컨트롤러의 지원을 받습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.
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개요
이 기사는 살아있는 세포의 플라스마막 내에서 개별적으로 라벨링된 분자를 추적하는 새로운 알고리즘을 제시합니다. 이 방법은 표피 성장 인자 수용체를 모델로 집중하여 나노스케일 막 역학을 연구하기 위한 포괄적인 도구를 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 이미징 기술
배경
- 표피 성장 인자 수용체는 막관통 단백질입니다.
- 분자 역학을 추적하는 것은 세포 과정을 이해하는 데 중요합니다.
- 분자의 고밀도 탐지 및 추적은 실험 정확도를 향상시킵니다.
- 이미지 분석 전문가와의 협력은 알고리즘 개발을 개선합니다.
연구 목적
- 분자를 추적하기 위한 사용자 친화적인 알고리즘을 개발합니다.
- 막 단백질의 나노스케일 역학을 조사합니다.
- 표피 성장 인자 수용체를 이 기술의 모델로 사용합니다.
사용된 방법
- 전용 추적 알고리즘의 개발.
- 단일 클론 항체를 사용한 표피 성장 인자 수용체 태깅.
- 양자 점 연결을 위한 항체 단편의 바이오틴화.
- 고급 이미징 기술의 데이터 수집에의 활용.
주요 결과
- 알고리즘은 실시간으로 라벨링된 분자를 성공적으로 추적합니다.
- 고밀도 탐지를 통해 막 역학의 상세한 분석이 가능합니다.
- 이 방법은 막관통 단백질의 행동에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 전문가와의 협력은 연구 결과의 견고성을 향상시킵니다.
결론
- 개발된 알고리즘은 막 단백질을 추적하는 데 효과적입니다.
- 이 기술은 세포 역학의 이해를 발전시킬 수 있습니다.
- 향후 응용 분야에는 다양한 막관통 단백질이 포함될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Mapping molecular diffusion in the plasma membrane enables precise characterization of receptor dynamics, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. By providing high-density, single-molecule tracking data, Multiple-Target Tracing (MTT) enhances predictive confidence in understanding protein interactions and confinement events critical for signaling pathway analysis. This approach addresses a key discovery-stage challenge: obtaining quantitative, spatially resolved insights into membrane organization that inform lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping receptor localization, mobility, and confinement patterns at nanometer scale.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of receptor interactions with signaling partners or scaffolds.
- Predictive Value: Generates quantitative descriptors such as diffusion coefficients and confinement indices to assess target behavior under physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline receptor dynamics in live cells.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through high-density detection and algorithmic trace reconnection.
- Scalability: Facilitates platform reuse across membrane protein targets due to MTT’s applicability at any scale, from molecules to cells.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase membrane dynamics to preclinical validation by enabling comparison of receptor behavior across model systems.
- Mechanistic De-risking: Identifies confinement variations that may reflect underlying interactions with cytoskeleton or lipid domains, reducing ambiguity in target mechanism.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides dynamic measures that complement complementary approaches like FRAP or FCS for informed go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
MTT fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a reusable capability for studying membrane protein dynamics across multiple projects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying receptor confinement, slowdown, and interaction signatures in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through high spatiotemporal resolution and quantitative outputs like peak intensity and signal-to-noise ratio.
- Analytics: Provides statistical outputs including local diffusion values and confinement indices that enable cross-condition comparison and trajectory classification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing dynamic measures to be compared with orthogonal techniques for target validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a standardized tracking algorithm applicable to diverse transmembrane proteins, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct nanoscale observation of receptor dynamics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated peak detection, estimation, and reconnection with deflation to handle high-density labeling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by supplying quantitative, replication-ready data that reduce late-stage biological risk in target advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by delivering dynamic membrane phenotype data that inform target selection and resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule videomicroscopy and image analysis for optimal setup and parameter tuning.
- Depends on instrumentation capable of high-speed, low-noise acquisition, including EM-CCD cameras and mercury lamp illumination.
- Necessitates cross-team standardization of labeling protocols, quantum dot conjugation, and imaging conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying MTT to different model systems or membrane protein targets beyond EGFR.
- Includes practical limitations such as the need for high labeling density and manageable signal-to-noise ratios to ensure accurate peak detection and trace reconnection.
