Name: 신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: 배우세요 신장 근위세뇨관세포에서 단백질 키나제 C 이소자임의 미토콘드리아 기능 및 세포 생존 능력 평가 방법을. 아데노바이러스 벡터를 이용한 선택적 조절 기법으로 ATP 합성과 세포 사멸 메커니즘을 규명합니다.

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이 작품은 국립 보건원, 국립 당뇨병 연구소와 소화기 및 신장병, 2R01DK59558 (GN까지)에서 보조금에 의해 지원되었다. 연구 자료 보조금 UL1 RR029884을위한 건강 국립 센터의 국립 연구소에 의해 지원 UAMS 병진 연구소 UAMS에서 유동 세포 계측법 코어의 일부 자금을 제공했습니다. 우리가 고마워 박사 Peipei 핑 (로스 앤젤레스 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, CA) cDNA PKC-ε 박사 알렌 Samarel (로욜라 메리 대학 의료 센터의 지배적 부정적 (비활성) 돌연변이 코딩 휴대 아데노 바이러스의 나누어지는를 제공, PKC-ε의 constitutively 활성화 돌연변이 코딩 adenoviral 벡터의 나누어지는를 제공 Maywood, IL). 우리는 또한 Drs 감사드립니다. PKC-ε constitutively 활성화 cDNA 코딩을 제공하는 피터 파커와 피터 Sugden (임페리얼 칼리지 런던, 런던, 영국).

<ol><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li>
<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells%3A+improvements+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li>
<li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits%3A+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li>
<li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C%2C+Ras+plays+multiple+roles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li>
<li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B5+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li>
<li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ERK1%2F2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li>
<li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li>
<li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B1+and+ERK1%2F2+mediate+mitochondrial+dysfunction%2C+decreases+in+active+Na%2B+transport%2C+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li>
<li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-%281%2C2-dichlorovinyl%29-L-cysteine+injury+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li>
<li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+a+functional+p21WAF1%2FCIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis%3A+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 방법은 신장 근위 관 세포의 주요 문화에 PKC의 개별 isozymes의 overexpression 할 수 있습니다. 이 방법의 몇 가지 장점이 있습니다 : 1. 그것은 다양한 모욕 (국소 빈혈, hypoxia, 산화 스트레스), 약물, 그리고 신장에서 nephrotoxicants의 기본 목표 아르 셀 (신장 근위 관 세포)의 동질적인 인구 규제 메커니즘을 조사 할 수 있습니다. 2. 개선 된 조건에서 차 문화에서 자란 RPTC의 체외 모델에서의 Mitochondrial 기능은 생체 내 신장 근위 tubules의 mitochondrial 기능과 유사. 1,2 3. 체외 모델이 서로 다른 toxicants에 미토콘드리아의 반응은 생체 내 신장 근위 tubules의 반응과 비슷합니다. 4. 이 방법은 신호 전달 mechani에 관여 단백질 등의 특정 단백질을 코딩 유전자의 효율적인 transfection 및 배달이 가능mitochon...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 층류 흐름 후드 </td><td> 열 전자 주식회사 </td><td> 견적 1,104 </td></tr><tr><td> 2 ML 15 ML의 다운스 호 모지 조직 연삭기 </td><td> 휘튼 </td><td> 989-24607, 357,544 </td></tr><tr><td> 85 235 마이크론 나일론 메쉬 </td><td> 소형 부품 </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ML 멸균 원심 분리기 관 </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1.5 ML 마이크로 튜브 </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 X 10mm 멸균 문화 요리 </td><td> 코닝 </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> 주앙의 원심 분리기 </td><td> 주앙 </td><td> 주앙 CR3 11,175,704 회 전자 : 주앙 T40 </td></tr><tr&gt; <td> 조절 마이크로 원심 분리기 </td><td> 시그마 </td><td> 모델 1-15 </td></tr><tr><td> 생물 산소 모니터 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 어떡 모델 5300A </td></tr><tr><td> 싱글 상공 회의소 마이크로 산소 시스템 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> 산소 프로브 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> 목욕을 순환 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl과 표준 막 키트 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> 자기 교반기 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> 평판 레코더 </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48 우물과 96도 투명 판 </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> 궤도 흔드는 MAXQ 2000 </td><td> 열 과학 </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> 스펙트럼 형석 플러스 (흡광도 / 형광 / 발광 리더) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> 물 외피 미국 Autoflow 자동 CO 2 인큐베이터 </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 유동 세포 계측법에 대한 12x75 mm의 폴리스티렌 문화 테스트 튜브 </td><td> 피셔 브랜드 </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop 물 침지 목표 63x / 0,90 W </td><td> 칼 Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12 햄 </td><td> 시그마 </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoxamine의 Mesylate </td><td> HospiRA </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Collagenase 유형 I </td><td> 워싱턴 </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> 트립신 억제제 </td><td> 시그마 </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;- tetrachloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;이 - tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine 요오드화물 (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker 레드 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP Bioluminescence 검정 키트 HS II </td><td> 로슈 </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexin V - FITC 솔루션 </td><td> BioVision </td><td> 1001-200 </td></tr><tr><td> 흐름 cytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

