Name: 인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 배우세요 인간 유도 만능 줄기 세포에서 표준화된 대뇌 오가노이드 생성 방법을 통해 초기 대뇌 피질 발생 메커니즘을 연구하는 기법입니다. 이 기술은 신경발달 장애 연구에 활용됩니다.

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작업 부의 혁신 과학 연구의 노르트라인-베스트팔렌 (주니어 리서치 그룹)에 의해와 시대 그물 신경, JTC 2015 Neurodevelopmental 장애, 줄기 MCD에 의해 지원 되었다.

1입니다. 세대 iPSC의
<ol><li>IPSC 식민지에서 단일 셀 단층 문화의 세대<ol>
<li>지하실 막 추출 물 (공학은) 코팅 6-잘 접시를 준비 합니다. 공학은 2-3 h 4 ° C에서 얼음을 녹여, 찬 Dulbecco의 수정이 글 중간 F12로 희석 (DMEM F12; 1시 50분 희석) 1 mL/희석된 공학은 솔루션의 플레이트 커버, 4 ° c.에 하룻밤 접시를 저장</li>
		<li>매체를 발음 하 고 실내 온도 (RT)에 4 분에 대 한 PBS에 0.5 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 식민지를 배양 하기 전에 두 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에서 0.5 m EDTA 6 잘 플레이트의 2 우물의 그대로 iPSC 식민지를 씻어. EDTA 솔루션을 발음 하 고 부드럽게 DMEM F12 매체의 5 mL와 함께 접시의 바닥에서 그들을 세척 하 여 식민지를 분리. 15 mL 튜브에 그들을 수집 하 고 원심 (1200 x g RT 4 분)에 의해 작은. 참고: Ipsc 상용 섬유 아 세포에서 재설정10성공적으로 사용된 되었습니다.</li>
		<li>발음은 상쾌한 고 세포 분리 시 약 37 ° c.에 6 분의 500 µ L와 iPSC 식민지를 품 어</li>
		<li>피펫으로 세포 현 탁 액 나머지 세포를 1 mL 피 펫으로 여러 번 부드럽게 위아래로 클러스터 단일 셀으로.</li>
		<li>휴대-분리 시 약 희석 세포 현 탁 액에 DMEM F12의 4 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>실시간에서 4 분 동안 1200 x g 에 아래로 셀 회전</li>
		<li>5 µ M와 보충 iPSC 매체의 2 mL에 셀 resuspend Y-27632 및 씨앗 코팅 공학은 6 잘 플레이트의 한 잘에 세포. 참고: 단일 셀 단층 iPSC 문화에 대 한 재료의 테이블에 에서 지정 된 iPSC 매체를 사용 합니다.</li>
		<li>다음 날, Y-27632 부족 신선한 iPSC 매체와 매체를 교체 합니다. 이 시점에서 문화 매체 Ipsc 100% 합칠 때까지 매일 변경 셀을 계속. 셀 라인 시작 웰 스의 confluency에 따라이 2-4 일 소요 됩니다.</li>
		<li>일단 confluent 통로 Ipsc입니다. 중간 발음 하 고 셀에 셀 분리 시 약의 500 µ L를 적용 합니다.</li>
		<li>37 ° c.에 5-10 분에 대 한 셀을 품 어 부드럽게 셀 분리 접시 바위.</li>
		<li>우물에서 세포를 씻어 DMEM F12의 2 개 mL를 사용 하 고 15 mL 튜브에 수집. 5 mL의 전체 볼륨에 대 한 DMEM-f12 키를 추가 합니다.</li>
		<li>1200 x g RT 4 분에 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한 발음.</li>
		<li>씨 셀 5 µ M와 보충 iPSC 매체에는 공학은에 1:4 비율 1: 2에서 Y-27632 코팅 6 잘 플레이트 (2 mL/매체의 우물).</li>
		<li>계속 해 서 2-5 일에 대 한 셀을 문화 부족 Y-27632 매일 iPSC 매체를 변경. 일단 confluent 통로 Ipsc (단계 1.1.4-1.1.8). 참고: IPSC의 세대에 대 한 문화 조건에 맞게 셀 수 있도록 그들을 사용 하기 전에 재료의 테이블에 에서 지정 된 iPSC 매체에 단층으로 적어도 2 구절에 대 한 Ipsc 문화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IPSC의 세대에 대 한 70-90% 합칠 때 단층 iPSC 문화를 사용 합니다. 참고: 단일 셀은 적은 스트레스 경향이 문화 환경에 적응 하는 iPSC 분리 및 집계 절차 동안 세포 죽음에 이르게. 단층 iPSC 문화 차별화의 증거 없는 전형적인 만능 형태를 표시 해야 합니다. Mycoplasma 오염에 대 한 정기적으로 문화를 테스트 합니다. Mycoplasma 무료 iPSC 문화 에서만 작동 합니다.<ol>
<li>6 잘 플레이트의 한 우물에서 문화 매체를 발음 하 고 셀에 셀 분리 시 약의 500 µ L를 적용 합니다.</li>
		<li>37 ° c.에 5-10 분에 대 한 셀을 품 어 부드럽게 셀 분리 접시 바위.</li>
