Name: Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 배우세요 제브라피시 Danio rerio 베타세포에서 GCaMP6s를 이용한 단일 세분화 칼슘 이미징 방법으로 포도당 자극에 따른 세포 내 칼슘 역학을 실시간 관찰하고 베타세포 기능과 이질성을 연구하는 기술입니다.

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우리가 원고, 재생 치료 드레스덴 (CRTD) 물고기와 현미경 시설 기술 지원 센터의 회원에 의견에 대 한 Ninov 연구소의 회원을 감사합니다. N.N.는 DFG-CRTD, TU-드레스덴, 독일 연구 재단 (DFG) 및 당뇨병 연구 (DZD)를 위한 독일 센터에 우수 클러스터에서에서 자금에 의해 지원 됩니다.

동물 주제를 포함 하 여 모든 절차 Landesdirektion 뉴 스타트 인섹 센, 독일 (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016)의 허가 동물 복지 행위에 의해 승인 되었습니다가지고.
1입니다. 준비
참고:이 프로토콜은 이중 유전자 변형 Tg에서 zebrafish 주 섬의 비보 전 영상 (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 제 브라. 이 유전자 변형 라인에서 인슐린 발기인 (ins) 드라이브 두 transgenes의 베타 세포 특정 식: nls-Renilla-mKO2, 단위체 Kusabira 오렌지 2 (mKO2)와 베타 세포의 핵을 표시 형광; 그리고 GCaMP6s15, 세포내 칼슘 수준에 증가에 대 한 응답에서 녹색 형광을 방출 한다. GCaMP6s의 베타 세포 특정 식 세포 유형 주변에 칼슘 변화에서 간섭 없이 베타 세포의 포도 당 응답을 공부 하 고 있습니다.
<ol><li>캘리포니아2 +/Mg2 +의 1 mL에 소 fibrinogen의 10mg을 용 해 하 여 신선한 fibrinogen 주식 (10mg/mL) 준비-행 크 스 균형 소금물 (HBSS) 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 들어 있는. Fibrinogen 파우더까지 적극적으로 소용돌이 완전히 녹 인 다. 더 이상 15 분 동안 실내 온도에 솔루션을 계속. 참고: 재고 솔루션 유해를 시작 하 고 점성 된다 경우 2-3 헤 취소 재고에 대 한 실 온에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>3 겹에 HBSS fibrinogen 주식을 diluting 하 여 fibrinogen 작업 솔루션 (3.3 mg/mL)을 준비 합니다. 예, fibrinogen 재고 fibrinogen 작업 솔루션의 900 µ L를 준비 하는 HBSS의 600 µ L에서 300 µ L를 혼합.</li>
	<li>10을 용 해 하 여 트 롬 빈 솔루션 (10 U/mL)를 준비 단위 HBSS 또는 인산 염의 1 mL에 트 롬 빈의 버퍼링 식 염 수 (PBS). 참고:이 솔루션 50 µ L 부분에 aliquoted 사전에 준비 하 고 수-20 ° c.에 언</li>
	<li>물 50 mL에 D-포도 당 1.8 g을 용 해 하 여 200 m m D-포도 당 솔루션을 준비 합니다. 장기 저장을 위한 4 ° C에서 유지.</li>
	<li>물 50 mL에 KCl의 1.1 g을 용 해 하 여 300 mM KCl 솔루션을 준비 합니다. 장기 저장을 위한 4 ° C에서 유지.</li>
	<li>장착은 독도 대 한 35 m m 직경 유리 하단 요리를 조달.</li>
	<li>해 부 및는 섬에의 설치 사용 하 여 형광 램프와 빨간 필터 큐브 스테레오 현미경 (TRITC: 여기: 532-554 nm, 방출: 570-613; 또는 텍사스-레드: 여기: 540-580 nm, 방출: 592-667 nm).</li>
	<li>이미징 (0.8 없음) X 20는 거꾸로 confocal 현미경 (LSM 780 또는 이와 유사한 Zeiss) 목표 공기와 35 m m 직경 유리 하단 요리 접시 홀더 장착 사용에 베타 세포에서 칼슘의 유입에 대 한.</li>
	<li>Zebrafish는 euthanizing tricaine 메탄 된 (MS222)의 200 mg/L 솔루션 준비.</li>
	<li>Zebrafish 해 부에 대 한 90 mm 페 트리 접시를 조달.</li>
</ol>2. 제 브라 주 섬 해 부 및 장착
<ol><li>MS222에서 머리말 붙인된 외피를 사용 하 여 물고기 안락사 이 위해 부드럽게 낚시 그물을 사용 하 여 어항에서 물고기를 제거 하 고 동물 opercular (아가미) 운동; 표시 될 때까지 MS222 솔루션을 포함 하는 페 트리 접시에 그것을 품 어 일반적으로,이 걸립니다 5 분 전송 물고기 Ca2 +/Mg2 +HBSS 솔루션을 포함 하는 배양 접시에.</li>
