DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

이 시연은 2D 및 3D 라이브 셀 이미징을 사용하여 DNA 손상 반응에 관여하는 단백질의 공간적 시간 관계를 이해합니다. 먼저, 적절한 형광 마커를 포함하는 발현 구조체로 선택한 세포주를 transfection하거나 transduction합니다. 여기서 M Cherry와 GFP는 정상적인 조건에서 형광 표지된 세포를 보여주는 일련의 대조군 비디오를 획득합니다.

그런 다음 적절한 치료법을 적용하고 형광 세포 공정에 대한 치료 효과의 데이터를 캡처하고 단백질의 공간적, 시간적 관계에 대한 비디오 데이터를 분석합니다. 궁극적으로, 생세포 형광 현미경 검사는 DNA 손상 물질에 대한 반응으로 53 BP 1 초점의 형성 또는 유사 분열 중 53 BP one의 행동과 같은 세포 역학을 자세히 설명할 수 있습니다. 우리가 처음으로 2D 및 3D 라이프스타일 이미징에 관심을 갖게 된 것은 다양한 치료법이 특정 세포주에서 유사분열에 어떤 영향을 미치는지 연구하고 싶었을 때였습니다.

이 실험적 접근 방식을 통해 기존 방법보다 더 쉽게 DNA 손상 반응 및 게놈 안정성 유지를 연구할 수 있습니다. 또한 이 방법을 사용하여 특정 단백질이 다양한 신호 경로와 다양한 세포주에서 어떻게 상호 작용하는지 연구할 수 있습니다. 세포 화학과 같은 기존 기술에 비해 라이프스타일 이미징의 주요 장점은 DNA 손상 반응 단백질을 실시간으로 연구할 수 있다는 것입니다.

올바른 레코딩 조건을 최적화하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 데모를 사용하여 성공을 보장하는 데 필요한 많은 작은 단계를 확인할 수 있습니다. 끈기는 사진 탈색을 최소화하고, 올바른 녹화 간격과 올바른 녹화 시간을 찾는

mCherry 및 GFP 융합 단백질 발현을 위해 플라스미드로 적절한 세포주를 transfection하거나 transduction합니다. 약물 선별 하에 배양액을 유지하고 이미지 획득 전날 형광 단백질의 발현을 주기적으로 확인합니다. 트립신을 사용하여 세포를 수확합니다.

그런 다음 3.5cm 형광 접시 유리 바닥 판에 저밀도 배양물을 파종합니다. 이 프로토콜은 axio observer Z one stand가 장착된 Zeiss cell observer SD spinning disc 컨포칼 현미경을 사용하여 개발되었습니다.먼저 CO2 가스가 배양 시스템의 CO2 모듈로 흐르고 있는지 확인합니다. 현미경이 진동 방지 Airtable에 의해 지원되는 경우 Airtable의 공기 공급 장치를 켭니다.

이제 현미경 스탠드, 회전 디스크 장치 카메라, 인큐베이션 모듈, HXP 조명기, 전동 스테이지, 아르곤 레이저 및 컴퓨터의 전원을 켭니다. 사용할 레이저 라인의 스위치를 켭니다. Axio 비전 소프트웨어를 시작합니다.

Avision 소프트웨어는 현미경 및 현미경이 제어하는 구성 요소에 특정한 창과 풀다운 메뉴로 사용자 정의할 수 있습니다. 따라서 각 사용자 인터페이스는 이미징 약 1시간 전에 잠재적으로 고유한 모양을 갖습니다. 인큐베이터의 컨트롤을 찾고 상부 챔버와 스테이지 플레이트의 난방을 켭니다.

온도를 섭씨 37도로 설정합니다. CO2 컨트롤을 켜고 수준을 5%로 설정합니다.이 연구에서는 이미징을 위한 대물 렌즈를 선택합니다. 대물 렌즈는 물과 유사한 굴절률을 가진 침지 매체를 사용해야 합니다.

장기간에 걸쳐 여러 위치를 이미지화해야 하는 경우 스코프가 마르지 않도록 충분한 침지 매체를 적용해야 합니다. 배양 접시를 무대에 놓고 현미경 제어 장치 또는 소프트웨어를 사용하여 대물 렌즈를 바닥과 접촉하도록 올립니다. 방출된 빛을 eye piece로 향하게 하고 관심 있는 형광 신호에 적합한 광시야 필터 세트를 선택합니다.

이제 접안 렌즈를 통해 봅니다. 이미지의 초점을 맞추고 소프트웨어 또는 현미경 제어 장치를 사용하여 적절한 세포 영역을 찾습니다. 방출된 빛을 접안 렌즈에서 멀리 떨어뜨려 소프트웨어의 컨포칼 회전 디스크 장치를 사용하여 포트로 보냅니다.

