Name: DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 DNA 손상 응답 단백질의 2차원 및 3차원 라이브 셀 이미징 방법을. 형광 마커를 이용한 실시간 관찰로 53BP1 단백질의 역학과 유사분열 중 거동을 분석할 수 있습니다.

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R01NS064593 및 R21ES016636 (KV)에 의해 부분적으로 지원. 현미경은 VCU에서 수행 된 - 신경 생물학 및 해부학 현미경 시설의 부, NIH-NINDS 센터 핵심 보조금 5P30NS047463의 자금으로 일부를 지원합니다. 회전 디스크 공 촛점 현미경은 NIH-NCRR 상 (1S10RR027957)를 구입했습니다.

A. 셀 준비 <ol><li> 일반 인간의 기본 섬유 아세포 (GM02270)는 Coriell 셀 저장소, 캠든 (Camden), 뉴저지에서 얻은 및 hTERT 6 불후의되었습니다. 셀은 CellStar에서 재배하고 확장 된 20% 태아 소 혈청 (GIBCO), non-essential/essential 아미노산, 비타민, 나트륨 pyruvate, 그리고 페니실린 / 스트렙토 마이신 (HyClone을 보충 가상으로 구성된 미디어 6 cm 요리 (4 ML) ). </li><li> 인간 배아 신장 293 (HEK293) 전지는 미국 유형 문화 수집에서 얻은 및 CellStar 6 cm 요리에서 재배하고 확장되었습니다. 세포 10 % 태아 소 혈청, 비 필수 아미노산, L-글루타민과 보충 DMEM, 그리고 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 구성된 미디어 (4 ML)에 보관되었다. </li><li> 53BP1 - mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC - Puro, Addgene 플라스미드 19836) 및 H2B-GFP (pCLNR-H2BG, Addgene 플라스미드 17735)이 융합 유전자는 puromycin 또는 G418 저항 유전자를 표현 구조, 각각 (fibrobla transduced되었습니다STS) 또는 transfected (HEK293)는 세포에 SuperFect (Qiagene)을 사용 및 약물 선택에 따라 유지. 형광의 유지 관리가 주기적으로 확인되었습니다. </li><li> 24-48 시간 이미지 수집하기 전에 셀은 하나의 셀 정지로 trypsinized되었으며 3.5 cm FluroDish 유리 바닥 판에 낮은 밀도에 놓는. </li></ol> B. 현미경 설정 및 이미지 수집 이 프로토콜은 AxioObserver Z1 스탠드, 듀얼 채널 Yokagawa CSU-X1A 5,000 회전 디스크 장치, 2 Photometrics QuantEM 512SC emCCD 카메라, HXP 120C 섬유 기반의 조명기, 4이 장착 된 Zeiss 셀 옵저버 SD 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여 개발 된 레이저 (Lasos 100mW 여러 줄 아르곤 [458, 488, 514 nm의], 50 MW 405 nm의 다이오드, 40 MW 561 nm의 다이오드, 30 MW 635 nm의 다이오드), AOTF, Pecon XL multiS1 단계의 배양 시스템, Zeiss의 배양 모듈 (O 2 모듈 S, CO 2 모듈 S, TempModule의 S, 난방 단위 XL S) 및 이전 모NanoScanZ 압전 Z 삽입과 torized XY 무대. 영상 라이브 세포가 수성 매체, C-고차 색지움 63x/1.20 물 / Corr 목적 렌즈와 Zeiss Immersol W 침적 액 (굴절률 n은 = 1.334 포함)에서 지원하는 반면 구형 aberrations을 최소화하려면 사용되었습니다. 