Name: Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 학습하세요 인간 만능성 줄기세포를 뉴런으로 분화시키는 다중타이터 플레이트 형식의 신속하고 효율적인 방법을. 면역형광법으로 8일째에 뉴런 마커를 확인할 수 있습니다.

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1. Matrigel 코팅 플레이트와 미디어의 작성 <ol><li> Matrigel - 코팅 접시에 Matrigel의 준비는 EBS를 차별화의 첨부 파일 선호하는 기판이 발견 있으며,이 10 일부터 뉴런의 효율적인 가지를 촉진하고 있습니다. <ol><li> 얼음에 박 Matrigel의 해동 10 ML. </li><li> 다음 날, 얼음처럼 차가운 DMEM/F-12의 두 권으로 젤리 같은 Matrigel을 희석하여 -20 ° C.에서 냉동 저장 될 수 있습니다 prechilled 15 ML 원뿔 튜브에 1 ML의 aliquots을 준비 </li><li> neuronal 차별화 판 형식에 따라 결정합니다. 예를 들어, 시작 지점으로, 우리는 12도 형식의 차별화의 초기 원형을 수행하는 것이 좋습니다. 4 ° C.에서 사전 시원한 사 12 잘 접시 모든 prediluted Matrigel는 해동하고 해산 될 때까지 위아래로 pipetting 다음 사전 차가운 DMEM/F-12 9 ML을 추가하여 냉동 Matrigel 중 하나 나누어지는을 분해. </li><li> 그때, 얼음 (최종 Matrigel 희석 : 1:75)에 DMEM/F-12 15 ML를 포함하는 새로운 50 ML 튜브에 내용을 전송합니다. 그런 다음 미리 냉각 12도 플레이트의 각도에 희석 Matrigel의 0.5 ML를 추가합니다. Parafilm으로 접시를 정리하고 하루 아침에 RT에 서 보자. </li><li> 다음 날, 4 ° C.에 접시를 전송 코팅 플레이트는 사용하기 전에 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 미디어 </li></ol> EB 형성 매체 (한 96 - 웰 플레이트에 차별화를 수행하기 위해 필요한 ~ 15 ML - 그림 2의 표 1과 계획을 참조하십시오) : DMEM/F-12 0.4과 % (PVA) 1X N2 1X B27 0.05 % BSA 20 NG / ML FGF2 10 μM Y-27632 1X PenStrepGln 차별화 매체 (한 96 - 웰 플레이트에 차별화를 수행하기 위해 필요한 ~ 30 ML, 그 중 하나 Matrigel 코팅 12 잘 플레이트에 신경 형성 한 다음, 표 1 참조) : DMEM/F-12 1X N2 <br/&gt; 1X B27 0.05 % BSA 0.5 μM PD0325901 15 μM의 SB431542 0.5 μM의 Dorsomorphin 1X PenStrepGln 2. 강제 EB 형성 <ol><li> 선호하는 피더 - 무료 조건 하에서 hPSCs 성장. 우리는 Matrigel 코팅 6 잘 플레이트 15 일 MEF이 설치된 매체를 사용합니다. 그러나, 수제 또는 상업적 정의 미디어 등 다른 문화 시스템은 작동합니다. 차별화의 실험을 시작하는 때, hPSCs 하위 합류 적극적으로 성장해야합니다. </li><li> 기계적 스테레오 현미경으로 멸균 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 자발적으로 차별화 된 식민지를 제거합니다. </li><li> 1X Y-27632을 포함 Accutase를 사용하여 하나의 셀에 PBS 및 알림을 사용하여 남아있는 undifferentiated 식민지을 씻는다. EB 형성 매체와 hematocytometer를 사용하여 셀 titre을 결정의 작은 볼륨에 resuspend 2 분, 200 XG에서 원심 분리하여 펠렛 단일 세포. </li><li> 에 세포의 나누어지는을 추가ML 당 40,000 달러 그리고 80,000 세포 사이의 titre 될 수있는 나머지 EB 형성 매체입니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용하여 잘 당 4,000 8,000 셀의 결과, 96V 아래로 판에 잘 당 100 μl를 전송합니다. 1 분 400 XG에서 스윙 아웃 플레이트 원심 분리기의 회전 96 - 웰 플레이트는 우물의 맨 아래에있는 세포를 수집하고, 세포 문화 인큐베이터로 전송합니다. 