Name: 전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 배우세요 생세포에서 Cyclin B 단백질 분해를 형광 기반 방법으로 실시간 모니터링하는 기술입니다. 이 방법은 세포 주기 조절 메커니즘과 암 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리는 pLPCX-히스톤 H2-GFP 플라스미드를 제공 S. 테일러에게 감사합니다. 우리는 지속적인 지원 R. Mertelsmann 감사드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft에 의해 지원되었다.

1. 현미경 상공 회의소 슬라이드에 U2OS 기반 Cyclin B-SNAP 리포터 세포 (클론 11 셀 6) 심는 <ol><li> 최소 48 시간의 로그 단계에서 비동기 적으로 성장 할 수 있었다 subconfluent SNAP 기자 세포를 Trypsinize. </li><li> 8 잘 현미경 챔버 (세포의 지속적인 배포)과 함께 일하는 것. </li></ol> 현미경 챔버의 전체 표면 원심 분리기 만 세포에서 일정한 분포 8 잘 현미경 챔버에 세포를 퍼 뜨리고 및 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체의 350 μl (10 % 태아 소 혈청, 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충에 resuspend에 대한 나트륨 pyruvate). 현미경 챔버 (그림 2)에 세포 현탁액을 전송합니다. 8 잘 현미경 챔버 (중앙에 최대 세포 밀도)의 협력을 참조하시기 바랍니다. 현미경 chamb의 중심에 높은 밀도로 세포의 퍼 뜨리고 들어음, 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 300 μl로 챔버를로드합니다. 현미경 챔버의 중심 (그림 2)주의 깊게 5,000 셀을 추가합니다. 96 잘 특별 광학 플레이트 (세포의 지속적인 배포)과 함께 일하는 것. 잘의 전체 표면에 걸쳐 일정한 분포에서 96 잘 플레이트로 세포의 퍼 뜨리고를 들어, 5,000 세포를 원심 분리기와 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 300 μl에 resuspend. 96 - 웰 플레이트에 세포 현탁액을 전송합니다. 필요한 세포 함유 우물의 총 수에 따라 휴대폰 번호 및 정지 매체의 총 부피 (그림 2)를 조정할 수 있습니다. 96 잘 특별 광학 플레이트 (중앙에 최대 세포 밀도)의 협력을 참조하시기 바랍니다. 96 잘 플레이트로 세포의 시딩를 들어, 신중하게 smal에 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체의 15 μl에 1,500 셀을 추가잘의 중심 (그림 2)에 세포의 성장에 제한을 달성하기위한 각도의 중심부에 난 드롭. <ol start="3"><li> 시드 세포 표준 세포 배양 조건 (37 ° C, 100 % 공기 습도, 5 % CO 2)에 따라 최소 18 시간에 성장 할 수 있습니다. </li></ol> 2. SNAP 기판과 리포터 세포의 착색 <ol><li> 전에 착색 절차의 시작 부분에 30 분은 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체의 aliquots 37까지 따뜻하게 할 수 있습니다 ° C. </li><li> SNAP 기판의 취급이 용이합니다 (우리의 경우 TMR 스타에서) -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 400 μm의 주식 솔루션에 집중을 얻기 위해 DMSO에 TMR 스타를 해산 </li><li> 이전 착색에, 1 μm의 최종 라벨 농도를 얻기 위해 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C) 200 μl에 TMR 스타 주식 솔루션의 0.5 μl를 희석. </li><li> 비동기 적으로 성장하는 세포의 정상적인 성장 매체를 제거하고 리터에 품다표준 문화 조건에서 25 분을 위해 매체를 abeling. </li><li> 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C)와 중간 및 세척 세포 네 번 라벨 제거합니다. 30 분을위한 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C) 300 μl에 세포를 배양. 