		<li>우물에서 세포를 씻어 DMEM F12의 2 개 mL를 사용 하 고 15 mL 튜브에 수집. 10 ml 전체 볼륨에 대 한 DMEM-f12 키를 추가 합니다.</li>
		<li>셀 계산, 세포 현 탁 액에서 25 µ L를가지고 고 trypan 죽은 세포를 표시 하는 파란색의 25 µ L 함께 섞는다. 세 챔버를 사용 하 여 살아있는 세포를 계산 합니다.</li>
		<li>15 mL 튜브에 세포 현 탁 액에서 충분 한 셀 (4500 iPSC 집계 당)를 수집 합니다.</li>
		<li>1200 x g RT 4 분에 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한 발음.</li>
		<li>50 µ M으로 보충 iPSC 매체의 적절 한 볼륨에 셀 resuspend 150 µ L 당 4500 라이브 세포를 Y-27632. 참고: Y-27632의 높은 농도 사용 하 여 (50 µ M)는 Ipsc의 생존을 위해 중요 하다.</li>
		<li>각 150 µ L 플레이트 플레이트 낮은 첨부 파일 96 잘 U-바닥의 잘 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에. 참고: IPSC 집계를 생성할 때에 적어도 6 organoids을 하루 20 (섹션 5 참조)에서 품질 관리에 필요한 것을 하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 앞쪽 Neuroectoderm의 유도
<ol><li>밀접 하 게 iPSC 집계의 형태 변화는 4 배 또는 10 배 전원 렌즈를 사용 하 여 조직 문화 현미경 매일 모니터링 합니다. 하루 1, 명확한 테두리와 셀 집계에서 관찰. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 문화 iPSC 집계를 계속 합니다. 참고: 죽은 세포/잘의 특정 번호는 정상 이며 organoid 세대에는 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>IPSC 집계 하루 2에서에서 시작 하 고 하단에 셀 집계를 방해 하지 않고 매체의 약 2/3를 부드럽게 발음 하 여 매일 계속 피드. IPSC 매체 Y-27632 부족의 추가 100 µ L를 추가 합니다. 참고: 4-6 일 이내 셀 집계 350-450 µ m 직경에서 고 됩니다 부드러운 가장자리를 전시.</li>
	<li>이 단계에서 수영장 셀 집계 컷 100 µ L 피 펫 팁 낮은 첨부 6 cm 접시 (20 집계/접시의 최대)에 n 2 보충 (1: 200), B27 보충 (1: 100), 포도 당 (0.2 mg/mL), 주기적 DMEM-f12 키를 포함 하는 대뇌 피 질의 유도 매체에 아데노신 monophosphate (캠프, 0.15 µ g/mL), 0.5% 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 1 %L-alanyl-L-글루타민, 헤 파 린 (10 µ g/mL), 및 화합물 LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM), 및 Wnt 응답-1 (IWR-1)의 억제제 (10 µ g/mL). 6 cm 접시에 그들을 전송한 후 3 일 피 질 유도 매체를 변경 하 여 셀 집계를 피드.</li>
	<li>밀접 하 게 렌즈를 4 X 파워를 사용 하 여 조직 문화 현미경 대뇌 피 질의 유도 중 형태학 상 변화를 모니터링 합니다. 참고: 4-5 일 후에 대뇌 피 질의 유도 매체, 셀 집계의 가장자리 neuroectodermal 차별화를 나타내는 표면에서 밝게 하기 시작 한다. 이 단계에서 pseudostratified 상피의 방사형 조직이 나온다. 공학은 행렬에서 셀 집계를 포함 하는 섹션 3을 진행 합니다.</li>
</ol>3. 매트릭스 비 계에 집계 Neuroectodermal의 포함
<ol><li>공학은 2 3 h. Aliquot undiluted 공학은 충분 한 양 위한 4 ° C에서 얼음에 녹여</li>
	<li>포함 하는 절차에 대 한 플라스틱 파라핀 필름 시트를 준비 합니다. 컷 4 c m x 4 cm 큰 살 균가 위를 사용 하 여 플라스틱 파라핀 영화 조각, 플라스틱의 조각을 넣어 필름 100 µ L 팁에 대 한 빈 100 µ L 팁 트레이 위에 파라핀 그리고 플라스틱 파라핀 필름 시트에 작은 보조 (1 디 만들어집니다 gloved 손가락으로 눌러 mple/셀 집계 필요)입니다. 70% 에탄올과 플라스틱 파라핀 영화 청소 하 고 UV 빛으로 비추는 (전원: 15 와트, 파장: 435 nm) 30 분에 대 한 닫힌된 살 균 벤치에서.</li>
	<li>1.5-2 m m 직경에서 여 100 µ L 컷된 팁을 사용 하 여 플라스틱 파라핀 필름 시트에의 한 보조 개를 각 셀 집계를 전송 합니다. 두 집계 셀 경우에 융합 하는, 그들을 분리 하지 마십시오 하지만 함께 한 보조 개를 그들을 전송.</li>
	<li>부드럽게 발음 한 포경된 100 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 셀 집계를 둘러싼 매체. 참고: 조심 하지 팁에 셀 집계를 빨 아이 집계를 손상 시킬 것 이다.</li>