신장 세포 overexpressing 단백질 키나제 c isozymes에 mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

isozymes의 단백질 키나제 C (PKC) 가족 여러 생리 학적 및 병리학 과정에 참여하고 있습니다. 최근 데이터는 PKC는 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 조절하는 보여줍니다. 많은 보고서는 PKC-a와 PKC-ε의 활성화는 허혈성 심장과 mediates의 cardioprotection에서 mitochondrial 기능을 향상 보여 주었다. 반면에, 우리는 PKC-α와 PKC-ε은 신장 세포에서 nephrotoxicant 유발 mitochondrial 장애 및 세포 죽음에 연루되어 보여주고 있습니다. 따라서, 본 연구의 목표는 PKC의 isozymes가 선택적으로 활성화 또는 산화 인산화와 세포 생존의 규정에서 자신의 역할을 결정하기 위해 저해 할 수있는 활성 mitochondrial 기능을 유지하는 신장 세포의 체외 모델을 개발하는 것이 었습니다. 신장 근위 관 세포 (RPTC)의 기본 문화는 미토의 mitochondrial 호흡과 활동의 결과로 개선 된 조건에서 배양 된생체 내 RPTC에서 비슷한 chondrial 효소. 전통 transfection 기술 (Lipofectamine, electroporation)가 기본 문화에 비효율적이며, mitochondrial 기능에 부정적 영향을 미칠 때문에, PKC-ε 돌연변이 cDNAs가 adenoviral 벡터를 통해 RPTC에게 전달했다. % 90 교양 RPTC의 transfection에있는이 방법은 결과를 표시합니다. 여기, 우리는에서 PKC-ε의 역할을 평가하기위한 방법을 제시 1. mitochondrial 형태와 ATP 합성, 2와 관련된 기능을 규제. 차 문화에 RPTC의 생존. PKC-ε는 overexpressing constitutively 활성화 PKC-ε 돌연변이에 의해 활성화됩니다. PKC-ε는 overexpressing에 의해 PKC-ε의 비활성 돌연변이를 억제하고 있습니다. Mitochondrial 기능, 호흡 단지 및 활동을 호흡기 체인의 무결성을 호흡을 검토하여 평가된다 F 0 F 1 ATPase, ATP 생산 속도, 및 ATP의 콘텐츠입니다. 호흡은주 3 일 (초과 기판과 ADP의 존재의 최대 호흡)와 uncoupled 호흡으로 digitonin-permeabilized RPTC에 ssessed. 호흡기 체인의 무결성은 절연 된 미토콘드리아의 호흡 체인의 네 가지 단지의 활동을 측정하여 평가된다. 산화 인산화의 용량은 F 0 F 1 ATPase의 ATP 생산 속도, 활동, mitochondrial 막 잠재력을 측정하여 평가됩니다. RPTC의 에너지 상태가 세포 내 ATP 내용을 결정함으로써 평가된다. 라이브 셀의 Mitochondrial 형태는 MitoTracker 레드 580, 특히 미토콘드리아에 축적 형광 염료, 라이브 monolayers 형광 현미경으로 검사 아르를 사용하여 시각화합니다. RPTC 가능성은 annexin V / apoptosis 및 oncosis을 결정하는 유동 세포 계측법에 이어 propidium의 요오드화물 착색를 사용하여 평가된다. 이러한 방법은 각각의 PKC isozymes의 선택적 활성화 / 억제 할 수 있도록체외의에 복제 할 수 있습니다 생리학 및 병리학 조건 다양한 세포 기능에서 자신의 역할을 평가합니다.