이전 현미경을 운반에 잔류 언 바운드 SNAP 기판을 제거하는 신선한 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C)와 매체를 교체하십시오. </li><li> 미리 예열에 스티로폼 상자에 현미경으로 전송 셀 (37 ° C) 온도 편차를 최소화하기 위해 열 블록. </li></ol> 3. 형광 강도 측정 <ol><li> 전에 분석에 두 시간 ° C 건조 모드에서 원하는 온도로 모든 구성 요소를 사용하여 전체 현미경을 가져다하기 위해 37 기후 챔버의 공기 온도를 조정합니다. 사전 가열 습도를 설정하기 전에 현미경에 결로 및 후속 손상을 방지하는 것이 중요합니다. </li><li> 공기 습도 t을 조정O 60% 및 분석의 시작하기 전에 CO 2-5%. </li><li> 스캔 ^ R 취득 소프트웨어를 시작하고 표준 설정 (표 1 참조) 정의합니다. </li><li> 분석 할 우물의 위치를​​ 정의합니다. </li><li> Δt (수집 사이클 타임) 및 취득주기의 절대 수를 정의합니다. </li><li> 우물의 더 많은 분석이 필요하다면, 하드웨어 자동 초점을 선택, 그렇지 않으면 혼자 소프트웨어 자동 초점을 사용하기에 충분합니다. </li><li> 인수를 시작하고 처음 두 인수 사이클에 대해 감독한다. 필터가 변경되어 해당 TMR 스타 이미지 (그림 3) 인수되기 전에 현미경 해당 채널의 첫 번째 이미지의 후속 취득과 함께 히스톤 H2-GFP 신호에 초점을 맞출 것이다. 이것은 다시 다음주기를 반복하기 전에 잘 내의 검사 할 우물의 각에 대한 모든 위치에 대해 반복됩니다. </li></ol> 4. Proteolytic 프로필 U 분석스캔 ^ R을 노래 <ol><li> 스캔 ^ R 분석 소프트웨어를 시작하고 세포 핵으로 이미지를 분석과 같은 신호 강도와 인근 세포를 분리하는 데 큰 도움이 분수령 알고리즘을 기반으로하는 임계 값을 사용하여, 주요 개체로 정의 된 히스톤 H2-GFP에 의해 시각화. 세포질과 핵으로 구성된 subobject는 TMRstar 분석을 위해 생성되어야합니다. (주 객체의 중요 속성 X와 Y 위치, 시간, 및 최대이며 주요 개체와 TMRstar subobject을위한 영역으로 나눈 전체 강도에 대한 GFP의 농도를 의미합니다.)이 분석 과정은 큰 데이터로 인해 몇 시간이 걸릴 수 있습니다 수량. </li><li> 분석 주요 개체 (그림 4)에 할당 된 시간이 지남에 따라 subobject 말은 TMR 별 형광 강도를 (셀 추적), 시각화 모드를 추적 변경합니다. 검사 할 셀의 수는 적어도 140 사이클을 지속 해당 측정에 게이팅 의해 H2-GFP의 높은 최대 강도로 좁혀 할 수 있습니다. 찾고세포의 큰 숫자에 첫 번째 대표하고 객관적인보기 (그림 4) 있습니다. </li><li> 단일 세포 수준 (그림 5A)에서 동시에 히스톤 H2-GFP 및 TMR 스타 형광를 시각적으로 관심 셀 추적을 선택합니다. </li><li> 관심있는 셀을 마우스 오른쪽 클릭을 사용하고 히스톤 H2-GFP 및 cyclin B-SNAP 매번 지점에 대한 TMR 스타의 그림에 내보낼 사진 갤러리를 생성합니다. </li><li> 스캔 ^ R 분석 소프트웨어 및 게이트 관심 셀이 X 대 Y 점 플롯 (그림 5B)에 표현된다 지역의 인구 모드로 변경합니다. </li><li> 게이트 지역에 새로운 점 플롯 창을 적용하고 시간이 지남에 따라 TMR 스타 형광 강도 (그림 5C)를 의미 표시합니다. </li><li> 자세한 계산 용 Microsoft Excel로 내보내기 데이터 (시간과 형광 강도). </li></ol> 5. 대표 결과 무화과우레 5D와 5E 호야는 셀의 TMR 별 형광 강도 곡선으로 표현 cyclin B 동력학을, 묘사 그 염색체 misalignment의 흔적 (그림 5E 호야)없이 일반 유사 분열을 통해 진행. 셀 prometaphase 6 입력 할 때 isomorphic 창 (다이어그램에서 밝은 영역)에 도달 할 때까지 핵 봉투 고장 (NEBD 등 빨간색 삼각형으로 표시)에 따라 세포질의 압축되면, TMR 스타 형광 강도는 갑작스런 증가를 보여줍니다. 형광 강도는 prophase와 metaphase를 통해 셀 수익금만큼 안정적인 수준으로 유지 한 후 염색체의 모든 (그림 5D와 5E 호야) 안정적인 metaphase 플레이트를 설립 한 후 빠른 속도로 떨어지기 시작합니다. 이 드롭 anaphase (곡선에 파란색 점) 동안 염색체 분리를 앞에. 