	<li>
스테레오 현미경 형광 램프와 빨간 필터 큐브, 췌를 동물의 복 부의 오른쪽을 덮고 피부를 해 부.
	<ol>
<li>이 대 한 날카로운 집게를 사용 하 여 항문 지 느 러 미에 입에서 zebrafish의 피부를 잘라. 복 부; 노출 컷된 피부 벗 겨 이 자르는 내부 장기 노출합니다. 베타 세포의 mKO2 식의 빨간 형광을 사용 하 여 시각적인 검사는 현미경으로 독도의 위치를 확인 합니다. 필요한 경우, 그들은 찾기 어려운 섬 표지 수 간의 돌출부를 제거 합니다. 참고: 주 섬은 오른쪽에 일반적으로 복 부의 앞쪽 지역 근처에 위치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>신중 하 게 간, adipocytes 등 주변 조직을 제거 하 여 주 섬 청소. 주의 손상 또는 찌를 섬; 주변 조직의 지운 후 섬 표면에 개별 셀 될 뚜렷한.</li>
	<li>유리 하단 접시의 중앙에 30 µ L 방울 HBSS 플라스틱 이 드롭 해 부 섬 전송.</li>
	<li>조심 스럽게 씻어 한번 HBSS와 함께 한 번 30 µ L fibrinogen 작업 솔루션 (3.3 mg/mL)의 작은 섬. 이렇게 하지 않으면 세포 죽음에서 발생 하기 때문에 세척 단계는 섬의 건조 하지 않도록 해야 합니다.</li>
	<li>천천히 그리고 부드럽게 트 롬 빈 솔루션 (10 U/mL)의 10 µ L를 추가 합니다. 섬 두고 접시 15-20 분 fibrinogen-트 롬 빈 드롭 관찰에 대 한 손길이 닿지 않은 점성 및 약간 불투명 한이 시점에서 될 것입니다.</li>
</ol>3. 제 브라 주 독도에서 GCaMP 형광 강도의 전 비보 라이브 영상
<ol><li>금형 위에 HBSS의 200 µ L을 추가 하 고 confocal 현미경의 플레이트 홀더에 신중 하 게 접시를 놓습니다. 20 X, 0.8 나 공기 목표를 사용 하 여 confocal 영상에 대 한. 섬을 대물 옵션을 사용 하 여 찾습니다.</li>
	<li>빨간 형광에 대 한 필터를 사용 하 하는 섬에 초점, 베타 세포에서 핵 mKO2 형광을 볼 수 있습니다. 개별 핵은 명확 하 게 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>z 축 따라 섬의 두께 통해 이동 하기 위하여 공초점 현미경의 초점 비행기를 수동으로 변경 하 여 명확한 영상 평면을 찾습니다. 특히 섬 중앙에에서 핵 mKO2 형광의 밝기는 유니폼, 이미징 비행기 이미징, 베타 세포의 충분 한 수 (50-100)를 포함 확인 하십시오.</li>
	<li>"스마트 설정 메뉴"에서 다음 설정을 사용 하 여 GCaMP6s 및 mKO2 형광에 대 한 순차적 인수 설정: GCaMP6s, 여기: 488 nm, 방출: 500-555 nm, false-색상: 그린 (선택 "GFP"); mKO2, 여기: 561 nm (mCherry), 방출: 570-630 nm, false-색상: 레드 (선택 "mCherry"). 참고:이 설정을 사용 하 여 빨강 채널 기록할 것 이다 베타 세포 핵의 위치 녹색 채널 GCaMP 형광 강도 기록 하는 동안.</li>
	<li>"수집 모드"에서 1024 x 1024 픽셀에서 이미지 해상도 설정, 10와 1에서 평균 속도. 연속 시작 "시계열"에 대 한 옵션을 선택 하 고 프레임 당 약 2 s 수집 시간 500 사이클, "기간"을 설정 하 여 녹음 합니다. 참고: 시간 시리즈의 처음 50 프레임 5 mM 포도 당 농도에서 베타 세포의 활동에 해당합니다. 이것은 초기 응답 이다. 응답 베타 셀 왁 싱 시간 녹색 형광 강도 말기 표시 됩니다. 우리는 몇 가지 (1-5%)는 베타 세포의 5 mM 포도 당에서 진동 관찰.</li>
	<li>
이미징 사이클에 잘 감시 해. 처음 50 프레임 후 녹화를 중지 하지 않고 10 m m 주변 솔루션의 포도 당 농도 증가.
	<ol>
<li>이미지 수집, perturbing 없이 부드럽게 200mm는 섬 들고 젤 위에 D-포도 당 솔루션의 5 µ L 플라스틱. 10 m m 포도 당에서 150 프레임을 획득 합니다. 참고: 포도 당 농도 증가의 베타 세포 수 증가 GCaMP 형광 진동 녹색 채널에 받고.</li>
		<li>유지 하는 세포의 핵 안정 과정에서. 섬 중 광범위 하 게 떨고 핵 초점 평면에서 이동 하는 경우 (필요한 경우) 샘플 삭제.</li>
		<li>다음 샘플의 안정성을 보장 하기 위해 fibrinogen-트 롬 빈 금형의 합 수 있도록 충분 한 기간을 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>200 프레임에서 더 부드럽게 200 m m D-포도 당 솔루션의 10 µ L를 pipetting으로 20 mm 용액의 농도 증가. 20 mM 농도 대 한 150 프레임을 획득 합니다.</li>