2 채널 공 촛점 이미징, RQFT 405/488/568/647 이색 성 거울과 BP525/50 (녹색)과 BP629/62를 들어 (빨간색) 방출 필터가 사용되었습니다. 사용 시스템 소프트웨어 AV4 Multi-channel/Z/T, 빠른 이미징, 생리학, MosaiX, 마크 찾기 (&amp; F), 듀얼 카메라, 4D 내부, 자동 초점 및 3-D의 Deconvolution 모듈과 Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0)였습니다. <ol><li> 그 CO 2 가스가 부화 시스템의 CO 2 모듈로 실행 중인지 확인하십시오. 현미경은 방진 공기 테이블에서 지원하는 경우, 공기 테이블에 대한 공기 공급 (또는 N 2 가스)를 설정합니다. </li><li> 회전 디스크 장치, 카메라, 부화 모듈, HXP 조명기, 동력 무대, 아르곤, 현미경 스탠드의 전원을 켭니다레이저, 컴퓨터. </li><li> 워밍업 시간이 1 분 후 &quot;On&quot;으로 아르곤 레이저에 대한 점화 키를 켜십시오. </li><li> Zeiss 레이저 제어 패널에서 사용되는 레이저 라인의 스위치를 켜십시오. </li><li> &quot;레이저 실행&quot;를 &quot;대기 모드&quot;에서 Lasos 아르곤 레이저 컨트롤러에 대한 토글 스위치를 전환하고 최적의 수준 (아래 예 녹색 표시기가 빨간색으로 바뀌고 지점)에 빛 컨트롤러를 조정합니다. </li><li> AxioVision 소프트웨어를 시작합니다주의 :. AxioVision의 사용자 인터페이스가 제어하는 특정 현미경과 구성 요소에 대한 구체적인 창문과 풀다운 메뉴를 사용자 정의 할 수 있습니다. 따라서, 각 시스템은 잠재적으로 독특한 인터페이스를 갖추고 있습니다. 따라서, 소프트웨어 조작에 대한 일반적인 지침은 오히려 특정 소프트웨어 창, 탭 및 / 또는 풀다운 메뉴에 대한 방향보다 다음 단계로 제공됩니다. </li><li> 이미징하기 전에 약 1 시간은 소프트웨어, 보육에 대한 컨트롤을 찾아상부 챔버와 무대 판에 난방을 설정합니다. 37 ° C.에 온도를 설정 CO 2 제어 전원을 켜고 5 % 수준을 설정합니다. </li><li> 이미징을위한 목적 렌즈를 선택합니다. 본 연구에서는 63x/1.20 NA C-고차 색지움 물 / Corr 객관적인 렌즈는 사용 된 참고 :.이 렌즈를 들어, 물 (Zeiss Immersol W 침적 액)과 유사한 굴절률과 집중 매체가 필요합니다. </li><li> 여러 별도의 위치는 오랜 기간 동안 샘플링 할 경우,이 한 위치에서 다른 실행되도록 집중 매체의 충분한 양을 적용 할 확신 할 수. </li><li> 무대에 요리를 놓고 바닥과 접촉 목적 렌즈를 가져. </li><li> 현미경 통제 또는 소프트웨어 중 하나를 사용하여 접안 렌즈로 방출되는 광을 직접하고 적절한 widefield 필터가 관심의 형광 신호 (이 연구에 대해 &quot;레드&quot;필터 53BP1와 &#39;GFP &quot;필터 설정 H2B에 대해 설정에 대해 설정을 선택 ). &lt;/ 리&gt; <li> , 안구 렌즈를 통해보기 이미지를 집중하고, 세포의 적절한 필드를 찾습니다. </li><li> 소프트웨어 또는 현미경 컨트롤 중 하나를 사용하여 공 촛점 회전 디스크 장치와 포트에 접안 렌즈에서 방출되는 광을 멀리 지시. </li><li> 소프트웨어에서 해당 레이저 (이 연구 53BP1에 대한 561 nm의 레이저와 H2B에 대한 아르곤 레이저의 488 nm의 선)을 설정합니다. </li><li> 각 채널에 대해 적절한 수준으로 음향 광학 조정할 수있는 필터 (AOTF) 컨트롤을 조정하여 레이저의 강도를 조정합니다. </li><li> 해당 이색 성 거울 (RQFT 405/488/568/647) 및 방출 필터를 (H2B에 대한 53BP1 및 BP 50분의 525에 대한 BP 62분의 629)을 선택합니다. 