후반 유사 분열에서 염색질은 decondense 시작 (파란색 바)과 형광 강도 곡선이 접근하는 동안 셀은 계면 형태를 채택유사 분열 (그림 5D와 5E 호야) 전 고원보다 낮은 고원. <table border="1"><tbody><tr><td> 자동 초점 설정 </td><td> 히스톤 H2-GFP (주 객체 수집 설정) </td><td> TMR 스타 라벨이 Cyclin B-SNAP (수집 설정) </td><td> 취득주기 시간 반복 </td></tr><tr><td> 거친 자동 초점 + / -39 μm 24 층 정밀 자동 초점 + / -5.4 μm 14 층 </td><td> GFP 필터 설정 : 노출 시간 : 100 밀리 초 빛의 세기 : 25 % </td><td> TRITC 필터 설정 : 노출 시간 : 150 밀리 초 빛의 세기 : 33.3 % </td><td> 2-5 분. </td></tr><tr><td> GFP 필터 설정 : 노출 시간 : 12 밀리 초 빛의 세기 : 12.5 % </td><td></td><td></td><td> 최대 지속적인 분석의 48 시간 (60 %의 감소 공기 중 습도에 의해 제한)에 </td></tr></tbodY&gt; </table> 표 1. cyclin B의 proteolysis의 분석에 사용 된 표준 설정입니다. 히스톤은 H2-GFP는 cyclin B-SNAP 형광 강도의 측정을 위해 초점 비행기를 정의하는 참조 구조로 사용되었다. 누적 광독성을 피하기 위해 이미지 수집 설정에 비해 초점 절차를 수행하는 동안 광도가 낮은 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> 1 그림. 내생 단백질과 유사한 열화 특성과 키메라 cyclin의 B 유도체의 표현을 통해 cyclin B의 proteolysis의 측정의 개략도. 펄스 - 체이스 라벨 후 형광 강도의 하락은 APC / C-활동을 측정하기위한 한 방법입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> 그림 2. 8도 슬라이드 또는 96 잘 접시에 세포의 분석.의 정기 배포우물의 표면에 걸쳐 셀 300 μl의 최종 볼륨에 resuspension에 의해 달성된다 만 단일 또는 몇 위치를 수동으로 분석을 위해 정의되는 경우 권장합니다. 중심 지역에서 세포의 농축은 prefilled 또는 빈 우물의 중심에 셀의 추가에 의해 달성된다. 이 기술은 다른 우물의 자동 이미지 수집의 경우 권장합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> 그림 3. 데이터 수집의 순서가. 히스톤 H2-GFP의 A) 검색이 유사 분열 동안 염색체 정렬의 초점 평면 정의 및 모니터링에 사용됩니다. B) TMR 스타 형광 강도의 형광 강도는 cyclin B-SNAP 표시된 펄스 체이스의 절대 금액을 측정하기위한 한 방법입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> 4 그림. 평균 TMR 별 대표 스캔 ^ R 분석 소프트웨어 기반의 묘사시간이 지남에 따라 형광 강도 (면적으로 나눈 총 TMRstar 강도). 대표 셀 추적 (파란색)의 선택. 해당 이미지 (오른쪽에 표시)의 동시 시각화를 허용 히스톤 H2-GFP (녹색)와 cyclin B-SNAP (빨간색). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> 그림 5. A + B) XY-점 음모에 관심있는 셀을 나타내는 점의 게이팅을위한 예. C) 시간이 지남에 따라 평균 TMRstar의 형광 강도 (면적으로 나눈 총 TMRstar 강도)의 시각화는 점 플롯을 사용합니다. D + E) Microsoft Excel에서 생성으로 NEBD (핵 봉투 고장)와 염색질 decondensation (파란색 막대) 사이 isomorphic 창 (그림에서 brigher 필드)와 cyclin B-SNAP 대표 형광 강도 곡선. Anaphase는 t로 표시됩니다곡선에서 그는 파란색 점은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 영화는 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">보완 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol><li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li>