	<li>각 셀 집계를 undiluted 공학은의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 셀은 공학은 중간 집계 포경된 100 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 드롭 위치입니다. 참고: 피 펫 팁 개발 neuroepithelium 해를 하지 매우 주의 해야 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 플라스틱 파라핀 필름 시트 10 cm 배양 접시에 소독 집게 (또는 다른 충분 한 세포 문화 접시)을 사용 하 여 전송 하 고 공고히 공학은 수 있도록 15-20 분 동안 인큐베이터에 접시를 놓고.</li>
	<li>한편, 대뇌 피 질의 유도 매체의 5 mL를 포함 하는 낮은-첨부 6 cm 접시를 준비 합니다.</li>
	<li>공학은의 중 합 후 플라스틱 파라핀 필름 시트에서 셀 집계를 포함 하는 작은 물방울을 제거 합니다. 소독 집게를 사용 하 여 플라스틱 파라핀 영화를 설정 하 고 부드럽게 약간 기울이면에 셀 집계를 짠 다 (약 30 °) 낮은-첨부 6 cm 접시 방울 플라스틱 파라핀 필름 시트를가까지. 1 6 cm 접시에 최대 16 셀 집계를 전송 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에서 셀 집계를 품 어 계속</li>
</ol>4. 개 형 Organoids Neuroectodermal 집계에서의 세대
<ol><li>공학은 매트릭스에서 포함 후에 1 일 5 °와 14 rpm, 셀 문화 인큐베이터에 설치의 틸팅 각도와 락 셀 문화 통에 organoid 문화 요리를 놓습니다.</li>
	<li>Organoids 매일 모니터링 합니다. 균질 neuroepithelial 루프와 같은 구조 공학은 매트릭스에 포함 하는 후 점차적으로 개발할 수 있습니다.</li>
	<li>Neuroepithelial 루프 구조 표시 될 때, organoid 차별화 매체 DMEM-F12 n 2 보충 (1: 200), B27 보충 (1: 100), 포도 당 (0.2 mg/mL), 캠프 (0.15 µ g/mL), 0.5%를 포함 하는 매체 변경 NEAA, 1 %L-alanyl-L-글루타민, 인슐린 (2.5 µ g/mL)</li>
	<li>Organoid 차별화 매체 원하는 차별화 시간 지점에이 때까지 3-4 일 마다 교체 합니다. 다음 수정 organoids (섹션 5 참조)입니다. 참고: 때때로, 조직을 루프 구조 없이 광학 반투명 조직의 싹 전시 수 있습니다. 이 이상적 이지만, 이것은 하지에 영향을 대뇌 피 질의 구조 개발. organoids 최대 40 일 동안 organoid 차별화 매체에 경작 될 수 있습니다. 동안 확장된 문화 (40-100 일) 1:50 organoid 차별화 매체를 보완 될 수 있습니다 공학은 조직의 복잡성이 증가 하 고와 BDNF GDNF 신경 생존과 성숙14,15수 있도록.</li>
</ol>5. 고정 및 개 형 Organoids의 유효성 검사
<ol><li>유효성 검사를 위해 하루에 20에서 6 organoids를 수집 합니다. 3 organoids를 사용 하 여 mRNA 격리 및 PCR 분석. 고정 및 순차 immunocytochemical 분석에 대 한 3-3.5 m m의 오프닝 컷된 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 PBS를 포함 하는 24-잘 접시에 추가 3 organoids를 전송 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 PBS 발음과 5 mL 피 펫을 사용 하 여 신선한 PBS와 함께 그것을 대체 하 여 두 번에 organoids을 씻어. 추운 4 %paraformaldehyde (PFA) (pH 7.4)에 15 분 동안 organoids를 수정. 주의: PFA는 알려진된 인간 발암 물질 주의. 모든 작업은 니트 릴 장갑을 끼고 화학 증기 두건에서 수행 되어야 합니다. 안전 안경을 착용 하는 것이 좋습니다. 포름알데히드는 각 막에 돌이킬 수 없는 손상을 일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>PFA는 신중 하 게 발음 하 고 씻어 3 시간 10 분 동안 실내 온도 PBS를 사용 하 여.</li>
	<li>30% 자당 해결책 PBS 바꿉니다 (wt/집, PBS 기반) organoids 탈수 있도록 4 ° C에서 샘플을 저장 하 고. Organoids는 추가 처리까지 최대 7 일 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>고정, 후에 1 일 미리 cryosectioning 절차 동안에 organoids의 시각화 수 있도록 10 분 약 1시 50분에 trypan blue를 추가 하 여 탈수 organoids 얼룩.</li>
	<li>10% 자당, 7.5% 젤라틴 wt/집 PBS에 포함 된 포함 매체를 준비 하 고 75 ° C까지 액체 따뜻한.</li>