회전 디스크 장치에 셔터를 엽니 다. </li><li> 보기의 현재 필드를 표시하려면 &quot;라이브&quot;창을 선택합니다. </li><li> 소프트웨어에서 &quot;카메라&quot;제어를 열고 카메라 (듀얼 카메라 시스템 경우) 사용을 선택하고 약 100 밀리로 노출 시간을 설정합니다. %를 조정하고 EM은 얻을 NEC 등. essary 참고 : 53BP1-mCherry의 구조는 다소 희미 나타납니다. 우리는 EM 게인을 증가하는 것이 도움이 발견했습니다. </li><li> 소프트웨어에서 공 촛점 회전 디스크 단위 컨트롤을 열고 적절한 이미지를 (예를 들면 ~ 100 밀리 초) 캡처하도록 설정 한 카메라 노출 시간을 입력하여 회전 디스크 속도를 조정합니다. 변화를 잠글 &quot;설정&quot;을 클릭하십시오. </li><li> &quot;다차원 인수&quot;를 엽니 다. 채널 탭을 선택하고로드 / 해당 채널을 선택합니다. 본 연구의 경우, 우리는 dsRed (561 nm의 레이저 여기와 BP 629 / 방출에 대한 62 필터)와 GFP (여기와 방출 BP525/50 필터에 대한 488 nm의 레이저 라인)에 대해 정의 채널을 사용하고 있습니다. </li><li> 이미지 등록을 보장하기 위해 공통의 이색 성 거울 (RQFT 405/488/568/647)는 두 채널 모두 사용되었다. &quot;자동 초점&quot;로 소프트웨어를 설정합니다. 참고 : MDA 설정을 조정 도구 → 설정 편집기로 이동합니다. 그 적절한 레이저 전원 ( &quot;적절한 레이저 전원이&quot;당신을 수있는 설정을 나타냅니다 설정되어 있는지 확인사진 표백을 최소화하면서) 적절한 형광을 자극 할 수 있습니다. </li><li> MDA 창에서 Z-스택 탭을 선택합니다. &quot;Z-스택 현재의 초점 위치에&quot;를 선택하십시오. Z-스택의 정확한 크기는 셀의 높이에 따라 달라집니다 : ~ 10 μm Z-스택과 Z. 참고를 나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링을 보장하는 단계의 수에 대해 &quot;최적&quot;를 선택의 범위를 설정합니다. 그에 따라 조정합니다. </li><li> 23. &quot;시작&quot;과 설정이 조사하는 일에 대한 적절한 보장하기 결과 Z-스택 이미지를 분석을 클릭합니다 (예를 들어 본 연구에서는, 그것은 이미지가 전체 핵을에 중요). </li><li> &quot;T&quot;(시간) 탭을 선택합니다. camptothecin과의 실험, 우리는 5 분 및 제어 (비 처리 세포) 동영상에 대한 1 시간의 세션의 전체 기간에 영상 timepoints 사이의 간격을 설정합니다. 참고 : 셀의 사진 표백 최소화하기 위해, 실험 구성해야합니다 이러한 이미징 시간 지점 사이의 AOTF는 공백 레이저를 그. </li><li> 에프또는 접시의 여러 세포의 다 지점 영상은 MDA 창에서 위치 탭을 선택합니다. 체크되어 &quot;당 위치의 시간 지점 / 후 전에 설정을 &#39;이 적용&quot;. 확인 &quot;Mark_Find&quot;를 선택하십시오. &quot;라이브&quot;보기를 사용하여 주변의 접시를 이동 및보기의 해당 필드를 선택합니다. </li><li> 실험을 시작하고 (치료 세포의) 제어 비디오를 녹화 할 수 다차원-인수 메뉴에서 &quot;시작&quot;을 클릭합니다. </li><li> 제어 비디오 후 적절한 치료를 (이 경우, 10 μM의 camptothecin)을 추가 할 수 있습니다. 우리 2-4 시간 5-10 분 간격으로 실험 (약물 처리 세포) 동영상을 녹화. 참고 : 고려해야 할 중요한 문제는 주어진 효과가 치료 후 발생하는 속도입니다. 비디오에서 본 바와 같이, 53BP1 foci는 CPT의 추가 후 ~ 5 분부터 시작합니다. 비교적 쉬운 과정은 수​​동으로 요리에 약물을 추가하고 현미경을 다시 보정하는 것은 시간이 걸릴 않지만. 