Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

다음 실험의 전반적인 목표는 다중 역가 플레이트 형식을 사용하여 인간 만능 줄기세포 또는 H PSC를 뉴런으로 분화하는 것입니다. 이는 H PSC의 단일 세포 현탁액을 V bottom 96에 수확하고 도금함으로써 달성됩니다. 하룻밤 사이에 배아 몸체 또는 EBS를 형성하는 웰 플레이트.

다음으로, EBS는 신경외배엽 형성을 유도하기 위해 분화 배지를 포함하는 U자형 초저 부착판으로 전달됩니다. 그 후, EBS는 뉴런의 성장을 촉진하기 위해 마트리겔로 코팅된 접시에 도금됩니다. 면역형광에 의해 8일째 경에 전형적인 신경 세포 마커의 존재를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

인간의 pre-potent 줄기 세포를 뉴런으로 분화하기 위한 염색 프로토콜은 종종 복잡하고 지루합니다. 다소 우연히. 우리는 인간의 유력한 줄기 세포에서 뉴런을 만드는 매우 간단한 절차를 발견했습니다.

기술적인 관점에서 볼 때, 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 수행하기 쉽고 빠르며 비용 효율적이라는 것입니다. 동시에 절차를 발표하는 것은 실험실의 MI Z 박사가 맡을 것입니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 EB 형성 배지와 분화 배지를 준비합니다.

마트리겔 코팅 플레이트의 메스 컨디셔닝 배지와 같은 피더가 없는 조건 또는 sub confluent 활발하게 성장하는 조건에서 화학적으로 정의된 배양 시스템을 사용하여 h PSC를 성장시킵니다. 멸균 플라스틱 피펫 팁이 있는 실체 현미경을 사용하면 자발적으로 분화된 집락을 기계적으로 제거할 수 있습니다. PBS로 남아 있는 미분화 콜로니를 세척하고 단일 세포로 소화하기 위해 하나의 x 암석 억제제를 함유한 Accutane을 사용합니다.

200G에서 2분 동안 원심분리하여 단일 세포를 펠렛화하고 Resus를 소량의 EB 형성 배지에 현탁시킵니다. 혈구 분석기를 사용하여 세포 역가를 측정합니다. 밀리리터 당 40, 000 및 80, 000 세포 사이의 역가에 도달하기 위해 나머지 EB 형성 배지에 추가 세포를 추가합니다.

멀티 채널 피펫을 사용하여 웰당 100마이크로리터를 96V 바닥 플레이트로 이동하여 4, 000 - 8, 000 셀/을 생성합니다. 잘. 400G의 스윙 업 플레이트 원심분리기에서 플레이트를 1분 동안 돌려 웰 바닥에 있는 모든 세포를 수집합니다. 세포를 인큐베이터로 옮기고 실체 현미경으로 다음날 밤새 EBS가 형성되도록 합니다.

EBS를 모아 2ml의 분화를 포함하는 3.5cm 박테리아 접시에 소량으로 옮깁니다. 보통. 접시를 부드럽게 회전시켜 세포를 씻으십시오. 100마이크로리터의 분화 배지를 초저 부착물의 각 웰에 추가합니다.

실체 현미경 아래의 바닥 96 웰 플레이트. EBS를 세척 접시에서 96 U 웰로 소량으로 옮깁니다. 4일째에 신경외배엽이 형성될 수 있도록 EBS를 4일 동안 배양합니다.

분화 배지에서 세포를 세척하고 12웰 플레이트와 같은 matrigel 코팅된 다중 titer 플레이트의 웰에 하나씩 파종합니다. 세포는 뉴런이 방해받지 않고 성장할 수 있도록 우물 내에 균등하게 분포되어야 합니다. EBS가 실온에서 약 10분 동안 마트리겔에 느슨하게 부착되도록 합니다.

그런 다음 플레이트를 인큐베이터로 조심스럽게 옮깁니다. 뉴런은 앞으로 4일 이내에 도금된 EBS에서 방사형 방식으로 자랄 것입니다. 이전에 우리는 다른 많은 것들과 마찬가지로 H PSC의 EBS가 H HPC를 낮은 부착성 접시로 일상적으로 분할할 때 응집체를 간단히 재생하여 생성될 수 있음을 보여주었습니다.

이것은 일반적으로 세포 크기의 광범위한 분포를 초래합니다. 또 다른 문제는 현탁액 상태로 유지되는 EBS가 서로 응집되는 경향이 있어 이 단일 H PSC를 피하기 위해 훨씬 더 높은 크기의 이질성을 유발하는 경향이 있다는 것입니다. 그러나 세포 생존 분자인 Y 2 7 6 3 2를 HSC의 EB 형성을 향상시키는 것으로 나타난 폴리비닐 알코올과 결합하면 EBS가 하룻밤 사이에 단일 세포 HESC 현탁액에서 형성될 수 있었습니다.

편리하게도, 이 다중 적정 플레이트 형식의 EB 크기는 웰당 다른 수의 셀을 장착하여 엄격하게 제어할 수 있습니다. 종래의 기법을 사용하는 것과는 대조적으로, EBS를 초저 부착 96 U 플레이트로 옮긴 후, F-G-F-E-R-K-T-G, TGF 베타 SMA 2 및 BP SMA 1 억제제로 구성된 소분자 칵테일을 사용하여 신경 외배엽 형성을 유도한 다음, 세포를 매트리겔에 도말하여 뉴런을 생성하도록 했습니다. 약 8개, 000의 세포에서 EB 대형을 시작하는 것은 도금한 ebs에서 뚜렷한 neuronal outgrowths가 특징인 제일 neuronal 분화 수용량을 열매를 산출했다.

도금 후 괴사성 EB 중심이 감소하고 B, rrn, 3, A 및 beta, 3, tubulin과 같은 감각 및 범 신경 마커의 높은 발현. 전반적인 신경 분화 효율은 지금까지 HSC 및 HI PSC 모두에 적용할 수 있는 기존 절차와 유사한 것으로 보입니다. 3개의 독립적인 HPSC 라인, HES 및 HIPS cell은 multi-well 절차에서 성공적으로 테스트되었으며, 세포주 의존적 변동성 및 분화 효율은 일반적으로 배제할 수 없습니다.

이 그림은 해리된 하루 4개의 신경외배엽 세포가 단일 세포로 도금되어 약 60%의 효율로 성공적으로 분화되었음을 보여줍니다.다중 적정 플랫폼에서 EBS를 다루려면 처음에는 약간의 훈련이 필요하지만 시간이 지나면 매우 쉽다는 것을 알게 될 것입니다.