SeqA-DNA 단지의 결정에 대한 DNA의 Duplexes의 최적화를 반복

이 실험은 탠덤 헴이 메틸화된 DNA에 결합된 단백질의 회절 품질 결정을 얻는 방법을 자세히 설명합니다. 갓츠. 단백질 DNA 복합체의 결정 패킹을 선호하기 위해 반복합니다. DNA 길이의 합리적인 설계로 시작하여 GATC 간격 및 DNA 말단은 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 진행하여 DNA를 정제한 다음 아넬레로 헤미 메틸화 DNA 듀플렉스를 형성한 다음 정제된 서열 A를 혼합하여 복합체를 형성합니다.

다음으로, 상용 희소 매트릭스 스크리닝을 사용하여 결정화 시험을 통해 단백질 DNA 복합체의 회절 품질 결정을 성장시키기 위한 최적의 조건을 찾습니다. 입증된 결과. 다양한 DNA 길이, GATC 간격 및 말단이 CQ A DNA 결정의 회절 품질에 미치는 영향을 공유합니다.

이 연구의 목표는 DNA에 결합된 CK의 회절 품질 결정을 얻는 것이지만, 이 절차가 제 연구실의 박사 과정 연구원인 Chang에서 사용될 다른 단백질 DNA 복합체의 결정화를 위해 DNA 듀플렉스를 설계할 때 고려해야 할 일반적인 변수를 이해하는 데도 도움이 될 수 있습니다. 이 연구는 DNA 복제 조절 단백질의 변형을 사용합니다. 안정적인 이량체를 형성하고 그 화와 DNA 결합 도메인 사이에 짧아진 링커 영역이 있는 a를 찾습니다.

이 변이체는 DNA 결합을 탠덤 GATC 반복으로 제한하고, T 7 프로모터 플레이트의 제어 하에 DEMETRIC seq A를 암호화하는 플라스미드로 DNA 1차 형질전환 BBL 20 1D 3개의 세포에서 1회 전환에 의해 배타적으로 분리됩니다. 밀리리터당 100마이크로그램, 암피실린을 함유한 LB 한천 플레이트의 형질전환 반응을 박테리아 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣습니다. 혼합 식민지를 선택하고 소규모 하룻밤 문화를 시작하십시오.

다음날 아침 접종자는 하룻밤 접종 10 밀리리터로 1 리터 배양물을 제공합니다. 배양이 로그 단계에 있을 때 0.5몰 IPTG 2밀리리터를 첨가하여 단백질 생성을 유도합니다. 섭씨 37도의 오비탈 쉐이커에서 3시간 동안 배양을 계속합니다.

그런 다음 3, 10분 동안 300G에서 원심분리로 세포를 수확합니다. Reese는, 정화에 있는 세포 팔레트를 중단하고, 초음파 처리에 의하여 거짓말을 완충하고 39, 000 시간 G 40 분에 원심 분리에 의하여 lysate를 맑게 한다. 이제 S 상등액을 정제 버퍼와 평형을 이룬 헤파린 컬럼에 로드합니다.

CK 단백질을 용리화합니다. 선형 구배를 사용하여 1몰 염화나트륨 CK 단백질은 약 0.7몰 염화나트륨에서 용리됩니다. CK가 함유된 분획을 당겨 희석하여 샘플의 이온 강도를 낮춥니다.

그런 다음 정제 버퍼와 동일한 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 E에 샘플을 로드합니다. 선형 염 구배를 적용하여 약 0.4몰 염화나트륨에서 순수한 CK 단백질을 루프로 만듭니다. CK 포함 분수를 결합합니다.

밀리리터당 3밀리그램으로 농축하여 보관합니다. 완충액 디자인: 무료 unmethylated 및 methylated oligonucleotides. 800 마이크로리터의 오토클레이브, 이중 증류수 와류에 각 동결건조된 단일 가닥 DNA의 1마이크로몰 샘플을 준비하고 지금 15분 동안 800 마이크로리터로 보관합니다.

20-30 개의 뉴클레오티드에 대해 각 샘플에 완충액을 적재하여 두 번 예열하고 긴 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 큰 10 % 변성 겔을 준비합니다. 중합이 완료되면 빗을 제거하고 우물을 철저히 헹굽니다. 상단 및 하단 저장소를 1회 TBE 러닝 버퍼로 채우는 젤을 조립합니다.

젤을 750볼트에서 미리 실행하여 젤을 섭씨 55도까지 예열합니다. 그런 다음 실행을 중지하고 흐르는 버퍼로 우물을 철저히 헹굽니다. 이제 올리고뉴클레오티드를 섭씨 90도에서 2분 동안 가열합니다.

소용돌이와 스핀. 샘플은 즉시 겔을 로드하기 위해 진행됩니다. 올리고뉴클레오티드가 이동할 때까지 약 700볼트에서 겔을 실행합니다.

중간: 10% 폴리 아크릴아미드 겔에서 알프 페놀 블루 코는 약 20개의 염기 길이의 올리고뉴클레오티드와 약 60개의 염기 길이의 크실렌 실과 함께 이동합니다. 장치에서 젤을 분해하고 평평한 표면에서 스페이서를 제거합니다. 유리판 하나를 제거하고 젤을 플라스틱 랩으로 덮습니다.

그런 다음 젤을 뒤집고 다른 유리판을 제거한 다음 젤을 플라스틱 랩으로 덮습니다. 다음으로, 자외선과 젤 뒤에 있는 형광판을 사용하여 밴드를 표시합니다. 면도날로 DNA 그림자를 보려면 밴드를 잘라 작은 조각으로 자릅니다.