	<li>포함 매체와 30% 자당 해결책을 대체 하 고는 organoids equilibrate에 15 분 동안가 열 플레이트 (60 ° C)에 24-잘 접시를 전송.</li>
	<li>포함 미디어 레이어와 포함 금형의 하단을 커버 하 고 유해를 얼음에 그들을 배치.</li>
	<li>전송 포함을 24-잘 접시에서 organoids 금형 polymerized 포함 매체를 포함 하는 organoids, 커버 된다 고 목욕 (냉동 100% 에탄올/드라이 아이스에서 금형을 신속 하 게 배치 위에 추가 포함 매체 추가 온도-50 ° C-30 사이 여야 합니다) 적어도 1 분 충격 동결.</li>
	<li>일시적으로 드라이 아이스에 집게와 어느 게 그들-80 ° C에 또는 직접 진행 cryosectioning 금형을 놓습니다.</li>
	<li>20 µ m 두께 수집에서 Cryosection organoids 현미경 슬라이드, 유지에 섹션 섹션 순서 슬라이드 (순차적 이해)에 추적 합니다. 섹션-80 ° C에서 그들을 저장 하거나 직접 immunocytochemical 얼룩을 수행 하기 전에 몇 시간 동안 슬라이드에 건조를 허용 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

뇌 organoids 관련 종 배경 및 조직 컨텍스트에서 셀의 복잡 한 3 차원 배열을 제공 하는 때 인간 두뇌 개발에서 체 외에 공부를 위한 강력한 도구를 나타냅니다. 함께, 그들은 인간이 아닌 동물 모델 및 reductionist 인간의 2 차원 단층 세포 문화 기술 간의 격차 다리. 그러나 그들의 응용 프로그램은,, 재현성9의 부족에 의해 방해 됩니다. 요소를 패턴화 하 그들의 순종과 iPSC의 자기 조직 능력을 결합 하 여 큰 샘플 샘플 변화를 극복 하는 개 형 organoid 프로토콜을 개발 했습니다. 특히, Ipsc 자기 조직화를 촉진 하 고 이후에 TGF-ß/SMAD 문화 BMP (LDN-193189)를 노출 하 여 등 피 질 차별화를 촉진 하는 신호를 억제를 집계 했다 그리고 TGF-β 유형 I 수용 체 억제제 (A83-01). 또한, Wnt 통로 (IWR) posteriorization를 방지 하기 위해 억제 하는 화합물은 적용 했다. '본질적인' 대뇌 organoid 프로토콜19, 달리는 기반 자기 집합 오히려 다른 유형의 뇌 organoids를 야 기한 및 큰 일괄 변화 전시 외부 제어 없이 (측정의 효율성에 의해 편광 신경 ectoderm 대형15), 인간의 Ipsc에서 균질 개 특정 organoids를 생성 하는 reproducibly 여기에 설명 된 프로토콜.
이러한 개 형 organoids neurodevelopmental 연구, 유전자 기능 연구, 진화 연구와 같은 응용 프로그램의 다양 한 사용할 수 있습니다 질병 모델링 하 고, 잠재적으로, 마약 테스트 및 치료 목적으로. 그러나 프로토콜은,, 인간 대뇌 피 질의 발달의 초기 측면 검사에 가장 적합 한. 예를 들어 vRGC 행동의 인간-특정 측면을 검토 하 개 형 organoids를 사용 했습니다. 좀 더 구체적으로, lissencephaly, 인간 대뇌 피 질의 기형 대뇌 피 질의 접는의 근처 부재에 의해 특징의 심한 형태와 관련 된 병 태 생리 변화 해결 했다. 이 질병의 특정 측면에만 마우스 두뇌는 자연스럽 게 lissencephalic 쥐에서 모델링 될 수 있습니다. Lissencephaly 환자 파생 Ipsc organoid 시스템 적용 때 우리가 안정적으로 질병의 인간-특정 측면을 정리 하 고 근본적인 메커니즘을 식별 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, 우리가 수 환자에서 파생 된 organoids vRGCs의 비대칭 세포 분열을 대칭에서 스위치에 의해 발생 하는 크기에 상당한 감소를 보여 보여 줍니다. 이 스위치 관련 vRGCs' microtubule 네트워크, VZ 틈새의 건축의 중단의 조직에서 변경 된 및 N-cadherin/β-catenin의 장애인된 활성화로 이어지는 세포 접착 분자의 표현을 변경 신호 축10. 참고: vRGC 부문 모드의 β-catenin-종속 규칙 인간-특정 쥐에서 β-catenin의 overexpression 접선 피 확장을 리드 하 고 이후20접는 대뇌 피 질의를 제안 했다. 따라서, 우리의 데이터는 개 형 organoid 시스템 유망한 도구 초기 대뇌 피 질의 개발에 생체 외에서의 인간-특정 측면 정량 방식으로 공부를 나타내는 강조 표시 합니다.
미래에 대 한 주요 도전은 더 성숙한 신경 고기를 달성 하기 위해 연장된 기간에 걸쳐는 organoids의 동질성을 유지 하는 것 이다. 이 다음 중 하나 이상에 의해 실현 될 수 있습니다: 생물 반응 기 시스템14에 organoids 경작,15, 신경 성장 또는 신경 생존 요인 차별화 매체를 보충 투어 부동 적용. 마지막으로, 뇌 복잡성 증가 제어 다른 지역 정체성21,22의 대뇌 organoids와 개 형 organoids 융합에 의해 달성 될 수 있습니다.