	<li>350 프레임 후 섬 KCl의 30 m m를 사용 하 여 depolarize. 이 위해 20 µ L 300 m m KCl 재고 솔루션을 추가 합니다. 이 단계에서 관찰 GCaMP6s 형광 진동 중지 하 고 고 강도;에 수정 베타 세포 포도 당에 반응 하지 않았다 또한 KCL 추가 시 녹색 형광 강도 증가 표시할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 개별 베타 세포에 대 한 GCaMP 형광 추적의 정량화
참고: 추적 하 고 개별 베타 세포의 포도 당 수준의 응답 계량, 전체 이미징 동안 GCaMP 형광 강도 수량화 합니다. 정량화는 셀룰러 해상도에서 수행 됩니다. 이 위해 피지20 을 사용 하 여 이미지 (4.1-4.6 단계), 그리고 스프레드시트 소프트웨어 또는 분석 (4.8-4.9 단계)를 수행 하려면 R21 에서 GCaMP 형광의 강도 값을 추출.
<ol><li>피지 "LSM 도구 상자"를 사용 하 여 이미지 파일을 엽니다. 이 위해 선택 "플러그인 | LSM 도구 상자 | LSM 도구 상자 표시 ". "LSM 도구 상자", "오픈 LSM"를 클릭 하 고 이미지 파일을 선택 합니다. 참고: "LSM 도구 상자"에서 지원 되지 않는 형식에 대 한 변환 분석을 위한 티파니를 먼저.</li>
	<li>피지에서 관심 영역 (ROI) 도구를 사용 하 여 셀의 응답을 압축을 풉니다. "도구" 아래 "분석" 메뉴에서 "투자 수익 관리자"를 엽니다. 도구 모음에 있는 "다각형 선택 도구"를 사용 하 여 투자 수익을 수동으로 그립니다.</li>
	<li>베타 세포 핵 되 빨강 채널에 투자 수익을 그립니다. 셀의 세포질의 일부를 포함 하려면 셀의 핵 보다 더 큰 영역을 커버 하는 투자 수익을 선택 합니다. 투자 수익 위치 프레임 사이의 일치 하는지 확인 하 고 필요한 경우 위치를 조정 합니다.</li>
	<li>"[T] 추가" 버튼을 클릭 하 여 선택한 ROIs "ROI 관리자"를 추가 합니다. 선택한 여러 셀에 데이터를 얻기 위해 투자 수익에 여러 ROIs를 추가 합니다.</li>
	<li>다음, "분석" 메뉴에서 "설정 측정" 선택 합니다. 지정 지역 내에 총 형광 강도의 추출에 대 한 "통합 밀도"를 선택 합니다.</li>
	<li>GCaMP 형광을 포함 하는 녹색 채널을 shift 하 고 "ROI 관리자"에서 "멀티 측정"를 선택 합니다. 참고:이 시간 시리즈를 통하여 셀에 대 한 강도 측정을 제공할 것입니다.</li>
	<li>경우에 투자 수익 위치는 섬의 움직임으로 인해 조정 될 필요가 있다, 수동으로 다른 프레임의 강도 측정을 컴파일하십시오. 복사 하 고 별도 스프레드시트에 값을 붙여 넣습니다.</li>
	<li>"LSM 도구 상자"에서 이미지 프레임의 타임 스탬프를 가져옵니다. 사용 "우표 적용 | T 우표 적용 | 파일 이름 | 덤프 텍스트를 "타임 스탬프를. "다른 이름으로 저장" 옵션을 사용 하 여 타임 스탬프를 저장 하거나 스프레드시트에 복사 합니다.</li>
	<li>모든 셀에 대 한 강도 값을 컴파일 시 분석 한 셀에 한 번 또는 자동으로 (예를 들어, Excel 수식 또는 R를 사용 하 여)을 수행 합니다.</li>
	<li>
2 단계에서 개별 셀을 분석 합니다.
	<ol>
<li>첫 번째 단계에서 기준선 위에 형광 강도 계산 합니다. 이 위해, 처음으로 50 프레임 (5 mM 포도 당)에 대 한 형광 강렬의 평균으로 기준 형광 강도 (F0)을 계산 합니다. 기준선 (0F) 전체 시계열에서 뺍니다 (F-F0). 참고: 몇 가지 세포는 일반적으로 더 높은 농도와 자극을 다음 기저 포도 당에서 분명 GCaMP 진동 표시할 수 있습니다. 이러한 셀만 있는 셀 형광에 한 방울을 보여준 초기 프레임의 평균 강도 취 함으로써 F0 를 추정 가능 하다.</li>
		<li>분석의 두 번째 단계에서 형광 강도 정상화 하 여 최종 GCaMP 형광 강도 얻을. 참고:이 다른 동물에서 독도 간의 차이 제거 수행 됩니다. 개별 독도 포도 당 자극에 따라 형광 방출의 다양 한 레벨을 표시합니다.</li>
		<li>높은 강도 값으로 그것을 분할 하 여 형광 강도 정상화. 이 위해 (F최대 -F0), 피크 강도 계산 하 고 피크 강도 최종 GCaMP 형광 강도를 뺀 초기 계획 값을 나누어 (F-F0) / (F최대 -F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>건강에 해로운 또는 손상 될 수 있습니다 다음 KCl 자극 강도에 변화를 전시 하지 않는 셀을 삭제 합니다.</li>
	<li>R에서 (단계 4.9-4.10) 분석을 수행 하기 위한 사용 R 스크립트 (plotcelltrace. R)이이 원고와 함께 제공.</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