<li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregating+sister+genomes%3A+the+molecular+biology+of+chromosome+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li>
<li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li>
<li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instabilities+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li>
<li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li>
<li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+APC%2FC+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li>
<li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li>
<li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li>
<li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li>
<li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 여기 cyclin B의 proteolysis 및 염색체 정렬의 동시 모니터링을 용이하게 라이브 셀 이미징 기반의 접근 방식을 제시한다. 이 방법은에서 mitotic 컨트롤의 연구는 단일 세포 수준에서 세포 인구를 교란되지 않은 수 있습니다. Cyclin B 저하 곡선은 APC / C의 활동에 직접 통찰력을 촉진하므로 간접적으로 SAC 6의 상태를 반영합니다. 이 방법은 비록 스캔 ^ R 소프트웨어를 기반으로 설립, 쉽게 비교 현미경 역에서 재현 할 수 있습니다. 또한, 우리 retroviral cyclin B-SNAP의 표현 구조를 사용하여 기자 셀 라인은 쉽게 원하는 셀 라인에 안정적인 retroviral 통합에 의해 설립 될 수 있습니다. 시스템이보다 유연하게하려면, 키메라 SNAP 단백질은 다양한 fluorochromes 물들 할 수 있습니다. 모니터링 염색체의 정렬, faci에서의 요구 사항...

<table border="1"><tbody><tr><td> 제품의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 리포터 세포 라인 </td><td> 생성 자체는 6 설명 </td><td> 11 기자 세포를 복제 (U2Os 기반 cyclin B-SNAP 표현 세포) </td><td></td></tr><tr><td> Retroviral cyclin B-SNAP 표현 벡터 </td><td> 생성 자체는 6 설명 </td><td> pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred 무료 DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> FCS, 나트륨 pyruvate, 페니실린 / strepto-mycin과 보완 필요 </td></tr><tr><td> SNAP-세포 TMR-스타 </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> S9105S </td><td> DMSO의 주식 솔루션을 400 μM </td></tr><tr><td> 특별 Opstics 판, 잘 96 </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-슬라이드 8 잘 ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80,826 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 단위 </td><td> 하늘 </td><td> 기후 챔버와 IX-81 역 현미경 </td><td></td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 하늘 </td><td> UPLSAPO 20x 목적 (NA 0.75) </td><td></td></tr><tr><td> 수집 소프트웨어 </td><td> 하늘 </td><td> 스캔 ^ R 취득 소프트웨어 (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> 분석 소프트웨어 </td><td> 하늘 </td><td> 스캔 ^ R 분석 소프트웨어 (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 cyclin b의 proteolysis 유학

