신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

이 실험은 단백질 키나아제 C ISO xms의 선택적 조절을 사용하여 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 신장 근위 세뇨관 세포의 미토콘드리아 및 세포 기능을 측정합니다. 먼저, 산화 대사가 있는 신장 피질 또는 RPC(Rp)에서 원발성 신근위세뇨관 세포(primary renal proximal tubular cell)를 분리합니다. 신장 근위세뇨관과 유사합니다.

Vivo는 단백질의 활성 및 비활성 형태의 isys를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 RPC를 감염시킵니다. 그런 다음 Kinase C는 다양한 미토콘드리아 기능과 세포 생존력을 분석하여 A TP를 합성하고 세포 사멸을 예방하는 미토콘드리아 능력에 대한 자임의 효과를 결정합니다. 또한 세포 용해물에서 인산화된 엡실론과 단백질 키나아제 C 엡실론의 면역 블롯 분석을 수행합니다.

결과는 단백질 키나아제 엡실론의 활성화가 미토콘드리아 A TP를 생성하는 능력을 부정적으로 조절하고 TP의 세포 수준과 신장 근위 세뇨관 세포의 생존력을 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 세포주와 같은 기존 기술의 이 기술의 주요 장점은 신장 근위세뇨관 세포의 1차 배양이 신장 근위부의 분화 기능과 산화를 유지한다는 것입니다. 단백질 키나아제는 표적 및 잠재적인 치료제로 사용될 수 있기 때문에 이 기술의 의미는 치료, 신장 손상 예방 또는 손상 후 신장 회복 가속화로 확장됩니다.

이 방법은 메커니즘, 부상 및 회복을 통찰력 있게 할 수 있습니다. 그것은 또한 50 밀리리터로 순차적으로 갓 분리된 토끼 신장 당에 적용될 수 있습니다. 각 신장의 피질을 수확하기 위해 멸균 D-M-E-M-F 12 매체 멸균 인산염 완충 식염수, pH 7.4 및 PBS 산화철 용액 각각.

먼저 15 밀리리터 다운 균질기를 사용하여 조직을 균질화합니다. 그런 다음 두 개의 멸균 메쉬 체를 통해 균질액을 1 리터 멸균 비커에 통과시킵니다. 체에 남아 있는 세포를 데페록사민 함유 완충액으로 헹굽니다.

바닥에 남아 있는 모든 조직을 옮깁니다. 85미크론 체에서 40밀리리터의 데페록사민을 함유한 완충액을 원뿔형 원심분리기 튜브에 넣습니다. 세포 현탁액과 강한 자석을 부드럽게 혼합합니다.

철로 채워진 사구체를 포획하고 자석에 부착된 철을 흡인합니다. 세포 현탁액의 부피를 40ml로 조정하고 콜라겐분해효소를 함유한 1ml의 소화 배지를 추가합니다. 실온에서 17분 동안 배양합니다.

서스펜션을 부드럽게 혼합합니다. 여러 번 세척한 후 섭씨 4도에서 2분 동안 50배 G에서 원심분리하여 세포를 수확합니다. Resus는 포도당 시드가 없는 46ml의 배지에 세포 펠릿을 현탁시킵니다.

1차 RT PC는 섭씨 37도의 궤도 셰이커에서 2밀리리터의 무포도당 D-M-E-M-F 12 배지에서 접시 배양당 1밀리그램의 단백질 밀도로 5%의 이산화탄소를 공급합니다. 배지를 보충한 후, 구성적 활성 단백질 키나아제, C 엡실론 또는 우성 음성 단백질 키나아제 C 엡실론에 대한 CD NA를 운반하는 아데노바이러스로 합류 RPT 세포를 감염시키고, 24시간 동안 배양하고, 배지를 보충하고, 또 다른 24시간 동안 형질주입된 1차 RPC를 배양합니다. 일차 세포 단층의 미토콘드리아 형태를 시각화하고 배지를 보충하려면 MIT tracker red five 80을 추가하고 접시를 30분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.