여기 beta 세포 포도 당 응답 단일 셀 해상도 정량화에 대 한 기술을 설명합니다. 이것은 유전자 인코딩 칼슘 표시기, GCaMP6s를 사용 하 여 세포내 칼슘 농도 모니터링 하 여 이루어집니다. 베타 세포 활동 fibrinogen-트 롬 빈 형에서 섬을 장착 하 여 캡처된 비보 전 이다. 프로토콜의 중요 한 단계는 금형의 안정성 이다. 충분 한 시간 HBSS 용액에 녹이는 것 fibrinogen에 주어질 필요가 있다. 이 없이, 금형 않습니다 이미징 세션 동안 안정성을 제공 하기 위해 충분히 유해 하지. 적어도 1 주 동안 (데이터 표시 되지 않음) fibrinogen-트 롬 빈 형에 탑재 하 고 세포 배양에 있는 섬 가능한 남아 있을 수 있습니다. 낮은 용융 agarose 등 fibrinogen-트 롬 빈 형에 대안 섬22탑재를 활용할 수 있습니다. 또 다른 중요 한 매개 변수는 섬에의 해 부는. 이 단계는 섬 주변 조직 부상 또는 파고는 섬 없이 제거 될 필요가 있다. 숙련 된 해 부 연습 함께 제공 됩니다.
이미징 프로토콜의 한계는 섬에의 한 confocal 평면에 제한 이다. 이렇게 개별 베타 세포 내 칼슘 유입의 역학을 잡으려고 합니다. 섬의 전체 두께 통해 Z 스택 이미징 속도 및 개별 셀에서 진동 신호의 손실 리드. 이 제한 3 차원에서 칼슘 역학을 캡처 수 있도록 같은 회전 디스크 현미경 검사 법, confocal 영상 빠른 수단을 사용 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 또 다른 국경 vivo에서 칼슘 이미징12것입니다. Zebrafish 태아의 투명 한 특성 또는 zebrafish 성인23 의 색소 없는 종자를 사용 하 여 생체 내 이미징 미래에 대 한 가능성을 열 수 있습니다.
베타 세포 활동 공간 및 시간 고해상도 이미징 개별 베타 세포 중 기능이 조사를 수 있습니다. 이 방법은 베타 셀 부분 모집단의 존재에 도울 수 있다. 최근, 여러 연구 명목상 동질적인 베타 세포24,,2526부분 모집단의 존재를 나타났습니다. Ex vivo 이미징 포도 당에 대 한 하위-인구의 응답의 성격 유전 기자와 결합할 수 있습니다. 또한 약리 자극 이미징 설치 결합 베타 세포 기능을 향상 시킬 수 있는 화합물의 심사에 대 한 수 있습니다.
요약 하면, 여기에 제시 된 기술 정량화 및 개별 베타 세포의 포도 당 응답의 비교 수 있습니다. 베타 세포 기능, 당뇨병의 발전에 중요 한 매개 변수를 직접 윈도우를 제공합니다.

