전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

전환이 anaphase-추진 단지 (APC / C)에 의존 ubiquitination과 여기 cyclin B.의 후속 파괴를, 우리는, 펄스 - 체이스 라벨에 따라, 시스템을 설립 전체 세포 인구에서 cyclin B의 proteolysis를 모니터링 할 수 있으며를 통해 실행됩니다 anaphase에 Metaphase mitotic 검문소에 의한 간섭의 검색을 용이하게한다.

이 절차의 목적은 사이클링 B의 단백질 분해가 아나페이즈 발병 및 유사분열 종료를 어떻게 조절하는지 모니터링하는 것입니다. 이는 현미경 슬라이드에 사이클링 B 스냅 리포터 셀을 먼저 시딩하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 키메라 Cyclin B 스냅 리포터 분자를 형광 기질 TMR 별로 라벨링하는 것입니다.

다음으로, 이미지 시리즈는 현미경 스테이션에서 획득됩니다. 마지막 단계는 세포를 분석하고 사이클링 B 단백질 분해를 반영하는 시간 경과에 따른 TMR 별 형광 강도를 계산하는 것입니다. 궁극적으로, 살아있는 리포터 세포의 면역형광 현미경 검사는 유사분열 중에 일어나는 사이클링 B 단백질 분해의 동역학을 보여줍니다.

사이클론 BGFP 모니터링과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 사이클론 B SNAP을 통해 전체 단백질 발현이 아닌 사이클론 B 분해를 모니터링할 수 있다는 것입니다. 이 실험을 위한 스냅 리포터 셀은 처음에 최소 48시간 동안 로그 단계에서 비동기적으로 성장할 수 있습니다. 먼저, 트립신 파종 절차는 챔버 원심분리기의 전체 표면에 걸쳐 일정한 분포로 8개의 웰 현미경 챔버에 세포를 파종하기 위한 sub confluence snap reporter 세포입니다.

10, 000 세포 및 Resus는 350 마이크로 리터, 페놀 레드 무료 정상 성장 매체에 지출합니다. 세포 현탁액을 현미경 챔버로 옮겨 챔버 중앙에서 최대 세포 밀도를 가진 8개의 웰 현미경 챔버에 세포를 파종합니다. 먼저 챔버에 300 마이크로 리터의 페노 레드 프리 정상 성장 배지를로드합니다.

다음으로, 5, 96에 세포의 씨를 뿌리기를 위한 현미경 약실의 센터에 000의 세포를 주의깊게 추가하십시오. 좋은 분리기, 5, 000의 세포의 전체적인 표면에 일정한 배급에 좋은 특별한 광학 판은 요구된 우물을 포함하는 세포의 총계에 따라서 석탄산 빨간 자유로운 정상적인 성장 매체의 300 마이크로리터에서 resuspend한다. 세포 수와 현탁액 매체의 총 부피를 조정합니다.

그런 다음 세포 현탁액을 96웰 플레이트로 옮겨 96에 세포를 파종합니다. 우물 중앙에 최대 세포 밀도를 가진 특수 광학 플레이트. 주의깊게 1개, 500의 세포를 각 우물의 센터에 작은 하락에 있는 페놀 빨간 자유로운 정상적인 성장 매체의 15 마이크로리터에 추가하십시오.

이것은 세포의 성장을 웰의 중앙으로 제한합니다. 염색 절차를 시작하기 30분 전에 표준 세포 배양 조건에서 모든 파종된 세포가 최소 18시간 동안 성장하도록 합니다. 페놀 레드 프리 정상 성장 매체에서 섭씨 37도의 워밍업 쿼트.

이 데모의 스냅 기판은 TMR 스타 원액의 400 마이크로몰 희석 0.5 마이크로리터 농도의 원액을 얻기 위해 DMSO에서 TMR 별에 용해된 TMR 별을 쉽게 취급할 수 있는 TMR 별입니다. 200 마이크로 리터의 따뜻한 페놀 레드 무료 정상 성장 배지에서 1 마이크로 몰의 최종 라벨링 농도를 얻습니다. 다음으로, 비동기식으로 성장하는 세포에서 정상 성장 배지를 제거하고 표준 배양 조건에서 25분 동안 라벨링 배지에서 세포를 라벨링 배지 배양으로 교체합니다.

25분 후, 라벨링 배지를 제거하고 따뜻한 페놀 레드 프리 정상 성장 배지로 세포를 4번 세척합니다. 최종 세척 후, 현미경으로 운반하기 전에 300마이크로리터의 따뜻한 페놀 레드 유리 정상 성장 배지에서 세포를 30분 동안 배양합니다. 배지를 신선하고 따뜻한 페놀 레드 프리 정상 성장 배지로 교체하여 섭씨 37도의 예열 블록에서 스티로폼 상자의 현미경으로 잔류 언바운드 스냅 기질 운반 세포를 제거합니다.