그림 1에 표시된 것과 같이 EBS는 하루 아침에 형성됩니다. </li></ol> 3. Neuroectoderm 유도 <ol><li> 다음 날 (일 0), 차별화 매체 2 ML을 포함하는 3.5 cm 세균 요리로 작은 볼륨에서 스테레오 현미경 및 전송에서 96V 접시에서 EBS를 수집합니다. 부드럽게 EBS를 씻어하는 데 몇 초 정도의 요리를 선동. </li><li> 100 차별화 매체의 μl 당 잘 울트라 - 로우-첨부 U-하단 96 - 웰 플레이트를 추가합니다. stereomicroscope 아래 96U-우물로 세척 접시에서 작은 볼륨으로 전송 EBS (우리 당 하나의 EB붙인다). neuroectoderm 형성을 허용하는 4 일간 세포 배양 배양기에 장소 96U 판. </li></ol> 4. 신경 세포 형성 <ol><li> 일 4 일 단계 3.1에서와 같이 세척 접시를 준비하고 추가로 차별화 매체 (물론 당 1 ML)에 의한 사전 예열 Matrigel 코팅 12 잘 판에 DMEM/F-12를 교체하십시오. </li><li> EBS의 도금 <ol><li> 96U 판에서 EBS를 수집,이 위, 그리고 조심스럽게 씨앗에게 씻어 그 Matrigel 코팅 12 잘 접시의 우물에 하나 (물론 당 약 8 EBS)의 하나 EBS는 동등의 방해받지 가지를 허용하도록 우물에서 배포되어야한다 다음 일 동안 뉴런 (그림 2의 &quot;일 5&quot;이미지 참조). </li><li> 보육에 12 잘 판을 다시 양도하기 전에, EBS는 느슨하게 RT에서 약 10 분에 연결 할 수 있습니다. 그런 다음, 세포 배양 배양기에 12 잘 판을주의 깊게 전송합니다. 뉴런은 우로서 다음 4 일 이내에 방사형 방식으로 도금 EBS에서 알아 성장그림 2에서 wn ( &quot;일 8&quot;오른쪽 이미지). </li></ol></li></ol> 5. Monolayers 등의 신경 조직 <ol><li> 포인트 4 단계의 대안으로), 절차의 4 일에서 차별화 매체 2 ML을 포함하는 3.5 cm 세균 그릇에 EBS를 수집 한 다음에 다음 PBS 함유 음식에 작은 볼륨으로 EBS를 전송하고, Accutase를 포함하는 다른 음식. </li><li> 차별화 매체의 작은 볼륨에 resuspend 하나의 세포, 2 분 200 XG에서 원심 분리기로 소화하고 hematocytometer를 사용하여 셀 titre를 결정하자. 차별화 매체를 (Y-27632이없는)를 사용하여 ML 당 1 2X10 6 셀에 titre를 조정합니다. </li><li> 사전 예열 Matrigel 코팅 12 잘 플레이트 (물론 당 1 ML) 및 세포 문화 인큐베이터로 전송에 판 세포 아웃. monolayers으로 신경 세포 형성은 일 7-8 (그림 3C) 사이에 관찰되었다. 그것은 그러나, 주목해야합니다 그의 monolayer 변종절차는 완전히 세포 생존과 가장 적합한 기판에 적용되는 최적화되어 있지 않습니다. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
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<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25, 929-938 (2007).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6, e18293(2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리 이전에 다음 ID로 출판 절차 10을 포함 hPSCs,에서 EB 형성을 포함한 대부분의 차별화 프로토콜은 수동 또는 필연적 EB 크기로 이질성로 연결 집계 등 hESCs의 효소를 이용한 수확을 기반으로합니다. 이 사실은이를 중간 처리량 규모에서, 특히 체계적인 분석이 어려운 렌더링, 일부 세포 라인 차별화 효율의 변화로 연결됩니다. 또한, 수동 해부 자체가 확장 성을 떨어 뜨리고있는 노동 집약적이다. 대조적으로, 여기에 설명 된 방법은 샘플 사이의 세포 처리 및 최소화 다양성을 용이하게 단일 세포에서 EB 형성에 기반을두고 있습니다. 중요한 것은, 우리는 뉴런에 전체 차별화 용량은 스핀 EBS와 프로토콜을 시작에 영향을되지 않는 것으로 나타났습니다. 또한, 유지 96 - 웰 정지 플레이트를 사용하는 방법에 의해 서로 분리 개인 EBS는 t을 방지종래의 절차 (10)의 또 다른 단점을 제시 - 정지 서로 통합에서까지. 결과적으로, 주...