그림 1 프로그램 그 adenoviral 전달 RPTC와 미토콘드리아에서 PKC-ε의 크게 증가 단백질 수준에서 PKC-ε 결과의 constitutively 활성 (caPKC-ε)과 비활성 (dnPKC-ε) 뮤턴트 코딩 cDNA. 세포가 비활성화했습니다 cDNA 코딩 dnPKC을 ε overexpressed PKC-ε (phosphorylated되지 않음) (그림 1)에 감염된 반면 caPKC-ε 벡터를 들고 cDNA에 감염된 세포는 PKC-ε의 phosphorylated (활성) 양식을 overexpressed. 활성의 존재는 PKC-ε PKC-ε 비활성 아무 효과 (그림 2) 없다고 반면, 미토콘드리아 에너지를하는 데 사용되는 기판에 관계없이 RPTC에 mitochondrial 호흡을 감소. 호흡 사슬에서 PKC-ε 활성의 목표를 결정하기 위해, 우리는 호흡 사슬의 모든 효소 복합체의 활동을 결정. 그림 3에</stro...

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

단백질 인산화효소 C(PKC) 동종효소 군은 수많은 생리학적 및 병리학적 과정에 관여합니다. 최근 저희의 데이터는 PKC가 ...

본 실험에서는 protein kinase C ISO xms의 선택적 조절을 통해 다양한 생리적 및 병리적 조건 하에서 신장 근위세뇨관 세포의 미토콘드리아 및 세포 기능을 결정합니다. 먼저, 신장 피질에서 일차 신장 근위세뇨관 세포를 분리하거나, 신장 근위세뇨관과 유사한 산화적 대사 능력을 갖춘 RPCs를 분리합니다.RPCs에 활성 및 비활성 형태의 protein kinase C isozyme을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 감염시킵니다. 그 후 다양한 미토콘드리아 기능과 세포 생존력을 분석하여, 해당 isozyme이 ATP 합성 능력 및 세포 사멸 방지에 미치는 영향을 결정합니다. 또한, 함께 채취한 세포 용해물에서 phosphorylated protein kinase C epsilon에 대한 면역 블롯 분석을 수행합니다.결과에 따르면 protein kinase epsilon의 활성화는 ATP를 생성하는 미토콘드리아의 능력을 부정적으로 조절하여, 세포 내 ATP 수준과 신장 근위 세뇨관 세포의 생존율을 감소시킵니다. 세포주와 같은 기존 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 신장 근위 세뇨관 세포의 일차 배양이 신장 근위 세뇨관의 분화 기능과 산화 상태를 유지한다는 점입니다. protein kinase는 표적 및 잠재적 치료제로 사용될 수 있으므로, 이 기술의 응용 범위는 신장 손상 예방 또는 손상 후 신장 회복 촉진을 위한 치료법까지 확장될 수 있습니다.이 방법은 손상 및 회복 기전을 통찰하는 데 활용될 수 있습니다. 또한, 갓 분리한 토끼 신장의 피질을 수확하기 위해 50 mL의 멸균 D-M-E-M-F 12 배지와 멸균 인산염 완충 식염수(pH 7.4), 그리고 PBS 산화철 용액을 순차적으로 적용하는 등의 방식에 이용될 수 있습니다.먼저 15 milliliter 다운 호모게나이저를 사용하여 조직을 균질화합니다. 그런 다음 균질액을 두 개의 멸균 메쉬 체에 걸러 1 liter 멸균 비커에 담습니다. 체에 남아 있는 세포를 deferoxamine 함유 버퍼로 헹굽니다.85 micron sieve 바닥에 남은 조직을 원추형 원심분리관에 담긴 40 milliliters의 deferoxamine 함유 완충액으로 옮깁니다. 강한 자석을 사용하여 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.철이 충진된 사구체를 포집하고 자석에 부착된 철을 흡인합니다. 세포 현탁액의 부피를 40 milliliters로 조절하고 collagenase가 포함된 소화 배지 1 milliliter를 첨가합니다. 상온에서 17분 동안 배양합니다.현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 여러 번 세척한 후, 4°C에서 50 ×g로 2분간 원심분리하여 세포를 회수합니다. 세포 펠릿을 포도당이 포함되지 않은 배지 46 mL에 다시 현탁합니다.1mg/dish의 단백질 밀도로, 2mL의 포도당이 없는 D-M-E-M-F 12 배지를 사용하여 37°C, 5% carbon dioxide 조건의 오비탈 쉐이커에서 일차 RT PC를 배양합니다. 