함께 찍은, 여기 개 형 organoid 프로토콜 초기 대뇌 피 질의 구조 체 외의 세대는 쉽게 적용 하 고 신뢰할 수 있는 도구를 제공 합니다. 프로토콜 제공 iPSC 여러 줄에 걸쳐 매우 균질 초기 대뇌 피 질의 조직에 상승 하 고 안정적으로 개인 특정 대뇌 피 질의 조직 생성에 이용 될 수 있다. 따라서, 시스템은 동질성 및 질병 모델링 등 재현성의 높은 학위를 필요로 하는 응용 프로그램에 특히 적합 합니다.

인간의 두뇌는 명확 하 게 가장 복잡 한 기관 중 하나 이며 모든 인간의 지적 능력에 대 한 책임. 따라서, 인간 특정 두뇌 개발의 깊은 이해 인간 인지 능력의 이해를 위한 중요 한 전제 조건입니다. 전통적으로, 유전자 변형 동물 모형 유기 체 공부 두뇌 개발을 역임 했습니다. 이러한 모델 두뇌 개발의 원리에 대 한 근본적인 통찰력을 제공합니다. 우리는 지금 모든 포유류에서 두뇌 개발의 일반적인 기능은 조상 확산, 성체, 그리고 신경 마이그레이션의 정확한 안무는 알고 있다. 그러나 중요 한 모형 유기 체는 피 질에서 특히 인간과 설치류 등의 두뇌 구조 차이,, 있다. 영장류의 대뇌 피 질의 발전에 기여할 제안 하는 기본 메커니즘은 외부 광선 명과 세포 (oRGCs), 설치류1에에서 매우 드물게 발견 되는의 생성 뿐만 아니라 줄기와 조상 세포의 증가 확산 ,2,3.
모델 인간의 대뇌 피 질을 개발 하는 방법으로 단층 문화 PSC 파생 telencephalic 조상 세포와 대뇌 피 질 프로젝션 뉴런의 생성을 포함합니다. 이러한 차별화를 표준화 프로토콜 대뇌 피 질의 신경 신생4의 틀에 박힌 시간적 순서 같은 인간 대뇌 피 질의 발달의 특정 측면을 재생. 그러나 그들은,,가 짧은 공간 패턴 등 morphogenesis organogenesis의 개발 프로세스의 재현 부에 관해서. 줄기 세포 생물학에서 최근 개발 생체 외에서 인간 organogenesis의 연구에 혁명을 일으키고는 Psc에서 3D organoid 문화의 설립에 지도 했다. Organotypic 구조로 구성 자체에 Psc의 용량을 활용 하 여, 신장, 용기, 눈, 그리고 두뇌의 포함 하는 기관의 키 구조 고 기능 속성을 반영 하는 다양 한 organoids 설립된5되었습니다. 그런 organoids는 그룹화 및 공간 개발 기관 vivo에서5,6매우 유사한 구성 여러 기관 특정 세포 하위 포함 되어 있습니다. 또한, 셀 구성, 혈통 관계, 유전자 네트워크 연구 단일 셀 RNA 시퀀싱을 사용 하 여 밝혀 인간의 대뇌 organoids 충실 하 게 유전자 표현 프로그램 등 인간의 태아 피 질 개발의 주요 측면 정리 7 , 그러나 8. 방해 그들의 광범위 한 응용 프로그램을 지금까지, 하나의 주요 결점은,, 큰 일괄 배치 변화와 organoid organoid이9.
여기, 우리는 간단 하 고 표준화 된 개 타입 organoid 문화 시스템에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 시스템의 주요 기능은 효율적으로 그리고 reproducibly 생성 하는지 거의 독점 등 telencephalic 정체성의 PSC 파생 된 organoids입니다. 프로토콜은 우리의 최근 셀 보고서 종이10에 사용 되는 메서드를 기반으로 합니다. 그것은 대뇌 피 질의 neuroepithelium의 선택적 유도 Ipsc의 자기 조직 능력을 결합 하 고 견고 하 게 3 주. 이내 초기 지 telencephalic 조직의 균질 문화를 생성할 수 있습니다. 이전에 보고 된 SMAD 신호 및 Wnt 억제 전략을 포함 하는 매트릭스와 조합에 이전 neuroectodermal 계보11,12 쪽으로 PSC의 차별화 가이드를 바탕으로 프로토콜 크고 연속 neuroepithelial 구조13의 형성을 촉진합니다. 성공적으로 다양 한 iPSC 라인, 개인 당 여러 클론에 설명 된 방법을 사용 했습니다. 우리는이 시스템은 재현성 및 동질성 질병 모델링 등 주요 중요성은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 적합 한 보였다. 때 심각한 대뇌 피 질의 기형으로 고통 받아 환자에서 파생 Ipsc 프로토콜 적용, 생체 외에서 질병의 병 적인 특징을 정리 하 고 선도 하는 phenotypic 새로운 분자 메커니즘을 식별 하 수 있었습니다. 10으로 변경합니다. 설명된 organoid 프로토콜 reductionist PSC 파생 대뇌 피 질의 단층 문화와 학문 vivo에서 , 사이 간격을 이용 될 수 있다 그리고 그것은 안정적이 고 안정 된 세포 기반 모델 시스템 초기 시뮬레이션을 대표 하는 것이 좋습니다. 건강과 질병 인간의 몸 밖에 서 인간의 대뇌 피 질의 개발.