이 연구에 적합한 레이저를 켭니다. 각 채널에 대해 kuo optic tunable filter control을 적절한 수준으로 조정하여 레이저의 강도를 조정합니다. 다음으로, 적절한 dichroic mirror 및 emission filter를 선택합니다.

회전하는 디스크 장치의 셔터를 엽니다. 이제 라이브 창을 선택하여 현재 시야를 표시합니다. 이제 카메라 제어 창을 엽니다.

사용할 카메라를 선택하고 노출 시간을 약 100밀리초로 설정합니다. 필요에 따라 백분율과 EM 게인을 조정합니다. 또한 컨포칼 회전 디스크 장치의 컨트롤을 열고 적절한 이미지를 캡처하기 위해 설정된 카메라 노출 시간을 입력하여 회전 디스크 속도를 조정합니다.

설정을 클릭하여 변경 사항을 잠급니다. 이제 다차원 수집 창을 엽니다. 채널 탭을 선택하고 Flora Fours에 대해 정의된 적절한 채널을 로드하거나 선택합니다.

이미지 정합을 보장하려면 두 채널 모두에 공통 다이크로익 미러를 사용하십시오. 소프트웨어를 자동 초점으로 설정합니다. MDA 창으로 이동하여 ZS 스택 탭을 클릭합니다.

현재 초점 위치에서 ZS 스택을 선택합니다. 10미크론 Zack의 범위를 설정하고 Z를 통해 나이퀴스트 샘플링을 보장하기 위해 단계 수에 대한 최적을 선택합니다. 이제 시작을 클릭하고 결과 Z 스택 이미지를 분석합니다. 시간 탭을 선택합니다.

이미징 시점과 세션의 전체 지속 시간 사이의 간격을 설정합니다. 접시에 있는 여러 세포의 다지점 이미징을 위해 MDA 창을 엽니다. 위치 탭을 선택하고 위치별 시점 이전 또는 이후 적용 설정이 선택되어 있는지 확인합니다.

이제 마크를 선택합니다. 라이브 뷰를 사용하여 찾고, 접시를 이리저리 이동하고, 적절한 시야를 선택합니다. 다차원 획득 메뉴에서 시작을 클릭하여 실험을 시작하고 대조군 비디오를 녹화합니다.

적절한 처리를 추가하고 정의된 기간 동안 결정된 시간 간격으로 실험 비디오를 녹화합니다. 이 세포주와 유사분열의 전체 과정을 모니터링하기 위해 우리는 7분 30초 간격으로 4-5시간 동안 사용했습니다. 세포주와 연구하고자 하는 대상에 대한 특정 설정을 결정해야 합니다.

벨로시티 소프트웨어를 열고 새 라이브러리를 만들고 이름을 지정한 다음 파일을 보기 위해 실험용 비디오 파일을 가져옵니다. 확장 초점 설정을 사용하여 필요에 따라 비디오를 조정하십시오. Velocity는 획득한 이미지의 품질을 개선하는 데 도움이 되는 다양한 도구를 갖추고 있습니다.

현미경의 설정이 적절하면 나중에 편집할 때 많은 시간을 절약할 수 있습니다. 종종 이미지를 양도하고 밝기와 대비를 조정하는 것이 도움이 되며, 특정 요구 사항은 실험에 따라 달라질 수 있습니다. 세포를 3D로 보는 것입니다. 3D 불투명도 설정으로 전환합니다.

이를 통해 공간에서 3D 렌더링된 셀을 회전할 수 있으므로 셀 내의 관심 구조에 대한 여러 관점을 제공할 수 있습니다. 영화. 스틸 이미지는 컨트롤과 비교하여 사용자 선호도에 따라 다양한 파일 형식으로 내보낼 수 있습니다. CPT에 노출된 섬유아세포 세포는 5분에서 10분 이내에 병소를 형성하고 기록 기간 동안 이러한 병소를 유지했습니다.

흥미롭게도, 인간 배아 신장 세포에서 53 BP 1은 유사분열이 시작될 때 염색질에서 해리되어 응축 염색체 주위에 얇은 안개를 형성합니다. 텔레프가 발생하고 유사분열이 53 BP 1에 이르면 다시 한 번 별개의 초점으로 응집됩니다. 이 비디오를 통해 DNA 손상 반응과 관련된 단백질의 시공간 관계와 다른 경로를 연구

예를 들어, 염색질 역학 분야에서이 기술은 53 BP 1 결합이 DNA의 텔로머 말단의 움직임에 어떤 영향을 미치는지 연구하는 데 사용되었습니다. 유전자 변형 세포를 생성한 후 약 4-8시간 내에 2D 및 3D 라이브 셀 이미징을 수행할 수 있습니다. 최적의 이미징을 위해 현미경 설정이 적절하게 조정되었는지 확인하십시오.