실험을 설계 할 때 고려 사항이에게 부여해야합니다. </li><li> m을 모니터링하기위한itosis, 우리는 7.5 분으로 간격을 설정하고 4-5 시간 (특정 설정을 사용 세포주 및 세포주기의 길이에 따라 달라)를 기록했다. 조정은 더 이상 녹음 중 사진 표백을 방지하기 위해 만든해야 할 수 있습니다. </li></ol> C. 이미지 처리 및 분석 이 프로토콜은 Volocity 소프트웨어 (PerkinElmer)를 사용하여 개발되었습니다. 이 데이터 (AxioVision)를 취득하는 데 사용되는 소프트웨어는 또한 이미지를 처리​​하고 분석 할 수있는 능력이 있습니다. 사용자는 그들에게 사용할 수있는 소프트웨어를 활용하고, 자신의 응용 프로그램에 대한 적절한 자료를 상담하는 것이 좋습니다. <ol><li> Volocity 소프트웨어를 엽니 다. 작성하고 새 도서관의 이름을 지정하고 비디오 파일을 가져옵니다. </li><li> 파일을보기 위해, 우리는 일반적으로 &quot;확장 초점&quot;설정을 사용하는 것이 가장 도움이 찾으십시오. 이 Z-스택 조각 superimposes 있으며,이 프로토콜에 대해 우리가 핵의 다른 영역에서 53BP1 foci를 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 필요에 따라 동영상을 조정할 수 있습니다. VOlocity는 획득 이미지의 품질을 개선 할 수있는 도구의 범위를 갖추고 있습니다. 현미경의 설정이 적절한 있었다함으로써 많은 시간이 나중에 편집에 저장할 수 있습니다. 종종, 그것은 이미지를 deconvolve하고, 밝기 / 대비를 조정하는 도움이 될 것입니다. 특정 편집 요구는 실험에 따라 달라집니다. </li><li> 상대 타임 스탬프와 규모 막대를 추가합니다. </li><li> 3-D에서 세포를 보려면 &quot;3-D 불투명도&quot;설정으로 전환합니다. 이 때문에 세포 내 관심 구조의 여러 관점을 제공, 공간의 3-D 렌더링 세포의 회전을 허용. 참고 :이 결정하는 다른 비행기에 세포를 시각화하는 데 도움 곳이자 여행의 구조. 예를 들어, &quot;확장 초점&quot;설정에서의 53BP1이 실제로 유사 분열 동안 DNA에서 해리 않는 분별하기가 어렵습니다. 그러나,이 3-D에 쉽게 명백합니다. </li><li> 동영상 및 스틸 이미지는 사용자 환경 설정에 따라 파일 형식의 다양한으로 수출 할 수 있습니다. </l<html> I&gt; </ol> D. 대표 결과 CPT에 대응 53BP1 foci 형성의 예는 그림 1에 표시됩니다. 셀 5-10 분 이내에 CPT 양식 foci에 노출 및 녹음 기간 내내이 foci를 유지하고 있습니다. 이름으로 응축 염색체 주위에 얇은 연무를 형성 그림 2, 유사 분열의 시작에서 염색질에서 53BP1 dissociates에 표시. telophase가 발생하고 유사 분열이 종료됩니다 바와 같이, 뚜렷한 foci로 53BP1 다시 한번 집계. HEK293 세포 CPT에 노출되지 않은 상태에서, 그들은 그럼에도 불구하고 내생 DNA 손상에 의해 생성 된 풍부한, 자연 53BP1 수리 foci를 형성. 이 관찰은 우리가 53BP1는 이온화 방사선 및 radiomimetic 약 5 셀의 노출 후 비슷한 효과를 보여주는 이전 보고서에 맞추어 초기 유사 분열 동안 foci를 형성하지 않는 결론을 할 수있었습니다. 우레 1 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. Camptothecin (10 μM)는 DSBs 및 매체에 약물을 추가 30 분 이내에 섬유 아세포를 자전거에 53BP1 foci 형성이 발생합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> 그림 2. 53BP1는 HEK293 세포에 telophase/G1까지 유사 분열 동안 foci를 형성하지 않습니다.