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>StemGent</td><td>130-106-274</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>1 to 100</td></tr><tr><td>기저막 추출물 (예 : Geltrex)</td> <td>Gibco</td><td>A14132-02</td><td></td></tr><tr><td>고리 형 아데노신 일 인산 (cAMP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>0.15 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>세포 해리 시약(TrypLE Express)</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>계수 챔버(예: Fuchs-Rosenthal</td>, <td>Karl Hecht</td><td>40449001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td>, <td>Carl Roth</td><td>HN06.3</td>, <td>0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM-F12, L-Glutamin</td>, <td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Embedding molds(Tissue-Tek Cryomold)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>E6511</td><td>0.5 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Gelantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-25KU</td><td>10 ug/mL</td></tr><tr><td>Wnt 반응 억제제 (IWR-1)</td><td>Enzo Life Science</td><td>BML-WN103-0005</td><td>10 ug/mL</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td>2.5 &micro; </td></tr><tr><td>단층 배양을 위한 g/mL IPSC 배지(Pluripro)</td><td>세포 안내 시스템</td><td>MK01</td><td></td></tr><tr><td>L-알라닐-L-글루타민(GlutaMax)</td><td>Gibco</td><td></td><td>35050038 1%</td></tr><tr><td>저접착 6cm 플레이트</td><td>Labomedic</td><td>2081646L</td><td></td></tr><tr><td>저접착 10cm 플레이트</td><td>Labomedic</td><td>2081646O</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-171</td><td>180</td></tr><tr><td>nM N2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>1-200</td></tr><tr><td>비 필수 아미노산</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td>0.50 %</td></tr> <tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P6148</td><td>4.00 %</td></tr> <tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 파라핀 필름 (파라 필름)</td><td>브랜드 GMBH + CO KG</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 Y-27632</td><td>세포 안내 시스템</td><td>SM02-100</td><td>5 &마이크로; M 또는 50 & 마이크로; M</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>튜브 15 mL</td><td>코닝 생명 과학</td><td>734-0451&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드(예: Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td>) <td>Thermo Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 6웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>734-0019</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 24웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>734-0949</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>초저결합 96웰 lipidure-coat plate A-U96</td><td>Amsbio</td><td>AMS.51011610</td><td></td></tr><tr><td>항체와 관련상품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R& D 시스템</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>Covance</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>Otx2</td><td>R& D 시스템</td><td>ab9566</td><td></td></tr><tr><td>Emx1</td><td>시그마</td><td>HPA006421</td><td></td></tr><tr><td>N-cadherin</td><td>BD</td><td>610921</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Life Tech</td><td>61-7300</td><td></td></tr><tr><td>P-Vimentin</td><td>Biozol</td><td>D076-3</td><td></td></tr><tr><td>Tpx2</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB500-179</td><td></td></tr><tr><td>아세틸화 &알파;-튜불린&nbsp;</td><td>NEB/CS</td><td>5335</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 안티 ms</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 안티 RB</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 안티 ms</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 안티 rb</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr></tbody></table>

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 대뇌 피 질 높은 확장 및 인식 등 더 높은 두뇌 기능을 제공 하는 특정 기능 영역, 복잡 한 구조를 전시. 인간의 대뇌 피 질 개발을 연구 하는 노력 모델 시스템의 가용성에 의해 제한 되어 있다. 종의 차이 의해 제한 된다 인간 시스템에 설치류 학문에서 결과 번역 하 고 인간의 기본 조직에 대 한 연구 윤리 문제 뿐 아니라 조직의 가용성의 부족에 의해 방해 된다. 최근 개발 인간 만능 줄기 세포 (PSC) 기술에 3 차원 (3D) 자기 조직 organotypic 문화 시스템을 모방 하는 특정 정도 인간 특정 두뇌 개발에 생체 외에서생성을 포함 합니다. 현재, 다양 한 프로토콜 중 뇌 또는 뇌 영역 특정 organoids의 생성에 대 한 사용할 수 있습니다. 방법은에서 균질 하 고 재현할 수 개-유형 organoids의 생성 PSC (iPSC), 우리가 이전에 설립을 유도 하 고 여기에, 설명 결합 자체 향해 가이드 차별화로 정리 하는 PSC의 기본 능력은 이전 neuroectodermal 계보 그리고 연속 neuroepithelium의 형성을 지원 하기 위해 포함 하는 행렬. 이 프로토콜을 포함 하는 좀 더 구체적으로: (1) iPSC 집계, confluent 단층 문화; iPSC 식민지의 변환 등의 세대 (2) 앞쪽 neuroectoderm;의 유도 (3) 행렬 비 계;에서 neuroectodermal의 포함 (4) 개 형 organoids neuroectodermal 집계;에서 생성 (5) 고정 및 개 형 organoids의 유효성 검사. 따라서,이 프로토콜은 표준화 되 고 재현 iPSC 파생 대뇌 피 질의 조직 구조에서 생체 외에서의 세대에 대 한 쉽게 적용 가능한 시스템을 제공합니다.