hPSCs는, 상기 배아를 파생 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)을, 그들은 체외 1-2에 다양한 세포 lineages을 야기 할 수있는 만능 의미합니다. 수많은 차별화 된 세포 유형은 이러한 세포 연구 및 세포 기반 스크리닝 방법에 대한 유용한 도구를 제시하고, 셀 기반의 치료학에 대한 약속을 보유하는 개념을 지원하는 최신 hESCs에서 파생되었습니다. 그들은 종종 관심을 3-6 주어진 신경 세포 종류에 신경 progenitors의 수동 고립, 그리고 이후의 터미널 차별화에 이어 첫번째 유도 전반적인 신경 운명에 기초로 hESCs에 대한 Neuronal 차별화 프로토콜은 일반적으로 복잡하고 시간이 많이 소요됩니다. 어떤 점에서,이 복잡성은 초기 인간 발달, whic을 모방 등 최첨단의 지시 차별화 프로토콜은 stepwise 경향이 있다는 것을 감안하면 놀라운과 피할 수 없습니다H는 그 자체로 매우 복잡합니다. 한편,이 부분도 지금까지 완전히 최적화되지 여전히 차별화 프로토콜의 결과로, 기본 분자 프로세스에 대한 이해의 부족이 반영 될 수 있습니다. neuroectoderm, 페라 외에 undifferentiated hPSCs의 전환에 관해서이 있습니다. BMP / SMAD1/5/8 신호의 억제는 hESCs 7 신경 유도를 향상 것으로 나타났습니다. 또한, SMAD2 / 3 신호의 불 활성화는 neuroectoderm 형성 팔을 홍보하기 위해 표시되었습니다. 따라서,이 두 경로의 결합 불 활성화는 hPSCs 4,9을보다 효율적으로 신경 유도로 연결하는 경향이있다. 최근, 우리는이 세 신호 경로는 FGF / ERK는 hESCs의 neuroectodermal의 노력의 초기 단계 강력한 억제 역할을하는 것으로 나타났습니다. 반대로, 모든이 세 경로의 동시 억압이와 neuroectoderm로 hESCs의 거의 균일 전환 될10 단 사일 인치 그 후, 기능 뉴런에 고효율 터미널 차별화은 8 일 이내에 관찰되었다. 획득 뉴런이 부분에서 자신의 빠른 파생 열을 설명 할 수 있습니다 주변 신경계의 감각 뉴런 될 가능성이 있었다. 감각 신경 세포의 유지 보수에 결함이 이러한 가족 dysautonomia 11와 같은 특정 인간의 장애의 원인을 받고 있습니다. 이러한 추가 기능 특성에 대한 hiPSC 기술을 12 일 기준으로 질환,뿐만 아니라 뉴런의 특정 유형을 필요로하지 적용 목적으로 모델링를 들어,이 차별화 절차 유용한 근거를 제시 할 수 있습니다. 그러나, 차별화를 우리가 원래 hESC의 식민지 10 clumps에서 배아 기관의 참여 형성 (EBS)를 고용 전략, 그리고이 EB 크기에 대한 이질성의 꽤 정도의 결과, 또한 일부 CE에 신경 형성의 효율성을 손상 등장붙인다 라인. 또한, EB 크기의 이질성으로 인해 체계적으로 신경 세포 형성 과정과 이후로 추가 성장 요인 또는 작은 분자의 효과를 테스트 할 수있는 능력이 다소 실마리를 못 찾고 할 것처럼 보였다. 이 보고서에서, 우리는 또한 다른 상황 13과 같이 매우 크기 제어 방식으로 EBS를 생성하는 중간 처리량 호환, 강제 집합 기반 기술에 우리의 이전 절차를 적응. 그 후, EBS는 정지 neuroectoderm 형성을 시작하려면, 96 - 웰 플레이트의 V 자형 우물 U 자형 초저 첨부 파일 플레이트 96도로 전송 된에서 생성. 나흘 후, EBS는 높은 효율성과 동질성의 말기 차별화 된 뉴런에 상승을주는 아웃 도금 될 수 있습니다. 또한, 하루 4 EBS는 단일 셀에 dissociated 있었고, 인간의 뉴런의 저밀도 monolayers 결과하는 등의 아웃 도금. 일관된 결과는 지금까지이 독립적으로 드와 함께 얻었다rived hESC 라인, HuES6 및 NCL3. 전제 조건으로 성공적으로 EB 형성 함께 hESC의 생존 13-14을 촉진하는 것으로 알려져 ROCK 억제제 Y-27632과 합성 폴리머, 폴리 비닐 알코올 (PVA)의 사용에 엄격히 의존했다. 그 결과, EBS의 동질성은 96 V-플레이트 년에 설립이 실질적으로 무작위로 분할 기법에 따라 대량 문화 등 EBS의 형성에 비해 향상되었습니다. 