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</ol>

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게놈 무결성의 유지 관리 세포 생존을위한 중요합니다. 조기 노화, 발암 또는 사망 8 게놈 결과를 보존 실패했습니다. 안목에 강렬한 관심이 얼마나 기본 및 임상 모두 연구의 중요성에서 형태소 분석 DDR 기능. 대부분의 기술은 세포가 감지하고 DNA 손상을 복구하는 방법의 연구에 도움이 년 동안 개발되었습니다. 기술의 최근 진보가 점점 더 정교한 방법이 진화 할 수는 않았지만 blotting 등 immunocytochemistry과 서양 등의 전통적인 방법은 필드의 mainstays했습니다. 이 프로토콜에 설명으로, 세포 이미징 라이브, 우리가 더 전통적인 기법으로 간과 DDR의 특성을 연구 할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징의 사용에 중심이 휘황이라는 단백질을 만드는 것이다. 여기 우리는 DDR에 참여 mCherry 태그 단백질, 53BP1뿐만 아니라 히스톤 H2B의 사용을 설명- GFP 융합 제품입니다. 휘황 분류 단백질은 분자와 세포 생물학에서 널리 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 생성물 </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> CellStar 문화 요리 </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td></tr><tr><td> FluroDish 유리 바닥 요리 </td><td> 세계 정밀 기기 주식회사 </td></tr><tr><td> 가상 미디어 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 아미노산 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 비타민 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC - Puro, 플라스미드 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR - H2BG, 플라스미드 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss 셀 옵저버 SD 이미징 시스템 </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (릴리스 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W 오일 </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity 소프트웨어 (버전 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

dna의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

두 번 스트랜드 바꿈이 (DSBs) 가장 해로운 DNA 아르 것은 셀 발생할 수 있습니다 병변. unrepaired 왼쪽 경우, DSBs 항구 잠재력은 돌연변이와 염색체 aberrations 하나를 생성합니다. DSBs을 감지하는 세포가 DNA 손상 반응 (DDR)을 활성화하고, DNA를 수리에 대한 게놈 불안정성을 catalyzing에서이 외상을 방지하기 위해, 그것은 매우 중요합니다. 자극하면, DDR 수리가 이루어 또는 apoptosis를 받아야하는 셀을 강제 할 수 있도록 세포주기의 체포를 실행하여 게놈 무결성을 유지하기 위해 노력하고 있습니다. DSB 수리의 주된 메커니즘은 nonhomologous 최종 입사 (NHEJ) 및 동종 재조합 수리 (HRR) (2에서 검토)를 통해 발생합니다. 그의 활동을 정확하게 DDR가 제대로 작동 할 수 있도록 조정해야합니다 많은 단백질이 있습니다. 이러한 단백질 중 하나 53BP1의 3 차원 (D) 시각화 - 여기, 우리는 2에 대한 방법을 설명합니다. p53의 결합 단백질 1 (53BP1는)의 영역에 localizes5-15분 5에서 foci를 형성, 수정 histones 3,4에 바인딩하여 DSBs. DSB 사이트에 53BP1 및 기타 DDR 단백질의 히스톤 수정 및 채용은 피해 지역 주변 염색질의 구조 다시 정리하기를 촉진하고 DNA 복구 6 기여할 것으로되어 있습니다. 수리에 직접 참여 외에도 추가 역할은 이러한 내부-S 검사 점 (Checkpoint), G2 / M 검문소를 조절하고 하류 DDR 단백질에게 7-9 활성화로 DDR에 53BP1에 대해 설명되어 있습니다. 최근,이 53BP1 대신 DSBs 6 근처에 로컬 라이즈하기 전에 G1를 입력 할 셀을 기다리고, 유사 분열 동안 유도 DNA 손상에 대한 응답으로 foci를 형성하지 않는 것을 발견했습니다. 같은 53BP1 등의 DDR 단백질은 세포의 유사 분열부터 10까지 진행하는 동안 mitotic 구조 (예 : kinetochores 등)과 연관이 발견되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 (2)의 사용을 설명 - 3-D 라이브 세포 이미징은 시각화하는DNA 손상 대리인 camptothecin (CPT)뿐만 아니라, 유사 분열 동안 53BP1의 행동에 대응 53BP1 foci의 형성. Camptothecin는 주로​​ DNA 복제 동안 DSBs의 원인이 제가 억제제가 topoisomerase입니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 이전에 설명 53BP1 - mCherry 형광 융합 단백질은 DSBs 11 바인딩 할 수 53BP1 단백질 도메인으로 구성을 구성했습니다. 또한, 우리는 히스톤 H2B-GFP 형광 융합 단백질은 세포의 유사 분열 12시 세포주기에 걸쳐 있지만, 특히 염색질 역학을 모니터링 할 수 구성 사용됩니다. 여러 차원에서 라이브 셀 이미징은 진핵 세포의 DDR 단백질의 기능에 대한 우리의 이해를 깊게 할 수있는 훌륭한 도구입니다.