형광 강도를 측정하기 2시간 전에 온도 변화를 최소화합니다. 건조 모드에서 기후 챔버의 공기 온도를 섭씨 37도로 조정하여 현미경과 모든 구성 요소를 원하는 온도로 가져옵니다. 응결 및 현미경의 후속 손상을 방지하려면 습도를 설정하기 전에 예열하는 것이 중요합니다.

전체 현미경 시스템이 섭씨 37도에 도달하면 공기 습도를 60%로, 이산화탄소를 5%로 조정합니다.스캔 또는 수집 소프트웨어를 시작하고 표준 설정을 정의합니다. 분석할 웰의 위치를 정의합니다. 델타 T 또는 수집 주기 시간과 수집 주기의 절대 수를 정의합니다.

이 데모에서. 하드웨어 자동 초점은 더 많은 수의 웰을 분석하기 위해 미리 선택되어 있습니다. 획득을 시작하고 처음 두 개의 획득 주기 동안 감독합니다.

현미경은 히스톤 H 두 GFP 신호에 초점을 맞추고 필터를 변경하고 해당 TMR 별 이미지를 획득하기 전에 해당 채널에서 첫 번째 이미지를 이후에 획득합니다. 이것은 우물 내의 모든 위치와 다음 주기를 반복하기 전에 검사할 각 우물에 대해 반복되는 것입니다. 다시. 단백질 분해 프로파일을 분석하려면 스캔 R 분석 소프트웨어를 시작하십시오.

히스톤 H 2 GFP에 의해 시각화된 세포핵으로 이미지를 분석하며, 신호 강도를 기반으로 한 임계값과 유역 알고리즘을 사용하여 주변 세포를 분리하는 데 도움이 되는 주요 물체로 정의됩니다. TMR 별 분석을 위해 세포질이 있는 핵으로 구성된 하위 물체를 생성해야 합니다. 주요 물체의 중요한 속성은 X 및 Y 위치, 시간 및 최대, 주 물체에 대한 GFP의 평균 강도와 총 강도를 면적으로 나눈 값입니다.

TMR 별 하위 물체의 경우 추적 모드로 변경하여 하위 물체 평균 TMR 별 형광 강도 또는 분석된 주 물체에 할당된 셀 추적을 시각화합니다. 더 많은 수의 세포를 살펴보면 첫 번째 대표적이고 객관적인 견해를 가질 수 있지만, 검사 할 세포의 수는 최소 140 사이클 동안 지속되고 큰 최대 히스톤 H 2 GFP 강도를 포함하는 측정에 게이팅하여 좁힐 수 있습니다. 관심 세포 추적을 선택하여 단일 세포 수준에서 형광 히스톤 H, 2개의 GFP 및 TMR 별을 동시에 시각화합니다.

마우스 오른쪽 버튼을 사용하여 관심 있는 셀을 클릭하고 내보낼 수 있는 사진을 생성합니다. 히스톤 H 두 GFP 및 사이클링 B 스냅 TMR 스타의 일러스트레이션을위한 갤러리. 스캐너 분석 소프트웨어의 모집단 모드로 포인트 변경하고 관심 셀이 점 블롯에 표시되는 영역을 게이트합니다.

게이트 영역에 새 점도표 창을 적용하고 시간 경과에 따른 평균 TMR 별 형광 강도를 시각화합니다. 추가 계산을 위해 데이터를 Microsoft Excel로 내보냅니다. 여기의 그림은 핵막 파괴 후 세포질의 압축 시 염색체 정렬 불량의 징후 없이 염색체 정렬 불량의 징후 없이 진행하는 세포의 TMR 별 형광 강도 곡선으로 표시되는 Cyclin B 역학을 묘사합니다.

세포가 전중기에 진입할 때 형광 강도는 세포가 전단계와 중기를 거치는 한 안정적인 수준으로 유지된 다음 급격히 떨어지기 시작합니다. 모든 염색체가 안정적인 중상판(metaphase plate)을 형성하면 이 드롭은 염색체 분리에 선행합니다. 후기 유사분열에서 곡선의 파란색 점으로 표시된 anaphase 동안 염색질은 응축을 시작하고 세포는 위상 형태학으로 채택됩니다.

형광 강도 곡선은 발달 후 유사 분열 전의 고원보다 낮은 고원에 접근합니다. 이 기술은 유사분열 분야의 연구자들이 유사분열 진행을 조절하는 사이클링, 분해 및 합성 사이의 긴밀한 균형을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.