우리의 혈액 포도 당 췌 내 분 비의 기능 때문에 큰 부분에서 좁은 범위에 유지 됩니다. 췌 장의 내 분 비 역할은 독도 Langerhans, 호르몬 분 비 세포를 포함 하는 의해 수행 됩니다. 인슐린 은닉 베타-세포는 혈당 탄수화물이 포함 된 식사를 다음 수준을 감소 합니다. 부적당 한 인슐린 베타 세포에서 분 비 당뇨병1, 지속적인된 높은 혈당에 의해 특징에 발생할 수 있습니다. 타입 1과 타입 2 당뇨병, 현재 전세계 400 백만 이상의 사람들이 고생, 병 적 상태와 사망률2이끌어 낸다. 베타 세포 기능 장애에 기여 하는 분자 및 환경 요인, 조사 함으로써 우리가 이해할 것 이다 더 나은 어떻게 타입-2 당뇨병을 시작 하 고 진행. 또한, 인간 줄기 세포 생체 외에서 기능성 베타 세포로 분화 하는 능력 제 1 형 당뇨병에서 세포 대체 요법에 대 한 새로운 베타 세포의 원천을 제공할 수 있습니다. 이 위해, 그것은 베타 세포의 기능 및 유전 모형 유기 체에서 성숙 접시에 기능성 베타 세포를 만들기 위한 필요한 지식을 얻기 위해 공부 하는 것이 중요.
베타 세포 기능 인슐린 응답 포도 당 자극으로 분 비의 총량을 측정 하 여 전체 섬 수준에서 모니터링할 수 있습니다. 이 누적 방법은 셀의 개별 속성을 구분 하지 않고 셀의 단일 그룹으로는 섬을 공부 한다. 그러나, 개별 베타 세포의 포도 당 응답의 분석 다양을 한 베타 세포의 기능 특성에이3의 존재를 밝혔다. 개별 베타 세포의 기능을 평가 하기 위해 인슐린 분 비4이어질 세포내 변화를 모니터링 가능 하다. 인슐린 분 비는 베타 세포로 포도 당의 항목 앞에 있습니다. 베타 세포에 들어가는 포도 당 급속 하 게 ATP를 물질 대사로 변화. 높은 세포내 ATP 농도 ATP-민감한 칼륨 이온 채널 베타 셀 도발은 이어지는 오픈 확률 감소. 도발은 전압에 민감한 칼슘 이온 채널 열리고 세포내 칼슘 증가. 차례 차례로, 칼슘 exocytosis를 순환에 발표 되 고 포도 당 이용5,,67을 홍보 하 여 포도 당 수치를 낮추고 인슐린의 트리거합니다.
몇 가지 전략을 막 잠재적인8, 인슐린 소포 exocytosis9의 직접적인 시각화 및 정량화의 세포내 캘리포니아2 + 의 모니터링을 포함 하 여 베타 세포의 기능을 조사에 적용 포도 당 응답10에 대 한 프록시로 유입. 그 중, 세포내 캘리포니아2 + 의 영상 업 스케일링 같은 섬11,12, 간의 포도 당 응답의 직접 비교를 위해 수 있도록 내 여러 개별 셀에 분석의 이점을 제공 한다 개별 베타-셀입니다. 세포내 캘리포니아2 + 농도 칼슘-민감한 형광 염료13 또는 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)14를 사용 하 여 모니터링할 수 있습니다. 반면 칼슘 표시기 염료 부족 셀 형 특이성, GECIs 특정 발기인에 의해 특정 셀 형식으로 표현할 수 있습니다. 또한, GECIs, GCaMP6, 등의 새로운 세대는 빠른 임시 역학15와 함께 더 나은 신호 대 잡음 비율을 제공 한다. 여기는 단일 셀 해상도에서 베타 세포에서 칼슘을 시각화 하기 위해 특정 GCaMP6s에 있는 GECIs의 새로운 세대의 유틸리티에 설명 합니다. 우리 선택의 우리의 모델로 zebrafish 주 섬에이 메서드를 적용 됩니다. 배아 개발 하는 동안 베타 세포 주 섬에는 등 쪽에서 발생 하 고 복 부 췌 장 새싹16. 주 섬은 쉽게 식별 및 격리 zebrafish 췌 장 내에서 틀에 박힌 해 부 위치에 있습니다. 그들의 유전 제거 혈당17,18에 리드 주 섬에 베타 세포 포도 당 규칙을 위한 필요 하다. 또한,이 베타 세포 초기 zebrafish 개발19동안에 포도 당 응답 되. 이 프로토콜은 포스트 미 발달 단계 형성 보조 독도 영상에 적용할 수 있습니다. 프로토콜 정의 된 포도 당 농도 및 개발의 나중 단계에서 이미지 베타 세포 비보 전, 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>유전자 변형 제브라피시 라인: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td><td></td><td></td><td>저자의 요청에 따라</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>ZEISS</td><td>495015-0001-000</td><td>SteREO Discovery.V8</td></tr><tr><td>형광 램프</td><td>ZEISS</td><td>423013-9010-000</td><td>Illuminator HXP 120 V</td></tr><tr><td>Red Filter Cube</td><td>ZEISS</td><td>000000-1114-462&nbsp;</td><td>필터 세트 45 HQ TexasRed</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>ZEISS</td><td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>소 피브리노겐</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks' Balanced Salt solution)</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 지름 유리 바닥 접시</td><td>ThermoFisher</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>트리카인 메탄 설포네이</td>트 <td>Sigma</td><td>E10521&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fine</td><td>Forceps Fine Science Tools</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>FIJI, ImageJ 버전 사용: 2.0.0-rc-43/1.50e</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>R, 버전 3.2.4</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/</td></tr> <tr><td>plotcelltrace. R</td><td></td><td></td><td>: 원고와 함께 제공되는 사용자 정의 스크립트</td></tr></tbody></table>

zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

췌 장 베타 세포는 호르몬 인슐린을 은닉 하 여 증가 혈액 포도 당 농도에 응답. 베타 세포의 기능 장애는 혈당과 심각한, 생명을 위협 하는 결과를 리드. 베타 세포 생리 적 조건 하에서 작동 하는 방법 및 어떤 유전과 환경 요인 그들의 장애를 일으킬 수 있습니다 이해는 당뇨병 환자에 대 한 더 나은 치료 옵션을 발생할 수 있습니다. 베타 세포에 칼슘 수준을 측정 하는 기능 베타 세포 기능, 칼슘 이온 트리거 인슐린 방출의 유입으로의 중요 한 지표 역할을 합니다. 여기는 GCaMP6s, 칼슘의 유전자 인코딩된 센서를 사용 하 여 zebrafish 베타 세포에 포도 당 자극 칼슘 유입 모니터링을 위한 프로토콜에 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 단일 셀 해상도 ex vivo 탑재 독도에서 세포내 칼슘 역학을 모니터링 수 있습니다. 같은 섬 내 베타 세포의 포도 당 응답 수 있습니다 캡처할 수 동시에 다른 포도 당 농도에서 zebrafish 베타 세포 사이 기능이의 존재를 제안. 게다가, 기술은 포도 당 자극에 따라 칼슘 유입의 진동 특성을 보여 높은 시간적, 공간적 해상도를 제공 한다. 우리의 접근 방식을 모델로 제 브라를 사용 하 여 조사 하는 베타 세포의 기능 및 역 기능에 유전과 환경 요인의 기여에 문을 엽니다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하는 45 일 후 수정 (dpf) 제 브라에서 한 섬 베타 세포의 포도 당 응답 분석 했다. 이 위해 주 섬 안락사 동물에서 해 부 되었고 유리 하단 접시에 fibrinogen-트 롬 빈 형에 탑재. 섬 5 mM 포도 당을 포함 하는 HBSS에 몰두 했다. 포도 당 농도 단계별 방식으로 10 밀리미터 및 20 밀리미터에 증가 되었다. 베타 세포의 포도 당 농도가 증가 응답 기록 되었다. 마지막으로, 베타 셀 30 m m KCl (그림 1)를 사용 하 여 depolarized 했다. 도발은 KCl을 사용 하 여 건강 한 베타 세포에서 칼슘 항목을 유도 합니다.
피지 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 개별 베타 세포의 GCaMP6s 형광 강도 추출 되 고 정규화 (그림 2). 형광 강도의 추적에서 볼 있듯이, 개별 베타 세포 포도 당 자극, KCl 자극 시 중지 시 GCaMP6s 형광 진동 표시. 기술은 그들의 기능으로 베타 세포의 포도 당-응답 및 창 세포 확인을 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> 그림 1: Ex vivo 라이브 이미징 zebrafish 베타 세포에서 GCaMP6s를 사용 하 여 칼슘 유입의. Tg(ins:nls-Renilla-mKO2);에서 주요 섬 Tg(ins:GCaMP6s) zebrafish (45 dpf) fibrinogen-트 롬 빈 형에 탑재 되었고 5 m m (기저) 포도 함께 알을 품을. GCaMP6s 형광 녹색 채널에 존재 하는 동안 베타 세포 빨간 핵 표시와 함께 표시 했다. 섬 10 밀리미터 및 20 밀리미터 D-포도 당, 순차 외피로 구성 된 포도 당 경사로와 자극 그리고 30 m m KCl 화살촉 표시 개별 베타 세포의 활동 분석의 추가 통해 depolarized. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> 그림 2: GCaMP6s 형광 강도-추적 개별 베타 세포에 대 한 정규화. 정규화 된 GCaMP6s 형광 강도-추적 화살표 그림 1에 표시 된 베타 세포에 대 한. X 축에 시간을 (초) 나타냅니다. 맨 바 HBSS 매체에서 포도 당와 KCl의 농도 묘사. Y 시간 시리즈 동안 정규화 된 형광 강도를 나타냅니다. 이 위해, 초기 강도 (F0) 5 mM 포도 당에 부 화 하는 동안 평균 강도 계산 됩니다. 이 전체 시계열 데이터에서 뺍니다 (F-F0). 셀에 의해 표시 된 최대 강도 의해 강도 이상 기준선은 정규화 (F-F0) / (F최대-F0). 정규화 된 추적 셀 30 m m KCl.와 depolarized는 안정 시킨다 포도 당을 베타 세포의 진동 응답을 보여 줍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

베타 세포 기능 혈액 포도 당 항상성, 칼슘 유입에 대 한 유전자 인코딩된 기자를 사용 하 여 단일 셀 해상도에서 계산 되는 중요 하다.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