이 프로토콜은 DNA 손상뿐만 아니라 유사 분열 동안의 현지화에 대한 응답으로 활성화 DNA 이중 가닥 브레이크 신호 단백질을 시각화하는 방법을 설명합니다.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

이중 가닥 절단(Double-strand breaks, DSBs)은 세포가 겪을 수 있는 가장 치명적인 DNA 손상입니다. 수선되지 않은 DSB는 ...를 유발할 가능성이 매우 높습니다.

본 시연에서는 2D 및 3D 살아있는 세포 이미징을 사용하여 DNA 손상 반응에 관여하는 단백질들의 시공간적 관계를 이해합니다. 먼저, 적절한 형광 마커를 포함하는 발현 컨스트럭트를 선택한 세포주에 형질전환 또는 형질도입합니다. 여기서는 M Cherry와 GFP를 사용합니다. 그다음, 정상 조건에서 형광 표지된 세포들을 보여주는 일련의 대조군 영상을 획득합니다.그 다음 적절한 처리를 적용하고 형광 세포 과정에 미치는 처리 효과의 데이터를 캡처하며, 단백질의 시공간적 관계를 확인하기 위해 비디오 데이터를 분석합니다. 궁극적으로, 살아있는 세포의 형광 현미경 관찰을 통해 DNA 손상 유발 인자에 반응하여 형성되는 53 BP one foci나 유사분열 중 53 BP one의 거동과 같은 세포 역학을 상세히 파악할 수 있습니다. 저희는 특정 세포주에서 다양한 처리가 유사분열에 어떤 영향을 미치는지 연구하고자 했을 때 처음으로 2D 및 3D 라이프스타일 이미징에 관심을 갖게 되었습니다.이 실험적 접근법을 통해 기존의 방법보다 DNA 손상 응답과 게놈 안정성 유지를 더 용이하게 연구할 수 있습니다. 또한, 이 방법을 사용하여 다양한 신호 전달 경로와 다양한 세포주에서 특정 단백질들이 어떻게 상호작용하는지 연구할 수 있습니다. 세포 화학과 같은 전통적인 기술에 비해 라이브 셀 이미징의 주요 장점은 DNA 손상 응답 단백질을 실시간으로 연구할 수 있다는 점입니다.적절한 기록 조건을 최적화하는 것은 어려울 수 있습니다. 본 시연을 통해 성공적인 결과를 보장하는 데 필요한 여러 세부 단계들을 확인할 수 있습니다. 광퇴색을 최소화하고, 적절한 기록 간격과 기록 시간을 찾는 등의 과정에서는 끈기 있게 시도하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.mCherry 및 GFP 융합 단백질 발현을 위한 플라스미드를 적절한 세포주에 형질전환(transfect) 또는 형질도입(transduce)합니다. 약물 선택 배지에서 배양을 유지하고, 이미지 획득 전날에 형광 단백질의 발현 여부를 주기적으로 확인합니다. 트립신을 사용하여 세포를 수확합니다.그 후, 3.5 centimeter fluoro dish glass bottom plates에 저밀도로 세포를 파종합니다. 본 프로토콜은 axio observer Z one 스탠드가 장착된 Zeiss cell observer SD spinning disc confocal microscope를 사용하여 개발되었습니다. 먼저, CO2 가스가 배양 시스템의 CO2 모듈로 공급되고 있는지 확인하십시오. 현미경이 진동 방지 Airtable 위에 설치되어 있다면, Airtable의 공기 공급 장치를 켜십시오.이제 현미경 스탠드 스피닝 디스크 장치 카메라, 배양 모듈, HXP 조명 장치, 전동 스테이지, argon 레이저 및 컴퓨터의 전원을 켭니다. 