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

세포 분열 동안 두 딸 세포 사이의 염색체의 동등한 배포 유전자 안정성 1 보장을위한 전제 조건입니다. 염색체 분리시 부정확 한이 종의 특징이며 진행성 질환 2-4와 관련된. 스핀들 조립 검사 점 (SAC)는 모든 단일 염색체는 mitotic 스핀들 1 안정적인 바이폴라 첨부 파일을 확립 할 때까지 다시 metaphase에서 세포를 보유하고 mitotic 감시 메커니즘입니다. SAC는 활성화와 간섭에 의해 그 기능을 발휘 APC / C securin와 cyclin B의 proteolysis하므로 염색체 분리와 mitotic 출구를 차단하는 subunit Cdc20. 염색체의 부적절한 첨부 파일 SAC 신호의 입을 방지하고 문제가 염색체 missegregation, aneuploidy와 악성 growths 일을 피하기 위해 해결 될 때까지 APC / C Cdc20의 지속적인 억제가 발생합니다. 내가 연설을 대부분의 연구APC / C에 의존 proteolysis에 부적절한 염색체 첨부 파일의 nfluence는 미소로 염색체 첨부 파일을 방해하는 약물을 depolymerizing 또는 미세 소관 - 안정화를 사용하여 스핀들 혼란을 이용했다. 미세 소관의 동력학과 간섭이 교통 및 중요한 규제의 국산화에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이러한 절차는 인공 효과, 5를 일으킬 위험을 맺습니다. SAC는에서 유사 분열 동안 APC / cyclin B의 C-의존 proteolysis을 방해하는 방법 공부하는 세포 집단을 교란되지 않은, 우리는 허용 히스톤 H2-GFP-기반 시스템을 설립 metaphase mitotic 염색체의 정렬 및 cyclin B 6 proteolysis의 동시 모니터링 . proteolytic 프로필을 묘사하기 위해, 우리는 C-터미널 SNAP 잔기 6 (그림 1) 키메라 cyclin의 B 기자 분자를 생성. 자체 라벨 반응에서 SNAP-잔기가 함께 공유 결합 채권을 형성 할 수 있습니다alkylguanine - 반송파 (SNAP 기판) 7,8 (그림 1). SNAP 기판 분자 쉽게 사용할 수 있으며 다른 fluorochromes의 폭 넓은 스펙트럼을 가지고 다니십시오. 키메라 cyclin B-SNAP 분자는 성장 매체 7 (그림 1)에 막 투과성 SNAP 기판의 추가에 표시됩니다. 라벨 반응 후, cyclin B-SNAP 형광 강도는 펄스 추격전 반응과 같은 방식으로 형광 강도 cyclin B 저하 6 (그림 1)의 수준을 반영에 떨어. Google 시스템은 병렬 셀 (또는 여러 세포 집단)의 큰 숫자 mitotic APC / C에 의존 proteolysis의 모니터링을 용이하게한다. 따라서, 시스템은 에이전트 / 전환을 anaphase 할 metaphase에서 proteolytic 활동을 방해 할 수있는 작은 분자를 식별 할 수있는 귀중한 도구가 될 수 있습니다. 또한, 유사 분열 동안 cyclin B의 합성으로 최근 중요한 mechanis으로 제안 된안정적인 cyclin B 표현 수준 9,10를 유지하여 마우스와 인간의 mitotic 블록을 조성하는데있어,이 시스템은 우리가 균형 잡힌 평형 6 항 중 어느 한 요소로 cyclin의 B의 proteolysis를 분석 할 수있게.

전환이 anaphase-추진 단지 (APC / C)에 의존 ubiquitination과 여기 cyclin B.의 후속 파괴를, 우리는, 펄스 - 체이스 라벨에 따라, 시스템을 설립 전체 세포 인구에서 cyclin B의 proteolysis를 모니터링 할 수 있으며를 통해 실행됩니다 anaphase에 Metaphase mitotic 검문소에 의한 간섭의 검색을 용이하게한다.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

세포 분열 과정에서 두 딸세포 사이의 염색체 균등 분배는 유전적 안정성을 보장하기 위한 필수 전제 조건입니다 1. 부정확한...