이 방법은 베타 셀 분야의 중요한 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 섬 내의 개별 베타 세포 중 이질(heterogen) IT 기능과 같은. 이 기술의 주요 장점은 베타 세포의 실시간 이미징이 제공하는 공간 및 시간 해상도입니다.우리는 개별 베타 세포 내의 칼슘 진동을 포착할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 물고기를 안락사시킨 후, 칼슘과 마그네슘이 함유된 HBSS 용액이 들어 있는 Petrie 접시에 옮깁니다. 그런 다음 형광 램프와 빨간색 필터 큐브가 장착된 실체 현미경 아래에서 날카로운 집게를 사용하여 입에서 항문 지느러미까지의 피부를 자릅니다.오른쪽의 절인 피부를 벗겨내면 복부가 드러나고 내장이 드러납니다. 그런 다음 적색 형광을 사용하여 베타 세포에서 mKO2 발현을 확인하고 섬을 찾습니다. 간 및 지방 세포와 같은 주변 조직을 조심스럽게 제거하여 1차 섬을 청소합니다.섬을 다치게 하거나 찌르지 않도록 주의하십시오. 다음으로 HBSS 30마이크로리터를 유리 바닥 접시 중앙에 떨어뜨립니다. 그런 다음 절개된 섬을 드롭으로 옮깁니다.HBSS의 경우 섬을 한 번 조심스럽게 씻은 다음 30마이크로리터의 피브리노겐 작용 용액을 사용하여 한 번 씻습니다. 세포 사멸을 초래할 수 있는 세척 단계 중에 섬을 건조하지 마십시오. 천천히 그리고 부드럽게 트롬빈 용액 10 밀리리터당 10 단위의 10 마이크로 리터를 섬에 첨가하십시오.섬과 접시를 15-20분 동안 손대지 않고 그대로 두십시오. 피브리노겐 트롬빈 방울이 점성이 있고 안정되는 것을 관찰하십시오. 트롬빈이 피브리노겐 용액에서 중합될 수 있도록 충분한 시간이 주어져야 합니다.그렇지 않으면 금형이 이미징 세션 중에 안정성을 제공하지 않습니다. GCaMP 형광의 생체 외 실시간 이미징을 수행하려면 금형 위에 200마이크로리터의 HBSS를 추가하고 접시를 컨포칼 현미경의 플레이트 홀더에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 20X 0.8 NA 오류 목표와 명시야 옵션을 사용하여 섬을 찾습니다.적색 형광 필터를 사용하여 베타 세포의 핵 mKO2 형광을 보면 섬에 초점을 맞춥니다. 개별 핵이 명확하게 보여야 합니다. Z축을 따라 섬의 두께를 통해 수동으로 이동하여 명확한 이미징 평면을 찾습니다.이미징 평면에 이미징을 위한 50-100개의 베타 세포가 포함되어 있고 핵 mKO2 형광의 밝기가 특히 섬의 중앙에서 균일한지 확인합니다. 다음으로 스마트 설정 메뉴에서 다음 설정을 사용하여 GCaMP6 및 mKO2 형광에 대한 순차 획득을 설정합니다. GCaMP6의 경우 488나노미터의 여기와 500-555나노미터의 대략적인 방출을 선택합니다.거짓 색상에서 GFP를 선택합니다. mKO2의 경우 561나노미터의 여기와 570-630나노미터의 방출을 선택합니다. 거짓 색상으로 mCherry를 선택합니다.획득 모드에서 이미지 해상도를 1, 024 x 1, 024 픽셀, 속도를 10, 평균 1로 설정합니다. Time Series에 대한 옵션을 선택하고 프레임당 약 2초의 획득 시간으로 지속 시간을 500 사이클로 설정하여 연속 기록을 시작합니다. 이미징 주기를 주시하십시오.이미지 획득을 방해하지 않고 처음 50프레임 후에 섬을 잡고 있는 젤 위에 5마이크로리터의 200밀리몰 D-포도당 용액을 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 10 밀리몰 포도당에서 150 프레임을 획득합니다. 시계열의 처음 50개 프레임은 5밀리몰 포도당에서 베타 세포 활성에 해당합니다.이것이 기초 활동입니다. 반응하는 베타 세포는 시간이 지남에 따라 녹색 형광이 왁싱되고 약해지는 것을 보여줍니다. 200프레임에서 10마이크로리터의 200밀리몰 D-포도당을 부드럽게 첨가하여 포도당 농도를 20밀리몰로 높입니다.그런 다음 20밀리몰 농도에서 150프레임을 획득합니다. FIJI에서 이미지 파일을 열려면 플러그인, LSM 도구 상자, LSM 도구 상자 표시를 선택합니다. LSM 도구 상자에서 LSM 열기를 클릭하고 이미지 파일을 선택합니다.Tools(도구)의 Analyze(분석) 메뉴에서 ROI Manager(ROI 관리자)를 엽니다. 도구 모음에 있는 다각형 선택 도구를 사용하여 ROI를 수동으로 그립니다. 세포의 세포질 일부를 포함하는 핵보다 큰 영역을 포함하도록 빨간색 채널에 ROI를 그립니다.프레임 간에 ROI 위치가 일관되는지 확인하고 필요한 경우 위치를 조정합니다. Add 버튼을 클릭하여 선택한 ROI를 ROI Manager에 추가합니다. 여러 ROI를 선택하고 추가하여 여러 셀에서 데이터를 얻을 수 있습니다.다음으로 Analyze(분석) 메뉴에서 Set Measurements(측정 설정)를 선택합니다. 그런 다음 Integrated density를 선택하여 영역 내의 총 형광 강도 추출을 지정합니다. GCaMP 형광이 포함된 녹색 채널로 이동하고 ROI 관리자에서 Multi Measure를 선택합니다.이것은 시계열 전체의 셀에 대한 강도 측정을 제공합니다. FIJI 출력을 쉼표로 구분된 텍스트 파일로 저장합니다. LSM Toolbox에서 이미지 프레임의 타임스탬프를 가져옵니다.스탬프 적용, t-스탬프 적용, 파일 이름, 텍스트 파일에 덤프를 사용하여 타임스탬프를 얻습니다. Save as(다른 이름으로 저장) 옵션을 사용하여 타임스탬프를 저장하거나 스프레드시트에 복사합니다. 모든 세포에 대한 강도 값을 컴파일한 후 한 번에 한 세포씩 또는 자동으로 분석을 수행합니다.자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 이 실험에서는 베타 세포에서 특이적으로 핵 mKO2 및 GCaMP6를 발현하는 45 DPF 형질전환 계통의 개별 1차 섬 베타 세포를 포도당 램프로 자극한 다음 염화칼륨으로 탈분극시켰습니다. 세포의 활성을 분석하였다.FIJI 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 개별 베타 세포의 GCaMP6 형광 강도를 추출하고 정규화했습니다. 이러한 형광 강도의 흔적에서 볼 수 있듯이, 개별 베타 세포는 포도당으로 자극될 때 GCaMP6 형광의 진동을 나타내며, 염화칼륨을 첨가하면 형광이 안정화됩니다. 이 기술은 베타 세포의 포도당 반응성에 대한 세포 해상도와 그 기능에 대한 창을 제공합니다.이 기술을 숙달하면 올바르게 수행하면 45분 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 베타 세포의 생존 능력을 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유전자 조작과 같은 다른 방법을 수행하여 베타 세포 기능에 대한 특정 유전자의 역할을 이해할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 개별 베타 세포 내에서 포도당 반응을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

