DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

본 시연에서는 2D 및 3D 살아있는 세포 이미징을 사용하여 DNA 손상 반응에 관여하는 단백질들의 시공간적 관계를 이해합니다. 먼저, 적절한 형광 마커를 포함하는 발현 컨스트럭트를 선택한 세포주에 형질전환 또는 형질도입합니다. 여기서는 M Cherry와 GFP를 사용합니다. 그다음, 정상 조건에서 형광 표지된 세포들을 보여주는 일련의 대조군 영상을 획득합니다.

그 다음 적절한 처리를 적용하고 형광 세포 과정에 미치는 처리 효과의 데이터를 캡처하며, 단백질의 시공간적 관계를 확인하기 위해 비디오 데이터를 분석합니다. 궁극적으로, 살아있는 세포의 형광 현미경 관찰을 통해 DNA 손상 유발 인자에 반응하여 형성되는 53 BP one foci나 유사분열 중 53 BP one의 거동과 같은 세포 역학을 상세히 파악할 수 있습니다. 저희는 특정 세포주에서 다양한 처리가 유사분열에 어떤 영향을 미치는지 연구하고자 했을 때 처음으로 2D 및 3D 라이프스타일 이미징에 관심을 갖게 되었습니다.

이 실험적 접근법을 통해 기존의 방법보다 DNA 손상 응답과 게놈 안정성 유지를 더 용이하게 연구할 수 있습니다. 또한, 이 방법을 사용하여 다양한 신호 전달 경로와 다양한 세포주에서 특정 단백질들이 어떻게 상호작용하는지 연구할 수 있습니다. 세포 화학과 같은 전통적인 기술에 비해 라이브 셀 이미징의 주요 장점은 DNA 손상 응답 단백질을 실시간으로 연구할 수 있다는 점입니다.

적절한 기록 조건을 최적화하는 것은 어려울 수 있습니다. 본 시연을 통해 성공적인 결과를 보장하는 데 필요한 여러 세부 단계들을 확인할 수 있습니다. 광퇴색을 최소화하고, 적절한 기록 간격과 기록 시간을 찾는 등의 과정에서는 끈기 있게 시도하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

mCherry 및 GFP 융합 단백질 발현을 위한 플라스미드를 적절한 세포주에 형질전환(transfect) 또는 형질도입(transduce)합니다. 약물 선택 배지에서 배양을 유지하고, 이미지 획득 전날에 형광 단백질의 발현 여부를 주기적으로 확인합니다. 트립신을 사용하여 세포를 수확합니다.

그 후, 3.5 centimeter fluoro dish glass bottom plates에 저밀도로 세포를 파종합니다. 본 프로토콜은 axio observer Z one 스탠드가 장착된 Zeiss cell observer SD spinning disc confocal microscope를 사용하여 개발되었습니다. 먼저, CO2 가스가 배양 시스템의 CO2 모듈로 공급되고 있는지 확인하십시오. 현미경이 진동 방지 Airtable 위에 설치되어 있다면, Airtable의 공기 공급 장치를 켜십시오.

이제 현미경 스탠드 스피닝 디스크 장치 카메라, 배양 모듈, HXP 조명 장치, 전동 스테이지, argon 레이저 및 컴퓨터의 전원을 켭니다. 사용할 레이저 라인의 스위치를 켭니다. Axio vision 소프트웨어를 실행합니다.

Avision 소프트웨어는 제어하는 현미경 및 구성 요소에 특화된 윈도우와 풀다운 메뉴로 사용자 정의할 수 있습니다. 이에 따라 각 사용자 인터페이스는 잠재적으로 고유한 외형을 가집니다. 이미징 시작 약 1시간 전에 인큐베이터 컨트롤을 찾아 상단 챔버와 스테이지 플레이트의 가열 기능을 켭니다.

온도를 37 °C로 설정하십시오. CO2 제어 기능을 켜고 농도를 5%로 설정하십시오. 본 연구의 이미징에 사용할 대물렌즈를 선택하십시오. 해당 대물렌즈는 물과 유사한 굴절률을 가진 침지매질을 사용해야 합니다.

장시간 동안 여러 위치를 이미징해야 하는 경우, 현미경 렌즈가 마르지 않도록 충분한 침지액을 도포하십시오. 배양 접시를 스테이지 위에 놓고, 현미경 조절기나 소프트웨어를 사용하여 대물렌즈를 바닥면에 닿을 때까지 올립니다. 방출된 빛을 접안렌즈로 유도하고, 관심 있는 형광 신호에 적합한 광시야 필터 세트를 선택하십시오.

이제 접안렌즈를 통해 관찰하십시오. 소프트웨어나 현미경 컨트롤러를 사용하여 이미지를 초점에 맞추고 적절한 세포 영역을 찾으십시오. 소프트웨어에서 방출광의 방향을 접안렌즈가 아닌 공초점 스피닝 디스크 유닛이 연결된 포트로 설정하십시오.