이 시스템은 따라서 점착성의 조건 하에서 철저히 통제되고 신경 세포 형성에 이어 서스펜션 문화에 neuroectoderm 형성을위한 대폭 개선 된 플랫폼을 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Matrigel HC </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 354263 </td><td> 처리에 대한 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오 </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> 생명 기술 </td><td> 21331-020 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 (비닐 알코올) </td><td> 시그마 </td><td> 363170 </td><td> 초음파 waterbath를 사용하여 DMEM/F-12에 0.4 %에서 분해 / 과열 방지 / 4에서 ° C 몇 주 동안 계속 될 수있다 </td></tr><tr><td> N2의 보충 </td><td> 생명 기술 </td><td> 17502-048 </td><td> 100X, 냉동 aliquots로 저장 </td></tr><tr><td> B27 보충 </td><td> 생명 기술 </td><td> 12587-010 </td><td> 냉동 aliquots로 50X, 저장 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A1595 </td><td> 10% = 500X, 냉동 aliquots로 저장 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신과 L-글루타민 </td><td> PAA </td><td> P11-013 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td><td> 냉동 aliquots로 0.1 %에서 10 μg / ML에서 분해 BSA / PBS = 1000X, 저장 </td></tr><tr><td> ROCK 저해제 Y-27632 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> ASC-129 </td><td> 냉동 aliquots로 DMSO = 1000X, 저장의 10 MM에 디졸브 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 V-바닥 판 </td><td> Nunc </td><td> 277143 </td><td></td></tr><tr><td> PD0325901 </td><td> 축삭 Medchem </td><td> 축삭 1408 </td><td> 냉동 aliquots로 DMSO = 1000X, 저장에 0.5 밀리미터에 디졸브 </td></tr><tr><td> SB431542 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> ASC-163 </td><td> 냉동 aliquots로 DMSO = 1000X, 상점에서 15 MM에 용해 </td></tr><tr><td> Dorsomorphin </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) </td><td> SC-200689 </td><td> 냉동 aliquots로 DMSO = 1000X, 저장에 0.5 밀리미터에 용해 </td></tr><tr><td> 96 - 웰 U-하단의 초저 첨부 파일 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 7007 </td><td></td></tr><tr><td> 베타-III의 Tubulin 항체 (마우스) </td><td> 시그마 </td><td> T8660 </td><td> 1:1000에서 사용 </td></tr><tr><td> 베타-III의 Tubulin 항체 (토끼) </td><td> Covance </td><td> PRB-435P </td><td> 1:2000에서 사용 </td></tr><tr><td> BRN3A (POU4F1) 항체 </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) </td><td> SC-8429 </td><td> 1:500에서 사용 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. &lt;/ strong&gt;을 특정 시약 및 장비. </td></tr></tbody></table>

multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

인간 만능의 줄기 세포 (hPSCs)에서 뉴런의 생성을위한 기존 프로토콜은 종종 이전에 터미널 차별화에 신경 전구체 세포의 분리 및 확장을 포함하는 다단계 절차되기 때문에 지루한 수 있습니다. 이 시간이 많이 소요되는 방식에 비해, 우리는 최근 세 신호 경로, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, 그리고 FGF / ERK의 결합 억제가 작동 뉴런에 즉시 차별화 다음 hPSCs에서 neuroectoderm의 빠른 유도를 촉진하는 것으로 확인되었습니다. 여기, 우리는 더 이상 그 재현성을 향상하고 중간 처리 응용 프로그램과 호환하기 위해, 소설 multititre 판 형식으로 절차를 조정했습니다. 이 자기편 조건에서 뉴런으로 차별화의 다른 사일에 이어 부동 영역 (embryoid 기관)에 neuroectoderm 형성 4 일을 포함한다. 이 프로토콜을 획득 대부분의 세포는 양극성 감각 뉴런 것 같습니다. 또한,절차는 매우 효율적이다 특히 전문적인 기술을 필요로하지 않으며, 비용 효율적인 작은 분자로 간단한 화학적으로 정의 된 매체에 기반을두고 있습니다. 이러한 기능으로 인해, 절차는 더 기능적 조사를위한 유용한 플랫폼으로뿐만 아니라 세포 기반 스크리닝 인간의 감각 뉴런 또는 유형의 뉴런을 요구하는 접근에 사용될 수 있습니다.

이전 보고서에서, 많은 다른 사람들과 라인에, hPSCs에서 EBS가 낮은 첨부 요리 (10) 내로 hPSCs의 일상 분할시 응집체를 replating으로 간단하게 생성 할 수 있습니다. 결과 EB 크기 (그림 1C, 상단)의 다양한 배포판이 일반적으로 발생합니다. 이로 인해 또 다른 문제는 정지 유지 EBS는 EB 크기의 더 높은 이질성로 이어지는, 서로 통합 경향이 있다는 것입니다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 따라서 multititre 플레이트의 낮은 첨부 파일 우물 (그림 1A)에 하나의 hPSCs을 도금하여 EBS를 생성하려고 시도했습니다. 이것은 EB 형성과 세포 사망 (그림 1B, 오른쪽 아래)에되었습니다. hPSCs에 대해 알려진 생존 분자를 적용, Y-27632는 비슷한 결과를 주었다. 마찬가지로, 이전 hESCs 16 EB 형성을 향상시키기 위해 표시되었습니다 적용 폴리 ...

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

인간 다능성 줄기세포(hPSC)로부터 신경세포를 생성하기 위한 기존 프로토콜들은 여러 단계의 절차를 거쳐야 한다는 점에서 매우 번거로운 경우가 많습니다...