배지를 교체한 후, 합쳐진(confluent) RPT 세포에 constitutively active protein kinase C epsilon 또는 dominant negative protein kinase C epsilon을 운반하는 아데노바이러스 CD NA를 감염시킵니다. 24시간 동안 인큐베이션하고 배지를 교체한 뒤, 형질전환된 일차 RPC를 24시간 더 배양합니다. 일차 세포 단일층의 미토콘드리아 형태를 시각화하기 위해 배지를 교체하고 MIT tracker red 580을 첨가한 후, 배양 접시를 인큐베이터에 넣고 30분 동안 유지합니다.그런 다음 수침 렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 살아있는 단층 세포를 관찰합니다. 두 번째 목적은 미토콘드리아 기능을 평가하는 것이며, Clark 타입 전극이 장착된 산소 소비 챔버에서 RPTC 현탁액의 상태 3 호흡을 평가합니다.먼저 DP가 없는 상태에서 상태 2 호흡을 측정합니다. 그다음 DP를 최종 농도 0.4 millimolar가 되도록 첨가합니다. 상태 3 호흡을 시작한 후, 상태 4 호흡을 위해 oligomycin을 최종 농도 0.5 micrograms per milliliter가 되도록 첨가합니다.또한, state three에서 호흡 중인 세포에 0.5 µM FCCP를 첨가하여 비결합 호흡(uncoupled respiration) 측정값을 포함하십시오. 각 RPTC 배양 접시에 0.5 mM JC-1 용액 20 µL를 천천히 첨가하고 소용돌이치듯 흔들어 염료를 충분히 혼합합니다. 접시를 인큐베이터로 옮겨 30분 동안 배양합니다.다음으로, 배양물을 얼음에 두고 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 그 후 세포를 회수합니다. RPT 세포를 에펜도르프 튜브로 옮기고 피펫팅을 통해 단층 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다.488 nanometer 아르곤 이온 레이저 여기를 이용한 유세포 분석법으로 형광을 분석합니다. 그 다음, 분리된 미토콘드리아의 미토콘드리아 막 전위를 계산합니다. 이를 통해 호흡쇄의 무결성 평가를 용이하게 합니다.얼음처럼 차가운 PBS 버퍼로 RPTC 단층을 두 번 세척한 후, 세포를 수확하고 원심분리를 통해 펠릿을 형성합니다. 펠릿을 1 mL의 버퍼 A로 한 번 세척한 다음, 현미경으로 관찰했을 때 균질액 내의 대부분의 세포가 파괴될 때까지 다운즈 균질기(Down's homogenizer)로 세포를 균질화합니다. 그다음, 저속 원심분리를 통해 세포 잔해를 제거합니다.상층액으로부터 조분리된 미토콘드리아를 4°C에서 15,000 ×g로 10분간 원심분리하여 펠렛화하고, 펠렛화된 미토콘드리아를 버퍼 c로 3회 세척합니다. 미토콘드리아 펠렛을 50~100 µL의 분석 버퍼에 재부유시킨 후 액체 질소에 동결하여 NADH ubiquinone oxidoreductase 활성을 분석합니다. 분석 버퍼 500 µL와 첨가물 및 미토콘드리아를 추가합니다. 이때 모든 첨가물은 포함하되 미토콘드리아만 제외한 공시료(blank sample)도 함께 포함합니다. 플레이트를 30°C에서 5분간 혼합하며 평형화합니다.다음으로, 플레이트를 분광광도계에 넣고 각 웰에 3.25 millimolar ubiquinone 10 microliters를 첨가하여 반응을 시작합니다. 22초 간격으로 3분 동안 340 nanometers에서 흡광도를 기록합니다. 유사한 분석법으로, ATP 합성효소 반응의 기질인 환원된 cytochrome C를 사용하여 cytochrome C oxidase의 활성을 측정합니다.각 처리군의 총 APA 활성과 올리고마이신 불감성(oligo mycin insensitive) APA 활성을 분석하기 위한 혼합물을 준비합니다. 반응 혼합물이 담긴 샘플을 31 °C에서 10분 동안 배양합니다. TP 기질을 첨가하여 반응을 시작하고 31 °C에서 5분 동안 배양합니다.배양 혼합물 200 µL를 3 M TCA 50 µL가 들어 있는 튜브로 옮기고, 얼음 위에서 10분간 단백질을 침전시킵니다. 그 다음 원심분리를 통해 펠렛을 형성합니다. 이어서 96-웰 플레이트에 각 인산 표준물질 50 µL와 각 시료 상층액 50 µL를 듀플리케이트로 분주합니다.그런 다음 각 웰에 250 µL의 Sumner 시약을 첨가하고 30 °C에서 15분 동안 배양합니다. 그 후 595 nm에서 흡광도를 측정합니다. RPTC 단층을 차가운 PBS 버퍼로 두 번 세척합니다.1 mL PBS로 세포를 회수하여 세포 현탁액을 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 RPTC 샘플을 펠렛화하고, ATP 생물발광 분석 키트의 루시퍼레이즈 방법을 사용하여 ATP 함량을 측정합니다. 