일반적으로 여기에 설명 된 표준된 개 형 organoid 프로토콜에서에서 생성 하는 거의 독점적으로 등 쪽 외피 정체성의 매우 동질적인 organoid 문화 인간의 Ipsc 재배 ( 그림 1 에 설명 된 프로토콜의 20 일 이내 A). 정의 된 프로토콜의 시간 과정 동안 여러 가지 품질 관리 단계를 수행 하는 것이 좋습니다 여기로: (계속 분화 과정) ' 가'와 '노' (차선 문화, 것이 좋습니다 일괄 처리를 종료) (그림 1 ). 그것은 또한 잘 이미지와 메모를 복용 하 여 품질 관리의 각 단계를 문서화 하는 것이 좋습니다.
개 형 organoids 생성의 첫 번째 중요 한 단계 높은 품질 iPSC 문화 시작 하는 것입니다. Ipsc 차별화 된 세포의 큰 분수를 포함 하지 않습니다 중요 하다. 만 현재 iPSC 문화를 사용 하 여 (그림 1B, C) 시작 인구에 미 분화 세포의 단일 단층으로. 또한, iPSC 집계에 대 한 특정된 휴대폰 번호와 함께 시작 하는 결정적 이다. 하루에 2 iPSC 집계의 첫번째 상세한 검사를 수행 합니다. 이 단계에서 집계 형성 해야한다 소형 셀 싹 매끄러운 가장자리 ('가')으로 불규칙 한 나타나는 집계 또는 충 치와 집계 폐기 ('아니오인') (그림 1D, E) 해야 하는 반면. 다음 품질 관리 단계 하루 10의 프로토콜에서 수행 되어야 합니다. 이 시간 포인트에서 셀 집계 표시 해야 부드럽고 광학 반투명 조직 같은 조직의 부재 나타냅니다 차선 신경 유도 하는 반면 neuroectoderm ('가')의 유도 대표 하는 외부 표면에 ('노') (그림 1 층 G ). 반투명 표면 (그림 1F) 하는 집계만 공학은 매트릭스에 포함 한다. 일단 내장, 피 질 organoids 연속 neuroepithelial 루프와 같은 구조를 신속 하 게 확장 됩니다 개발할 것입니다. 여부는 organoids 개발된 편광된 신경 ectoderm 그림 1H, J ('가')에서 같이 조사 하 여 15 일과 20 일에 대뇌 피 질의 유도의 효율성을 분석. 경우는 organoids을 개발 하지 않은 같은 neuroepithelial 싹 ('노' 그림 1I, K에서볼 수 있듯이), 비판적으로 문제 해결을 위해 수행된 품질 관리 단계를 수정 합니다. 밀접 하 게 다음 프로토콜, 고도로 표준화 organoid 일괄 처리 될 때 생성 (그림 2A, B), ectoderm 신경 형성 및 배치 (그림 2C)에서 편광이 ≥ 90% 균질에 표시 됩니다. 편광된 신경 ectoderm 형성의 가변 효율으로 이어지는 일반적인 실수 iPSC 집계에 대 한 시작 셀 번호를 증가 하는 또는 시작으로 낮은-품질 iPSC 문화와 mycoplasma 같은 오염 문화 또는 문화를 포함 하는 세포 분화.
생성 된 organoids의 telencephalic 등의 상세한 유효성 검사는 하루에 20에서 수행 되어야 합니다. 이 위해, 3 organoids 고정 고 면역 형광 분석에 사용 될 해야 합니다. 층 화 neuroepithelial 루프 (그림 3A) 신경 줄기 세포 표식 Sox2 표현 (그림 3B, D), Pax6와 Otx2 개 마커 (그림 3C, E), 그리고 등 쪽 외피 마커 Emx1 (그림 3 F). 이러한 대뇌 피 질의 루프는 더 N cadherin ZO-1 (그림 3G, H), 심 실 영역 방사형 명과 셀 (vRGC)의 꼭대기 지역화 특징 이다-는 꼭대기에서 구조 (의 기저 면에 걸쳐 microtubule 파생 그림 3 나), phosphorylated vimentin에 대 한 긍정적인 얼룩 셀 분할 꼭대기 위치 (p-Vimentin, 그림 3J). 세포 죽음 organoid 구조 안에 있을 수 있습니다. 중앙 apoptosis는 정상 이며 대뇌 피 질의 조직 개발에 영향을 미치지 않습니다. 또한, 유전자 표정 분석에 의해 3 organoids 프로토콜의 동질성을 평가 하기 위해 사용 되어야 한다. 개 형 organoids midbrain (FoxA2, Pax5)의 표현 하면서 식 등 개 마커 (FoxG1, Otx2, Emx1)의 표시 그리고 hindbrain (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) 마커 감지 (그림 3K) 하지 않습니다.
품질 제어 organoids의 배치는 꼭대기 광선 glial 세포의 사단 평면 분석 같은 다양 한 애플리케이션에 사용할 수 있습니다. 이 위해, 두 배 얼룩 p Vimentin Tpx2에 대 한 항 체를 사용 하 여 수행 것이 좋습니다 (그림 3J). P-Vimentin 유사 분열 동안 CDK1에 의해 phosphorylated 모든 핵 mitotic 단계16에 따라서 표시는 핵에 위치 하 고. Tpx2 interkinetic 핵 이동17,18동안 mitotic 스핀 들과 꼭대기 프로세스를 시각화 수 microtubule 관련 된 단백질 이다. 이러한 마커를 사용 하 여, vRGC의 세 가지 측면 원칙적으로 분석 될 수 있다: (I) 여부 부문 평면 정렬된 수직 (나타내는 대칭 세포 분열), 수평, 또는 오블리크 (인지 꼭대기 쪽, (II)에 일어난 사단 셀 비대칭 세포 분열을 나타내는) 꼭대기 표면, 및 (III) 여부 센터 microtubule 조직 형성 된다 일반적으로.