사용할 레이저 라인의 스위치를 켭니다. Axio vision 소프트웨어를 실행합니다.Avision 소프트웨어는 제어하는 현미경 및 구성 요소에 특화된 윈도우와 풀다운 메뉴로 사용자 정의할 수 있습니다. 이에 따라 각 사용자 인터페이스는 잠재적으로 고유한 외형을 가집니다. 이미징 시작 약 1시간 전에 인큐베이터 컨트롤을 찾아 상단 챔버와 스테이지 플레이트의 가열 기능을 켭니다.온도를 37 °C로 설정하십시오. CO2 제어 기능을 켜고 농도를 5%로 설정하십시오. 본 연구의 이미징에 사용할 대물렌즈를 선택하십시오. 해당 대물렌즈는 물과 유사한 굴절률을 가진 침지매질을 사용해야 합니다.장시간 동안 여러 위치를 이미징해야 하는 경우, 현미경 렌즈가 마르지 않도록 충분한 침지액을 도포하십시오. 배양 접시를 스테이지 위에 놓고, 현미경 조절기나 소프트웨어를 사용하여 대물렌즈를 바닥면에 닿을 때까지 올립니다. 방출된 빛을 접안렌즈로 유도하고, 관심 있는 형광 신호에 적합한 광시야 필터 세트를 선택하십시오.이제 접안렌즈를 통해 관찰하십시오. 소프트웨어나 현미경 컨트롤러를 사용하여 이미지를 초점에 맞추고 적절한 세포 영역을 찾으십시오. 소프트웨어에서 방출광의 방향을 접안렌즈가 아닌 공초점 스피닝 디스크 유닛이 연결된 포트로 설정하십시오.본 연구에 적합한 레이저를 켭니다. 각 채널에 대해 kuo optic 가변 필터 컨트롤을 적절한 수준으로 조절하여 레이저 강도를 조정합니다. 그다음, 적절한 다이크로익 미러와 방출 필터를 선택합니다.스피닝 디스크 유닛의 셔터를 엽니다. 이제 라이브 창을 선택하여 현재 시야를 표시합니다. 그런 다음 카메라 제어 창을 엽니다.사용할 카메라를 선택하고 노출 시간을 약 100 milliseconds로 설정하십시오. 필요에 따라 퍼센트 및 EM 게인을 조정하십시오. 또한, 공초점 스피닝 디스크 장치 제어창을 열고, 적절한 이미지를 캡처하기 위해 설정한 카메라 노출 시간을 입력하여 스피닝 디스크 속도를 조정하십시오.설정(set)을 클릭하여 변경 사항을 적용합니다. 이제 다차원 획득(multi-dimensional acquisition) 창을 엽니다. 채널 탭을 선택하고 Flora Fours에 정의된 적절한 채널을 불러오거나 선택합니다.이미지 정합을 보장하기 위해 두 채널 모두에 공통 다이크로익 미러(dichroic mirror)를 사용하십시오. 소프트웨어를 자동 초점으로 설정하십시오. MDA 창으로 이동하여 ZS stack 탭을 클릭하십시오.현재 초점 위치에서 ZS 스택을 선택하십시오. 10 micron Z스택 범위를 설정하고, Z축 방향의 나이퀴스트 샘플링(nyquist sampling)을 보장하기 위해 최적의 단계 수를 선택하십시오. 이제 시작을 클릭하고 결과로 생성된 Z 스택 이미지를 분석하십시오. 시간 탭을 선택하십시오.이미징 시점 간의 간격과 세션의 전체 지속 시간을 설정하십시오. 디쉬 내 여러 세포의 다지점 이미징을 수행하려면 MDA 창을 엽니다. Position 탭을 선택하고 'apply setting before or after time point per position' 설정이 체크되어 있는지 확인하십시오.이제 mark를 선택하십시오. 라이브 뷰를 사용하여 적절한 시야를 찾고, 디쉬를 이동시켜 선택합니다. 다차원 획득(multidimensional acquisition) 메뉴에서 start를 클릭하여 실험을 시작하고 대조군 영상을 기록하십시오.