35 mm 디쉬의 세포 생존율 분석을 위해, 괴사 세포 양성 그룹, 세포 사멸 양성 그룹의 세 가지 대조군 처리 그룹과 염색하지 않은 대조군 두 개의 디쉬를 위해 각각 5개의 RPTC 단층 세포를 사용합니다.두 번째 세트에 50 millimolar cisplatin 2 µL를 추가합니다. 500 millimolar tert butyl hydroperoxide 2 µL를 추가합니다. 동반 텍스트에 상세히 설명된 대로 propidium iodide를 사용하여 세포를 염색한 후, 결합 버퍼로 단층 세포를 세척합니다.다음으로, 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 ZI가 접합된 ANNEXIN 5를 사용하여 세포를 염색합니다. 그 후 세포를 조심스럽게 회수하여 500 µL의 결합 버퍼에 현탁시킵니다. 이때 고무 폴리스맨(rubber policeman)을 사용하십시오.피펫을 사용하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 분산시킨 후, 세포 현탁액을 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 세포를 단일 세포 현탁액으로 분산시킵니다. 즉시 유세포 분석을 통해 PI 및 FE의 형광을 정량화합니다. CD NA 코팅된 protein kinase C epsilon의 지속적으로 활성화된 돌연변이체와 비활성 돌연변이체의 아데노바이러스 전달 결과, RPTC 및 미토콘드리아 내의 protein kinase C epsilon 단백질 수준이 유의하게 증가하였습니다.예상한 바와 같이, 효소의 constitutive active 형태는 RP tcs에서 인산화되는 반면, dominant negative 효소는 인산화되지 않습니다. 활성형 protein kinase C epsilon의 존재는 미토콘드리아 에너지원에 사용된 기질과 관계없이 RPTC의 미토콘드리아 호흡을 감소시킵니다. 그러나 비활성형 protein kinase C epsilon은 미토콘드리아 호흡에 아무런 영향을 미치지 않습니다.흥미롭게도, RP TCS에서 protein kinase C epsilon의 활성화는 4개 중 1개 복합체의 활성을 감소시킵니다. 이러한 RPTC 호흡의 감소는 미토콘드리아 막 전위의 증가와 관련이 있습니다. 우성 음성 돌연변이체(dominant negative mutant)는 이러한 효과를 나타내지 않습니다.이러한 변화는 활성 protein kinase C epsilon을 과발현시킨 RPTC에서 분리한 미토콘드리아 내 TP synthase의 활성 감소와 함께 나타납니다. 결과적으로, 활성 protein kinase C epsilon을 과발현시킨 RPTC의 ATP 함량은 감소하며, protein kinase C epsilon의 지속적인 활성화는 미토콘드리아 분절화(mitochondrial fragmentation)에서 알 수 있듯이 미토콘드리아 형태에 지대한 영향을 미칩니다.프로테인 키나아제 C의 억제가 아닌 활성화는 RPTC 형태의 변화를 일으켜 세포 수축과 생존 세포의 신장을 유발합니다. RPC에서 활성 프로테인 키나아제 C epsilon을 과발현시켰을 때 나타나는 이러한 미토콘드리아 효과는 온코시스(ons)와 아포토시스 모두에 의한 세포 사멸과 상관관계가 있었습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 아데노바이러스 기법을 사용하여 일차 배양 세포에서 단백질을 과발현시키는 방법과 TP 합성을 위한 미토콘드리아 능력을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 이 기법은 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 그리고 효율적으로 수행하십시오. 아데노바이러스 작업에는 위험이 따르므로 적절한 예방 조치를 취하는 것을 잊지 마십시오.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 세포외 플럭스 분석을 사용하여 대뇌 혈관 내피(CVE) 세포의 미토콘드리아 기능을 평가하는 방법을 보여줍니다. CVE 세포는 세포외 플럭스 세포 배양 플레이트에 도금되어 있습니다. 세포 외 플럭스 센서는 bioanalyzer에 로딩 및 교정하기 전에 수화됩니다. 그런 다음 세포가 포함된 플레이트가 분석을 위해 로드됩니다.