본 연구에 적합한 레이저를 켭니다. 각 채널에 대해 kuo optic 가변 필터 컨트롤을 적절한 수준으로 조절하여 레이저 강도를 조정합니다. 그다음, 적절한 다이크로익 미러와 방출 필터를 선택합니다.

스피닝 디스크 유닛의 셔터를 엽니다. 이제 라이브 창을 선택하여 현재 시야를 표시합니다. 그런 다음 카메라 제어 창을 엽니다.

사용할 카메라를 선택하고 노출 시간을 약 100 milliseconds로 설정하십시오. 필요에 따라 퍼센트 및 EM 게인을 조정하십시오. 또한, 공초점 스피닝 디스크 장치 제어창을 열고, 적절한 이미지를 캡처하기 위해 설정한 카메라 노출 시간을 입력하여 스피닝 디스크 속도를 조정하십시오.

설정(set)을 클릭하여 변경 사항을 적용합니다. 이제 다차원 획득(multi-dimensional acquisition) 창을 엽니다. 채널 탭을 선택하고 Flora Fours에 정의된 적절한 채널을 불러오거나 선택합니다.

이미지 정합을 보장하기 위해 두 채널 모두에 공통 다이크로익 미러(dichroic mirror)를 사용하십시오. 소프트웨어를 자동 초점으로 설정하십시오. MDA 창으로 이동하여 ZS stack 탭을 클릭하십시오.

현재 초점 위치에서 ZS 스택을 선택하십시오. 10 micron Z스택 범위를 설정하고, Z축 방향의 나이퀴스트 샘플링(nyquist sampling)을 보장하기 위해 최적의 단계 수를 선택하십시오. 이제 시작을 클릭하고 결과로 생성된 Z 스택 이미지를 분석하십시오. 시간 탭을 선택하십시오.

이미징 시점 간의 간격과 세션의 전체 지속 시간을 설정하십시오. 디쉬 내 여러 세포의 다지점 이미징을 수행하려면 MDA 창을 엽니다. Position 탭을 선택하고 'apply setting before or after time point per position' 설정이 체크되어 있는지 확인하십시오.

이제 mark를 선택하십시오. 라이브 뷰를 사용하여 적절한 시야를 찾고, 디쉬를 이동시켜 선택합니다. 다차원 획득(multidimensional acquisition) 메뉴에서 start를 클릭하여 실험을 시작하고 대조군 영상을 기록하십시오.

적절한 처리를 수행하고 정해진 시간 간격으로 일정 기간 동안 실험 영상을 기록하십시오. 본 세포주에서 유사분열의 전체 과정을 모니터링하기 위해 7.5분 간격으로 4~5시간 동안 촬영하였습니다. 사용자의 세포주와 연구 목적에 맞는 특정 설정을 직접 결정해야 합니다.

Velocity 소프트웨어를 실행하고, 새 라이브러리를 생성하여 이름을 지정한 다음, 실험 영상 파일들을 불러와 확인합니다. 확장 초점(extended focus) 설정을 사용해 보고, 필요에 따라 영상을 조정하십시오. Velocity에는 획득한 이미지의 품질을 향상시키는 데 도움이 되는 다양한 도구가 갖춰져 있습니다.

현미경 설정을 적절하게 맞추면 이후 편집 단계에서 많은 시간을 절약할 수 있습니다. 일반적으로 이미지를 디컨볼루션(deconvolve)하고 밝기와 대비를 조정하는 것이 유용하며, 구체적인 설정 값은 실험 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 세포를 3D로 관찰하려면 3D 투명도(opacity) 설정으로 전환하십시오.

이를 통해 3D 렌더링된 세포를 공간 상에서 회전시킬 수 있어, 세포 내 관심 구조에 대한 다양한 관점을 제공할 수 있습니다. 동영상 및 정지 영상은 사용자 선호도에 따라 다양한 파일 형식으로 내보낼 수 있습니다. 대조군과 비교했을 때, CPT에 노출된 섬유아세포는 5~10분 이내에 foci를 형성하였으며 녹화 기간 내내 이러한 foci를 유지하였습니다.

흥미롭게도, 인간 배아 신장 세포에서 53 BP1은 유사분열이 시작될 때 염색질에서 해리되어, 응축되는 염색체 주변에 얇은 안개 형태를 형성합니다. 텔로페이즈가 발생하고 유사분열이 끝나면 53 BP1은 다시 뚜렷한 포커스로 응집됩니다. 이 비디오가 DNA 손상 반응 및 기타 경로에 관여하는 단백질들의 시공간적 관계를 연구하는 데 도움이 되기를 바랍니다.

예를 들어, 염색질 역학 분야에서 이 기술은 53 BP1 결합이 DNA 텔로미어 말단의 이동에 어떤 영향을 미치는지 연구하는 데 사용되었습니다. 유전자 변형 세포를 제작한 후, 약 4~8시간 동안 2D 및 3D 살아있는 세포 이미징을 수행할 수 있습니다. 최적의 이미징을 위해 현미경 설정이 적절하게 조정되었는지 확인하십시오.