그런 다음 물 침수를 사용하여 형광 현미경으로 살아있는 단층을 검사합니다. 목표 2. 미토콘드리아 기능을 평가하려면 Clark 유형 전극이 장착된 산소 소비 챔버에서 RPTC 현탁액의 3회 호흡 상태를 평가합니다.

첫 번째 조치는 DP가 없는 경우 두 번의 호흡을 나타냅니다. 그런 다음 최종 농도인 0.4밀리몰에 DP를 추가합니다. 상태 4 호흡을 위한 상태 3 호흡을 시작합니다. 올리고 마이신을 밀리리터당 0.5마이크로그램의 최종 농도에 추가합니다.

또한 상태 3에서 호흡하는 세포에 0.5 마이크로몰 FCCP를 추가하여 비결합 호흡에 대한 측정을 포함합니다. 각 RPTC 배양 접시에 0.5 밀리몰 JC 1용액 20 마이크로 리터를 천천히 넣고 염료를 완전히 혼합하도록 휘젓습니다. 접시를 인큐베이터에 30분 동안 다시 넣습니다.

다음으로, 배양물을 얼음 위에 놓고 얼음처럼 차가운 PBS 세척을 두 번 수행합니다. 그런 다음 세포를 수확합니다. RPT 세포를 einor tube로 옮기고 피펫팅을 통해 단층을 단일 세포 현탁액으로 분해합니다.

488 나노미터 아르곤 이온 레이저에 의한 여기를 사용하여 유세포 분석으로 형광을 분석합니다. 그런 다음 미토콘드리아 막 전위 분리된 미토콘드리아를 계산합니다. 호흡 사슬의 무결성에 대한 평가를 용이하게 합니다.

얼음처럼 차가운 PBS 완충액으로 RPTC 단층을 두 번 세척한 후 원심분리로 세포와 펠릿을 수확합니다. 펠릿을 1ml의 완충액 A에서 한 번 세척한 다음 현미경으로 검사할 때 균질액에 있는 대부분의 세포가 파괴될 때까지 다운의 균질화기에서 세포를 균질화합니다. 다음으로, 저속 원심분리로 세포 파편을 제거합니다.

상등액의 미토콘드리아를 15, 000 회 G에서 섭씨 4도에서 10 분 동안 펠렛 화하고 완충액 c에서 펠렛 화 된 미토콘드리아를 3 회 세척하고, 미토콘드리아 펠렛을 50-100 마이크로 리터의 분석 완충액에 재현탁시키고 액체 질소에서 동결하여 NADH 유비퀴논 산화 환원 효소 활성을 분석한다. 첨가물과 함께 500마이크로리터의 분석 버퍼를 추가하면 미토콘드리아는 모든 첨가물이 있지만 미토콘드리아는 없는 빈 샘플도 포함됩니다. 접시를 섭씨 30도에서 5분 동안 혼합하여 평형을 이룹니다.

다음으로, 플레이트를 사양에 놓고 10마이크로리터의 3.25 밀리몰 유비퀴논을 추가하여 각각에서 반응을 시작합니다. 340 나노 미터에서 22 번째 간격으로 3 분 동안 흡광도를 기록하십시오. 유사한 분석에서 환원된 사이토크롬 C를 A TP 합성효소 반응의 기질로 사용하여 사이토크롬 C 산화효소의 활성을 측정합니다.

각 치료 그룹의 총 APA 활성 및 올리고 마이신 민감성 APA 활성을 분석하기 위한 혼합물을 준비합니다. 반응 혼합물에서 샘플을 섭씨 31도에서 10분 동안 배양합니다. TP 기질을 추가하여 반응을 시작하고 섭씨 31도에서 5분 동안 배양합니다.

200 마이크로 리터의 배양 혼합물을 50 마이크로 리터의 3 몰 TCA가 들어있는 튜브에 옮기고 10 분 동안 얼음에 단백질을 침전시킵니다. 그런 다음 원심 분리로 펠릿. 다음으로, 각 인산염 표준물질 50마이크로리터와 각 샘플 상등액 50마이크로리터가 중복된 96웰 플레이트를 로드합니다.