각 샘플을 멸균 15ml 튜브로 옮깁니다. 9ml의 엘루시안 완충액을 넣고 교반하면서 섭씨 37도에서 밤새 희석합니다. 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 용액을 오토클레이브 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

아크릴아마이드 조각이 옮겨가는 것을 방지하려면 pH 7의 아세트산 나트륨 3밀리리터와 섭씨 영하 20도에서 최소 3시간 동안 냉각된 100% 에탄올 인큐베이트 25밀리리터를 첨가하십시오. 침전된 DNA를 원심분리기합니다. 그런 다음 중불에서 스피드 백의 펠릿을 건조시키고 각 펠릿을 400마이크로리터의 오토클레이브, 이중 증류수에 재현탁한 다음 새 튜브로 옮깁니다.

100%ethanol 와류의 PH 7 및 1 밀리리터에 3 어금니 나트륨 아세테이트의 40 마이크로리터를 추가하고 18, 000 시간에 15 분 동안 원심분리 후에 영하 20 섭씨 온도에 30 분 동안 배양하십시오. G는, 18, 000 시간에 6 분 동안 어떤 잔여 소금 회전급강하든지 제거하기 위하여 70%cold 에타놀의 100개 마이크로리터를 가진 DNA 펠릿을 헹굽니다. 그런 다음 G는 에탄올을 버리고 펠릿을 스피드 진공 청소기에서 건조시킵니다.

이제 각 펠릿을 100마이크로리터의 오토클레이브 이중 증류수에 다시 보냅니다. 분광법으로 올리고뉴클레오티드의 농도를 측정합니다. 헤미 메틸화된 DNA 듀플렉스를 준비하려면 먼저 상보적 단일 가닥의 동일한 몰로 농도를 혼합합니다.

그런 다음 혼합물을 수조에서 섭씨 95도까지 5분 동안 가열하여 가닥을 말리십시오. 샘플을 수조 내부의 실온으로 천천히 식히십시오. 81 마이크로몰 정제 CQ 단백질과 81 마이크로몰 헴 메틸화 DNA를 동일한 부피로 결합합니다.

그런 다음 실온에서 15분 동안 배양했습니다. 상업적인 희소 매트릭스 스크린을 사용하여 결정화 조건을 위한 스크린을 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 초기 결정화 리드가 확인되면 회절 품질 결정을 성장시키기 위한 조건을 최적화하여 생성된 CK DNA 결정을 울고 보호합니다.

결정화 용액에 존재하는 PEG 400의 양을 최종 농도 25%로 늘리거나 결정화 용액에 20%글리세롤을 첨가하십시오. 나일론 루프 플래시로 개별 크리스탈을 퍼냅니다. 샘플을 액체 질소로 얼립니다.

이제 100k에서 각 결정의 회절 한계를 테스트합니다. Hemi methylated DNA에 결합된 CK의 단축 돌연변이의 결정 구조를 얻기 위해 DNA에 대한 3개의 매개변수, Hemi methylated GATC 서열 사이의 간격, 듀플렉스의 길이 및 5개의 프라임 돌출부의 부재 또는 존재를 연속적으로 최적화합니다. 이 연구는 더 이상의 인대화를 방지하는 말단 말단 도메인의 점 돌연변이와 DNA 결합을 탠덤으로 제한하는 단축된 링커가 있는 seek a의 DME 변형을 사용합니다.

DNA 전기이동성 이동 분석에서 1회전으로만 분리된 GATC 반복은 변형된 CK 단백질이 9-10개의 염기쌍으로 분리된 GATC 반복에 우선적으로 결합함을 나타냅니다. 그러므로, 초기 스크린은 2개의 헴이 메틸화된 것을 포함하는 23 내지 24개의 염기쌍 길이의 듀플렉스를 이용한다. GATC 반복은 9개 또는 10개의 염기쌍으로 구분됩니다.

세 개의 듀플렉스가 멋진 모양의 결정을 생성했습니다. 어떤 결정도 고해상도로 굴절되지 않았습니다. 데이터는 결정화를 위해 9개 염기쌍의 A-G-A-T-C 분리가 선호됨을 나타냈으며, 두 GATC 부위 사이에 CG 디뉴클레오티드를 포함함으로써 예기치 않게 그루브 골격 상호 작용을 향상시켰고, 결정의 회절 한계를 변경하지 않았습니다.

대조적으로, 돌출부의 길이를 최적화하면 분자 접촉과 결정 형태가 크게 변경되었습니다. 헴 메틸화 DNA 듀플렉스에 결합된 이 CK 단백질의 결정 구조는 단백질과 DNA의 상대적인 크기에도 불구하고 DNA 듀플렉스의 자유면이 결정 접촉에 관여하지 않음을 확인했으며, 대칭 메이트 간의 대부분의 상호 작용은 단백질, 단백질 및 단백질 DNA 상호 작용에 의해 매개됩니다. 흥미롭게도, 이 특별한 경우에서, 5개의 프라임 디뉴클레오티드 돌출부의 유익한 효과는 pseudo continuous DNA의 형성에 기인하지 않습니다.

대신, 메틸화된 가닥의 5개 프라임 말단은 DNA 축에서 멀리 돌출되어 복합체의 근위 CK 분자와 상호 작용하여 결정 패킹을 변경하기 위해 두 개의 뉴클레오티드가 엄격하게 필요한 이유를 설명합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 단백질을 정제하고 단백질 DNA 복합체 결정화를 위한 DNA 듀플렉스를 설계하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 프로토콜이 CK DNA 복합체를 결정화하는 장치이기는 하지만, DNA 길이 염기서열 및 말단의 합리적 최적화는 다른 단백질 DNA 복합체의 결정화를 위한 DNA 듀플렉스 설계를 위한 일반적인 프레임워크를 제공한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.