본 절차의 목적은 cycling B의 단백질 분해가 후기 시작과 유사분열 종료를 어떻게 조절하는지 모니터링하는 것입니다. 이를 위해 먼저 microscopy 슬라이드에 cycling B snap reporter 세포를 분주합니다. 두 번째 단계는 chimeric Cyclin B snap reporter 분자를 형광 기질인 TMR star로 표지하는 것입니다.다음으로, 현미경 스테이션에서 이미지 시리즈를 획득합니다. 마지막 단계는 세포를 분석하고 시간에 따른 TMR star 형광 강도를 계산하는 것이며, 이는 cycling B 단백질 분해를 반영합니다. 궁극적으로, 살아있는 리포터 세포의 면역형광 현미경 관찰을 통해 유사분열 중에 일어나는 cycling B 단백질 분해의 역학을 밝혀낼 수 있습니다.cyclone B GFP 모니터링과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, cyclone B SNAP을 통해 전체 단백질 발현이 아닌 cyclone B의 분해 과정을 모니터링할 수 있다는 점입니다. 본 실험을 위한 snap 리포터 세포는 우선 로그 성장기에서 최소 48시간 동안 비동기적으로 성장하도록 합니다. 시작 단계로, 챔버 원심분리기 표면 전체에 세포가 균일하게 분포되도록 8-웰 현미경 챔버에 sub confluence 상태의 snap 리포터 세포를 분주하기 위한 트립신 처리 과정을 수행합니다.10,000개의 세포를 페놀 레드(phenol red)가 없는 일반 성장 배지 350 µL에 현탁합니다. 세포 현탁액을 현미경 챔버로 옮겨 8웰 현미경 챔버에 세포를 파종하며, 이때 챔버 중앙의 세포 밀도가 최대가 되도록 합니다. 먼저 챔버에 페놀 레드(phenol red)가 없는 일반 성장 배지 300 µL를 채웁니다.다음으로, 96-웰 특수 광학 플레이트의 웰 전체 표면에 걸쳐 세포를 일정하게 분포시켜 시딩하기 위해 5,000개의 세포를 현미경 챔버 중앙에 조심스럽게 첨가합니다. 필요한 세포 함유 웰의 총 개수에 따라 5,000개의 세포를 원심 분리하고 300 µL의 페놀 레드 프리 일반 성장 배지에 재현탁합니다. 세포 수와 현탁 배지의 총 부피를 조절하십시오.그 다음, 웰 중심부에 최대 세포 밀도를 형성하며 세포를 파종하기 위해 세포 현탁액을 96웰 플레이트로 옮깁니다. 페놀 레드(phenol red)가 없는 일반 성장 배지 15 µL에 1,500개의 세포를 넣어 각 웰의 중심부에 작은 방울 형태로 조심스럽게 첨가합니다.이렇게 하면 세포 성장이 웰의 중앙으로 제한됩니다. 염색 절차를 시작하기 30분 전까지, 모든 파종된 세포를 표준 세포 배양 조건에서 최소 18시간 동안 배양하십시오. 페놀 레드(phenol red)가 없는 일반 성장 배지를 37 °C로 예열하십시오.본 시연에서 사용되는 snap 기질은 취급이 용이한 TMR star입니다. DMSO에 TMR star를 녹여 400 micromolar 농도의 스톡 용액을 제조하십시오. TMR star 스톡 용액 0.5 microliters를 phenol red가 없는 따뜻한 일반 성장 배지 200 microliters에 희석하여 최종 표지 농도가 1 micromolar가 되도록 합니다. 다음으로, 비동기적으로 성장하는 세포에서 일반 성장 배지를 제거하고 표지 배지로 교체하십시오. 표준 배양 조건 하에 세포를 표지 배지에서 25분 동안 배양합니다.25분 후, 라벨링 배지를 제거하고 따뜻한 phenol red free 일반 성장 배지로 세포를 4회 세척합니다. 마지막 세척 후, 현미경으로 옮기기 전 따뜻한 phenol red free 일반 성장 배지 300 microliters에서 세포를 30분 동안 배양합니다. 결합되지 않은 잔류 snaps 기질을 제거하기 위해 배지를 신선하고 따뜻한 phenol red free 일반 성장 배지로 교체합니다. 37 degree Celsius로 예열된 히팅 블록이 담긴 스티로폼 상자에 넣어 세포를 현미경으로 운반합니다.형광 강도를 측정하기 2시간 전에 온도 변화를 최소화하십시오. 현미경과 모든 구성 요소를 원하는 온도에 도달시키기 위해 클라이밋 챔버의 공기 온도를 건조 모드에서 37 °C로 조절하십시오. 