July 3rd, 2018
베타 세포 기능 혈액 포도 당 항상성, 칼슘 유입에 대 한 유전자 인코딩된 기자를 사용 하 여 단일 셀 해상도에서 계산 되는 중요 하다.
이 방법은 베타 셀 분야의 중요한 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 섬 내의 개별 베타 세포 중 이질(heterogen) IT 기능과 같은. 이 기술의 주요 장점은 베타 세포의 실시간 이미징이 제공하는 공간 및 시간 해상도입니다.
우리는 개별 베타 세포 내의 칼슘 진동을 포착할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 물고기를 안락사시킨 후, 칼슘과 마그네슘이 함유된 HBSS 용액이 들어 있는 Petrie 접시에 옮깁니다. 그런 다음 형광 램프와 빨간색 필터 큐브가 장착된 실체 현미경 아래에서 날카로운 집게를 사용하여 입에서 항문 지느러미까지의 피부를 자릅니다.
오른쪽의 절인 피부를 벗겨내면 복부가 드러나고 내장이 드러납니다. 그런 다음 적색 형광을 사용하여 베타 세포에서 mKO2 발현을 확인하고 섬을 찾습니다. 간 및 지방 세포와 같은 주변 조직을 조심스럽게 제거하여 1차 섬을 청소합니다.
섬을 다치게 하거나 찌르지 않도록 주의하십시오. 다음으로 HBSS 30마이크로리터를 유리 바닥 접시 중앙에 떨어뜨립니다. 그런 다음 절개된 섬을 드롭으로 옮깁니다.
HBSS의 경우 섬을 한 번 조심스럽게 씻은 다음 30마이크로리터의 피브리노겐 작용 용액을 사용하여 한 번 씻습니다. 세포 사멸을 초래할 수 있는 세척 단계 중에 섬을 건조하지 마십시오. 천천히 그리고 부드럽게 트롬빈 용액 10 밀리리터당 10 단위의 10 마이크로 리터를 섬에 첨가하십시오.
섬과 접시를 15-20분 동안 손대지 않고 그대로 두십시오. 피브리노겐 트롬빈 방울이 점성이 있고 안정되는 것을 관찰하십시오. 트롬빈이 피브리노겐 용액에서 중합될 수 있도록 충분한 시간이 주어져야 합니다.
그렇지 않으면 금형이 이미징 세션 중에 안정성을 제공하지 않습니다. GCaMP 형광의 생체 외 실시간 이미징을 수행하려면 금형 위에 200마이크로리터의 HBSS를 추가하고 접시를 컨포칼 현미경의 플레이트 홀더에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 20X 0.8 NA 오류 목표와 명시야 옵션을 사용하여 섬을 찾습니다.
적색 형광 필터를 사용하여 베타 세포의 핵 mKO2 형광을 보면 섬에 초점을 맞춥니다. 개별 핵이 명확하게 보여야 합니다. Z축을 따라 섬의 두께를 통해 수동으로 이동하여 명확한 이미징 평면을 찾습니다.
이미징 평면에 이미징을 위한 50-100개의 베타 세포가 포함되어 있고 핵 mKO2 형광의 밝기가 특히 섬의 중앙에서 균일한지 확인합니다. 다음으로 스마트 설정 메뉴에서 다음 설정을 사용하여 GCaMP6 및 mKO2 형광에 대한 순차 획득을 설정합니다. GCaMP6의 경우 488나노미터의 여기와 500-555나노미터의 대략적인 방출을 선택합니다.
거짓 색상에서 GFP를 선택합니다. mKO2의 경우 561나노미터의 여기와 570-630나노미터의 방출을 선택합니다. 거짓 색상으로 mCherry를 선택합니다.
획득 모드에서 이미지 해상도를 1, 024 x 1, 024 픽셀, 속도를 10, 평균 1로 설정합니다. Time Series에 대한 옵션을 선택하고 프레임당 약 2초의 획득 시간으로 지속 시간을 500 사이클로 설정하여 연속 기록을 시작합니다. 이미징 주기를 주시하십시오.
이미지 획득을 방해하지 않고 처음 50프레임 후에 섬을 잡고 있는 젤 위에 5마이크로리터의 200밀리몰 D-포도당 용액을 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 10 밀리몰 포도당에서 150 프레임을 획득합니다. 시계열의 처음 50개 프레임은 5밀리몰 포도당에서 베타 세포 활성에 해당합니다.