다음 실험의 전반적인 목적은 멀티 타이터 플레이트 형식을 사용하여 인간 다능성 줄기세포(H PSCs)를 뉴런으로 분화시키는 것입니다. 이는 H PSCs의 단일 세포 현탁액을 수확하여 V-바닥 96-웰 플레이트에 분주함으로써 하룻밤 동안 배아체(EBs)를 형성하여 수행합니다.다음으로, 신경외배엽 형성을 유도하기 위해 분화 배지가 담긴 U자형 초저부착 플레이트로 EBS를 옮깁니다. 그 후, 뉴런의 성장을 촉진하기 위해 Matrigel이 코팅된 디시에 EBS를 플레이팅합니다. 8일경에 면역형광법을 통해 전형적인 뉴런 마커의 존재를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.인간 다능성 줄기세포를 뉴런으로 분화시키기 위한 염색 프로토콜은 종종 복잡하고 지루합니다. 저희는 우연히 인간 다능성 줄기세포로부터 뉴런을 만드는 매우 간단한 절차를 발견했습니다.기술적인 관점에서 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 수행이 쉽고 신속하며 비용 효율적이라는 점입니다. 동시에, 실험실의 Dr MI Z가 해당 절차를 시연할 예정입니다. 서면 프로토콜에 명시된 대로 EB 형성 배지와 분화 배지를 준비하십시오.matrigel이 코팅된 플레이트에서 meth 조건화 배지와 같은 무피더 조건으로 h PSC를 배양하거나, 화학적으로 정의된 배양 시스템을 사용하여 sub confluent 상태의 활발한 성장 조건에서 배양합니다. 멸균된 플라스틱 피펫 팁과 실체 현미경을 사용하여 자연적으로 분화된 콜로니를 기계적으로 제거합니다. 남아 있는 미분화 콜로니를 PBS로 세척하고, 1x rock inhibitor가 포함된 Accutane을 사용하여 단일 세포로 해리합니다.200 G에서 2분 동안 원심분리하여 단일 세포를 펠렛으로 만든 후, 소량의 EB 형성 배지에 다시 현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 농도를 결정합니다. 나머지 EB 형성 배지에 세포를 추가로 넣어 mL당 40,000에서 80,000 cells 사이의 농도가 되도록 조절합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 V-bottom 플레이트의 각 웰에 100 µL씩 분주하여, 웰당 4,000~8,000개의 세포가 들어가도록 합니다. 스윙-아웃 플레이트 원심분리기를 사용하여 400 G에서 1분 동안 원심분리하여 모든 세포를 웰 바닥으로 모읍니다. 세포를 인큐베이터로 옮기고 하룻밤 동안 배양하여 EBS를 형성시킨 후, 다음 날 실체현미경으로 확인합니다.EBS를 수집하여 2 mL의 분화 배지가 들어 있는

rapid-efficient-generation-neurons-from-human-pluripotent-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 비디오는 가벼운 단백질 분해 효소를 사용하여 인간 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 분리하고 재식하는 방법을 보여줍니다. 여과 및 원심분리 후, 뉴런은 배양을 위해 코팅된 멀티웰 플레이트에 재도금되어 부착 및 성숙을 촉진합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 유래 한 분화 된 뉴런 리플레팅

이 비디오는 배아체(EB)를 신경 상피 응집체로 분화하고 이후 신경 세포와 신경교세포로 분열하는 과정을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 in vitro에서 신경 세포 및 신경교세포를 효율적으로 생성할 수 있으며, 이는 독성 테스트를 위한 테스트 시스템 역할을 할 뿐만 아니라 신경 독성과 관련된 다양한 경로를 평가할 수 있습니다.

Generating Neurons and Glial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Embryoid Bodies

이 비디오는 신경 줄기 세포의 접착력과 성장을 향상시키기 위해 폴리오르니틴과 라미닌으로 코팅된 유리 커버슬립을 제조하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 순차적인 배양 및 세척을 포함하며, 뉴런에서 발견되는 구조를 모방하여 뉴런 세포 성장 및 분화를 촉진하는 지지 매트릭스의 형성을 촉진합니다.

인간 신경 줄기 세포에서 피질 피라미드 뉴런 생성

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

우리는 자동화된 화상 진찰 및 분석과 호환되는 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC) 배양 및 신경 분화의 자동화를 보여줍니다.

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

학습하세요 인간 만능성 줄기세포를 뉴런으로 분화시키는 다중타이터 플레이트 형식의 신속하고 효율적인 방법을. 면역형광법으로 8일째에 뉴런 마커를 확인할 수 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

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