응결로 인해 현미경이 손상되는 것을 방지하려면 습도를 설정하기 전에 예열하는 것이 중요합니다.현미경 시스템 전체가 37 °C에 도달하면, 공기 습도를 60%로, 이산화탄소를 5%로 조정하십시오. 스캔 또는 획득 소프트웨어를 시작하고 표준 설정을 정의합니다. 분석할 웰의 위치를 지정하십시오. delta T 또는 획득 주기 시간과 절대적인 획득 주기 횟수를 정의하십시오.본 시연에서는 더 많은 수의 웰을 분석하기 위해 하드웨어 자동 초점(autofocus)이 미리 선택되어 있습니다. 획득을 시작하고 처음 두 번의 획득 사이클을 모니터링하십시오.현미경은 histone H2 GFP 신호에 초점을 맞추고 해당 채널에서 첫 번째 이미지를 획득한 후, 필터를 변경하여 그에 해당하는 TMR star 이미지를 획득합니다. 이 과정은 웰 내의 모든 위치와 분석 대상인 각 웰에 대해 반복되며, 이후 다음 사이클이 다시 반복됩니다. 단백질 분해 프로파일을 분석하려면 scan R 분석 소프트웨어를 실행하십시오.신호 강도 기반의 임계값과 인접한 세포의 분리를 돕는 watershed 알고리즘을 사용하여, histone H2 GFP로 시각화된 세포핵을 메인 객체로 정의하여 이미지를 분석하십시오. TMR* 분석을 위해 세포질을 포함하는 핵으로 구성된 하위 객체를 생성해야 합니다. 메인 객체의 중요한 속성은 X 및 Y 좌표, 시간, GFP의 최대 및 평균 강도, 그리고 면적으로 나눈 총 강도입니다.TMR star 하위 객체의 경우, 추적 모드로 변경하여 시간 경과에 따른 하위 객체의 평균 TMR star 형광 강도 또는 분석된 주 객체에 할당된 세포 추적선을 시각화하십시오. 더 많은 수의 세포를 관찰하면 대표적이고 객관적인 초기 뷰를 얻을 수 있으나, 최소 140 cycle 동안 지속되고 최대 histone H two GFP 강도가 높은 측정값들만 게이팅하여 검토할 세포 수를 좁힐 수 있습니다. 관심 있는 세포 추적선을 선택하여 단일 세포 수준에서 histone H two GFP와 TMR star 형광을 동시에 시각화하십시오.마우스 오른쪽 버튼을 사용하여 관심 세포를 클릭하고 내보낼 수 있는 이미지를 생성합니다. 매 시점의 histone H2 GFP 및 cycling B snap TMR star를 예시하는 갤러리입니다. 스캐너 분석 소프트웨어를 인구 집단 모드로 변경하고, 도트 블롯(dot blot) 상에서 관심 세포가 표시되는 영역을 게이팅합니다.게이팅된 영역에 새로운 점 도표(dot plot) 창을 적용하고 시간에 따른 평균 TMR star 형광 강도를 시각화합니다. 추가 계산을 위해 데이터를 Microsoft Excel로 내보냅니다. 여기의 도표는 Cyclin B의 역학을 나타내며, 빨간색 삼각형으로 표시된 핵막 붕괴(nuclear envelope breakdown 또는 NEBD) 이후 세포질 응축 시 염색체 정렬 오류 징후 없이 정상적인 유사분열을 진행하는 세포의 TMR star 형광 강도 곡선으로 표현되었습니다. TMR staph 형광 강도는 등형 창(isomorphic window)에 도달할 때까지 급격히 증가하는 양상을 보입니다.세포가 전중기(prometaphase)에 진입하면 형광 강도는 세포가 전기(prophase)와 중기(metaphase)를 지나는 동안 안정적인 수준을 유지하다가 이후 급격히 감소하기 시작합니다. 모든 염색체가 안정적인 중기판(metaphase plate)을 형성하고 나면, 이러한 감소는 염색체 분리보다 먼저 일어납니다. 분열 후기(late mitosis) 곡선의 파란색 점으로 표시된 후기(anaphase) 동안, 염색질은 응축이 해제되기 시작하며 세포는 후기 형태를 띱니다.형광 강도 곡선이 고원에 도달하며, 이는 유사분열 전의 고원보다 낮은 수준입니다. 이 기술은 유사분열 분야의 연구자들이 유사분열 진행을 조절하는 사이클린의 분해와 합성 사이의 정밀한 균형을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

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