대뇌 혈관 내피 세포의 미토콘드리아 기능 평가

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

여기에서는 (세포주기) 키나아제의 미토콘드리아 국소화를 연구하는 방법과 미토콘드리아 아래 위치 및 잠재적인 미토콘드리아 기질/표적을 결정하는 방법을 간략하게 설명합니다. 단백질을 미토콘드리아로 강제 발현하는 것은 관심 단백질의 미토콘드리아 국소화의 기능적 결과를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

내피 세포의 미토콘드리아는 혈액 - 뇌 장벽 무결성을 유지하는 것이 중요하다. 우리는 대뇌 혈관 내피 세포에 생체 에너지 기능을 측정 할 수있는 프로토콜을 소개합니다.

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이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

이 방법은 야생형 대조군에 비해 증가된 심근세포 미토콘드리아 코엔자임 Q 함량을 갖는 신생아 깨지기 쉬운 X 증후군 마우스에서 기공 개방에 대한 전압 역치를 결정하기 위해 낮은 전도도 양성자 누출에 대한 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 기여를 이용한다.

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여기서는 고대사성 근위 소관 상피 세포에서 저산소증/산소 재산화 손상을 모델링하는 시험관 내 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 대사 스트레스 유발 손상을 유도하도록 설계되었으며, 근위 세뇨관 손상 지표의 발현과 미토콘드리아 호흡 기능 평가를 통해 측정할 수 있습니다.

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배우세요 신장 근위세뇨관세포에서 단백질 키나제 C 이소자임의 미토콘드리아 기능 및 세포 생존 능력 평가 방법을. 아데노바이러스 벡터를 이용한 선택적 조절 기법으로 ATP 합성과 세포 사멸 메커니즘을 규명합니다.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

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