analysis-beta-cell-function-using-single-cell-resolution-calcium

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이 비디오는 췌장섬 세포의 작은 하위 집단에서 세포질 칼슘 농도의 변화를 연구하기 위해 섬 세포를 실시간으로 이미징하는 기술을 설명합니다. 소세포 하위집단은 아드레날린(adrenaline) 및 그렐린(ghrelin)과 같은 마커 화합물에 대한 기능적 반응을 사용하여 확인할 수 있으며, 이는 섬세포의 특정 집단에서 세포질 칼슘의 변화를 유도합니다. 이것은 혈당과 섬 분비 출력 사이의 교차 담화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

췌장 세포의 칼슘 역학 이미징: 췌장 섬의 세포질 칼슘 농도의 실시간 변화를 연구하는 기술

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

zebrafish 모델 시스템을 포함 한 광학 선명도, 급속 한 외부 개발, 많은 귀중 한 기능을가지고 있으며, 청각과 균형의 분야에 특별 한 중요성의 외부 감각 머리 세포 이다. 이 문서 설명 어떻게 유전자 변형 zebrafish 토토 mechanosensation 머리 세포와 연 접 기능을 시험 하는 데 사용할 수 있습니다.

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

우리는 급성 췌장 조직 조각의 준비와 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에서의 사용을 제시하여 많은 수의 살아있는 세포, 오랜 기간 동안 그리고 높은 시공간 분해능으로 칼슘 역학을 동시에 연구합니다.

급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

이 프로토콜은 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 바이오센서, cAMP 차이 검출기 in situ (cADDis) 및 미세페리퓨전 시스템의 아데노바이러스 전달을 사용하여 일차 인간 유사섬에 의한 세포 내 신호전달 이벤트의 동기 획득 및 공동 정합 및 인슐린 및 글루카곤 분비를 위한 방법을 설명합니다.

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

여기에서는 성인 제브라피쉬의 등쪽 전뇌에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

여기에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 GCaMP 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 뇌 영역에서 신경 활동을 조사하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 부분적으로 구속된 유충 제브라피시에서 감각 자극에 의해 유도된 신경 활동의 공초점 형광 이미징

배우세요 제브라피시 Danio rerio 베타세포에서 GCaMP6s를 이용한 단일 세분화 칼슘 이미징 방법으로 포도당 자극에 따른 세포 내 칼슘 역학을 실시간 관찰하고 베타세포 기능과 이질성을 연구하는 기술입니다.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

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