이것이 기초 활동입니다. 반응하는 베타 세포는 시간이 지남에 따라 녹색 형광이 왁싱되고 약해지는 것을 보여줍니다. 200프레임에서 10마이크로리터의 200밀리몰 D-포도당을 부드럽게 첨가하여 포도당 농도를 20밀리몰로 높입니다.
그런 다음 20밀리몰 농도에서 150프레임을 획득합니다. FIJI에서 이미지 파일을 열려면 플러그인, LSM 도구 상자, LSM 도구 상자 표시를 선택합니다. LSM 도구 상자에서 LSM 열기를 클릭하고 이미지 파일을 선택합니다.
Tools(도구)의 Analyze(분석) 메뉴에서 ROI Manager(ROI 관리자)를 엽니다. 도구 모음에 있는 다각형 선택 도구를 사용하여 ROI를 수동으로 그립니다. 세포의 세포질 일부를 포함하는 핵보다 큰 영역을 포함하도록 빨간색 채널에 ROI를 그립니다.
프레임 간에 ROI 위치가 일관되는지 확인하고 필요한 경우 위치를 조정합니다. Add 버튼을 클릭하여 선택한 ROI를 ROI Manager에 추가합니다. 여러 ROI를 선택하고 추가하여 여러 셀에서 데이터를 얻을 수 있습니다.
다음으로 Analyze(분석) 메뉴에서 Set Measurements(측정 설정)를 선택합니다. 그런 다음 Integrated density를 선택하여 영역 내의 총 형광 강도 추출을 지정합니다. GCaMP 형광이 포함된 녹색 채널로 이동하고 ROI 관리자에서 Multi Measure를 선택합니다.
이것은 시계열 전체의 셀에 대한 강도 측정을 제공합니다. FIJI 출력을 쉼표로 구분된 텍스트 파일로 저장합니다. LSM Toolbox에서 이미지 프레임의 타임스탬프를 가져옵니다.
스탬프 적용, t-스탬프 적용, 파일 이름, 텍스트 파일에 덤프를 사용하여 타임스탬프를 얻습니다. Save as(다른 이름으로 저장) 옵션을 사용하여 타임스탬프를 저장하거나 스프레드시트에 복사합니다. 모든 세포에 대한 강도 값을 컴파일한 후 한 번에 한 세포씩 또는 자동으로 분석을 수행합니다.
자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 이 실험에서는 베타 세포에서 특이적으로 핵 mKO2 및 GCaMP6를 발현하는 45 DPF 형질전환 계통의 개별 1차 섬 베타 세포를 포도당 램프로 자극한 다음 염화칼륨으로 탈분극시켰습니다. 세포의 활성을 분석하였다.
FIJI 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 개별 베타 세포의 GCaMP6 형광 강도를 추출하고 정규화했습니다. 이러한 형광 강도의 흔적에서 볼 수 있듯이, 개별 베타 세포는 포도당으로 자극될 때 GCaMP6 형광의 진동을 나타내며, 염화칼륨을 첨가하면 형광이 안정화됩니다. 이 기술은 베타 세포의 포도당 반응성에 대한 세포 해상도와 그 기능에 대한 창을 제공합니다.
이 기술을 숙달하면 올바르게 수행하면 45분 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 베타 세포의 생존 능력을 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유전자 조작과 같은 다른 방법을 수행하여 베타 세포 기능에 대한 특정 유전자의 역할을 이해할 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 개별 베타 세포 내에서 포도당 반응을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 연구는 생체 이미징 기법을 사용하여 단일 세포 분해능으로 베타 세포 기능성과 포도당 반응성을 평가합니다. 이 방법은 개별 베타 세포에서 칼슘 진동을 관찰할 수 있게 하여 베타 세포의 이질성과 기능성에 대한 통찰력을 제공합니다.
Single-cell calcium imaging in zebrafish islets enables high-resolution functional assessment of beta-cell heterogeneity and glucose responsiveness, directly informing early diabetes target validation. This approach provides predictive confidence for mechanistic de-risking and supports translational continuity from discovery biology to preclinical model development. The method's quantitative outputs and scalability position it as a reusable platform for portfolio-wide interrogation of beta-cell function and dysfunction.
This calcium imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational model development for diabetes research.