적절한 처리를 수행하고 정해진 시간 간격으로 일정 기간 동안 실험 영상을 기록하십시오. 본 세포주에서 유사분열의 전체 과정을 모니터링하기 위해 7.5분 간격으로 4~5시간 동안 촬영하였습니다. 사용자의 세포주와 연구 목적에 맞는 특정 설정을 직접 결정해야 합니다.Velocity 소프트웨어를 실행하고, 새 라이브러리를 생성하여 이름을 지정한 다음, 실험 영상 파일들을 불러와 확인합니다. 확장 초점(extended focus) 설정을 사용해 보고, 필요에 따라 영상을 조정하십시오. Velocity에는 획득한 이미지의 품질을 향상시키는 데 도움이 되는 다양한 도구가 갖춰져 있습니다.현미경 설정을 적절하게 맞추면 이후 편집 단계에서 많은 시간을 절약할 수 있습니다. 일반적으로 이미지를 디컨볼루션(deconvolve)하고 밝기와 대비를 조정하는 것이 유용하며, 구체적인 설정 값은 실험 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 세포를 3D로 관찰하려면 3D 투명도(opacity) 설정으로 전환하십시오.이를 통해 3D 렌더링된 세포를 공간 상에서 회전시킬 수 있어, 세포 내 관심 구조에 대한 다양한 관점을 제공할 수 있습니다. 동영상 및 정지 영상은 사용자 선호도에 따라 다양한 파일 형식으로 내보낼 수 있습니다. 대조군과 비교했을 때, CPT에 노출된 섬유아세포는 5~10분 이내에 foci를 형성하였으며 녹화 기간 내내 이러한 foci를 유지하였습니다.흥미롭게도, 인간 배아 신장 세포에서 53 BP1은 유사분열이 시작될 때 염색질에서 해리되어, 응축되는 염색체 주변에 얇은 안개 형태를 형성합니다. 텔로페이즈가 발생하고 유사분열이 끝나면 53 BP1은 다시 뚜렷한 포커스로 응집됩니다. 이 비디오가 DNA 손상 반응 및 기타 경로에 관여하는 단백질들의 시공간적 관계를 연구하는 데 도움이 되기를 바랍니다.예를 들어, 염색질 역학 분야에서 이 기술은 53 BP1 결합이 DNA 텔로미어 말단의 이동에 어떤 영향을 미치는지 연구하는 데 사용되었습니다. 유전자 변형 세포를 제작한 후, 약 4~8시간 동안 2D 및 3D 살아있는 세포 이미징을 수행할 수 있습니다. 최적의 이미징을 위해 현미경 설정이 적절하게 조정되었는지 확인하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 방사선 조사된 세포핵의 이중 가닥 DNA 절단 부위에서 DNA 복구 단백질 γH2AX 및 53BP1의 국소화를 시각화하기 위한 면역형광 방법에 대해 설명합니다.

DNA 복구 단백질 상호 작용의 면역형광 기반 시각화

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

이 프로토콜은 단일 분자 감도를 가진 DNA 이중 가닥 브레이크에서 전사를 검출하기 위하여 새로운 기자 유전자 시스템 및 실험적인 설치를 제시합니다.

DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

배우세요 DNA 손상 응답 단백질의 2차원 및 3차원 라이브 셀 이미징 방법을. 형광 마커를 이용한 실시간 관찰로 53BP1 단백질의 역학과 유사분열 중 거동을 분석할 수 있습니다.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

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