그런 다음 250마이크로리터의 Sumner 시약을 각 웰에 첨가하고 섭씨 30도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 595나노미터에서 흡광도를 기록합니다. RPTC 단층을 얼음처럼 차가운 PBS 버퍼로 두 번 세척합니다.

1ml PBS에서 세포를 수확하고 세포 현탁액을 einor 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 RPTC 샘플을 펠렛화하고 A TP 생물발광 분석 키트의 루시퍼라아제 방법을 사용하여 TP 함량을 측정합니다. 35mm 접시의 세포 생존율을 분석하기 위해 세포자멸사(apoptosis)에 양성인 오시스 세포와 2개의 접시에 대한 무염색 대조군의 세포로 구성된 3개의 대조군 치료 그룹에 대해 5개의 RPTC 단층을 사용합니다.

두 번째 세트에 50밀리몰 시스플라틴 2마이크로리터를 추가합니다. 2 마이크로 리터의 500 밀리 몰 터트 부틸 하이드로 퍼옥사이드를 추가합니다. 첨부된 텍스트에 자세히 설명된 대로 프로피듐 요오드화물을 사용하여 세포를 염색한 후, 결합 완충액으로 단층을 세척합니다.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 ZI와 접합된 ANNEXIN five를 사용하여 세포를 염색합니다. 그런 다음 세포를 부드럽게 채취하여 500마이크로리터의 결합 완충액에 현탁시킵니다. 고무 경찰관을 사용합니다.

피펫을 사용하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 분산시키고 세포 현탁액을 유세포 분석 튜브로 전달합니다. 세포를 단일 세포 현탁액으로 분산시킵니다. 유세포 분석, CD NA 코팅, CONSTITUENTLY 활성 및 비활성 돌연변이, 단백질 키나아제 C 엡실론의 비활성 돌연변이가 RPTC 및 미토콘드리아에서 단백질 키나아제 C 엡실론의 단백질 수준을 크게 증가시켜 유세포 분석에 의한 PI 및 FE의 형광을 정량화하기 위해 즉시 진행하십시오.

예상대로, 효소의 구성적 활성 형태는 RP tcs에서 인산화되고 우성 음성 효소는 인산화되지 않습니다. 활성 단백질 키나아제 C 엡실론의 존재는 미토콘드리아에 에너지를 공급하는 데 사용되는 기질에 관계없이 RPTC에서 미토콘드리아 호흡을 감소시킵니다. 그러나 비활성 단백질인 키나아제 C 엡실론은 미토콘드리아 호흡에 영향을 미치지 않습니다.

흥미롭게도, RP TCS에서 단백질 키나아제 C 엡실론의 활성화는 복합체의 활성을 4개 중 1개 감소시킵니다. 이러한 RPTC 호흡의 감소는 미토콘드리아 막 전위의 증가와 관련이 있습니다. 우세한 음성 돌연변이는 그러한 효과가 없습니다.

이러한 변화는 또한 활성 단백질 키나아제 C 엡실론을 발현하는 RPTC에서 분리된 미토콘드리아에서 TP 합성효소의 활성이 감소하는 것을 동반합니다. 결과적으로, 활성 단백질 키나아제 C 엡실론을 과도하게 발현하는 RPTC의 A TP 함량은 단백질 키나아제의 지속적인 활성화를 감소시킵니다. C 엡실론은 미토콘드리아 단편화에 의해 입증된 바와 같이 미토콘드리아 형태에 지대한 영향을 미칩니다.

단백질 키나아제 C 활성화, 그러나 억제는 아닙니다. 또한 RPTC 형태학의 변화를 일으켜 세포가 수축하고 살아남은 세포가 늘어납니다. RPC에서 활성 단백질 키나아제 C 엡실론을 과도하게 발현하는 이러한 미토콘드리아 효과는 ons와 apoptosis에 의한 세포 사멸과도 상관관계가 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 아데노바이러스 기법을 사용하여 1차 배양에서 단백질을 과도하게 발현하는 방법과 TP 합성을 위한 미토콘드리아 용량을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행되면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 그리고 부족하게, 아데노바이러스에 대한 작업이 thet에 액세스한다는 것을 잊지 마십시오, 따라서 적절한 예방 조치를 취하십시오.