Organoids는 더 복잡 한 조직, 층 화 대뇌 피 질의 조직 구조에 더 또한 분화 될 수 있다. 하루 35 ± 2 organoids 내 대뇌 피 질의 구조 심 실 영역 (VZ)-는 내부 및 외부 帯 (SVZ) 뿐 아니라, 대뇌 피 질의 플레이트 (CP)-의 영역 처럼 구성 됩니다. VZ와 내부 및 외부 SVZ, vRGCs, 중간 창시자 (IPs), 및 oRGCs의 연상 셀 식별할 수 있습니다. 또한, 계층화 된 외피의 초기 형성 관찰 될 수 있다 CP 같은 지역에서 Tbr1 및 Ctip2 내부와 Satb2, 표현 하는 위 대뇌 피 질의 뉴런 깊은 대뇌 피 질의 뉴런으로 외부 지역10에 있는 Reelin 표현 세포 뿐만 아니라.
<img alt="피질 오가노이드 형성 다이어그램, iPSC 응집, 신경 유도, 현미경 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1 : Organoid 프로토콜 및 '가'와 '노' 기준의 일러스트의 도식 개요. (A) 프로토콜의 개요 개요. CI 매체: 대뇌 피 질의 유도 매체; CD: 대뇌 피 질의 차별화 매체입니다. (CB-) 최적의 90% confluent iPSC 단층 문화 (B) 및 비-적당 한 iPSC 문화 전시 차별화 (C)의 이미지. (D-E) 크기, 세포 밀도, 그리고 표면 외관 (D) 최적 iPSC 집계 및 전시 중 셀 2 '노' 셀 집계 예비 (E, 위 집계) 충 치 또는 불규칙 한 가장자리 (E, 낮은 집계) 2 일 다음 셀 집계입니다. (F-G) 반투명 하 고 부드러운 가장자리 (F)와 셀 집계 광 부족 전시 셀 집계 지우기 (G). 노란색 라인은 관심 영역을 머릿속으로. (H-K) 연속 neuroepithelial 루프 (H, J)는 최적의 organoid와 광선 개발 하지 못한 organoid 조직 neuroectoderm (나, K) 15 일과 20 일에 각각 몇 군데. 스케일 바, B C 500 µ m; D-K 200 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="신경 오가노이드 성장 단계 및 막대 그래프 비교; 신경상피 방사형화에 관한 연구." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2 : 동질성 및 개 형 organoid 프로토콜의 재현성. (A-B) 하루 15 (A)와 하루 26 (B)에서 하나의 일괄 처리에서 organoids의 대표적인 밝은 분야 심상. 하루에 20에서 organoids의 (C) 정량 분석. Organoids neuroepithelium, 명확한 테두리와 방사형 세포 구조의 증거 분명 광학 표면 조직으로 밝은 분야에서 인식할 수 있는 외부 표면에 표시 된 계량 (n = 당 최소 16 organoids와 iPSC 라인 당 3 실험)입니다. 스케일 바, A-b: 500 µ m. 오류 막대 ± sd. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="면역염색을 통한 신경 분화 다이어그램; 오가노이드 절편의 Sox2, Pax6, DAPI 마커." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3 : 하루 20 개-유형 organoids의 유효성 검사. (A-J) Organoids의의 Immunocytochemical 특성화 Organoids 여러 neuroepithelial 루프 (A, DAPI와 counterstained)에서 구성 합니다. 층 화 조직된 내의 셀 neuroepithelial 루프 익스프레스 신경 줄기 세포 표식 Sox2 (B, D), 개 마커 Pax6 (C, D)와 Otx2 (E), 등 개 마커 Emx1 뿐만 아니라 (F). 대뇌 피 질의 루프 구조 전시 잘 부착 정션 벨트 N cadherin (G) 및 zona occludens 단백질 1 (조로-1;의 누적 된 가장 꼭대기 쪽 H). 심 실 RGCs microtubule 네트워크 (스테인드 acetylated α-tubulin, Ac-욕조에 의해)는 꼭대기에서 루프 구조 (나)의 기저 면에 확장. P-vimentin (p-Vim) 표현 확산 셀 꼭대기 표면에 있습니다. Mitotic 스핀 들 Tpx2. 수직의 대표 높은 확대 이미지에 의해 얼룩이 고 가로 부문 비행기 (J) 오른쪽에 표시 됩니다. (K) 2 다른 iPSC 라인에서 파생 된 organoids의 2 개의 독립적인 세트의 하루 20 지역 특정 전사 인자에 대 한 RT-PCR 분석. FB: 태아 두뇌 제어; AB: 성인 두뇌 제어 합니다. 스케일 바, A-D 200 µ m; E-난 10 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>피토 프</td>
			<td>희석</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sox2</td>
			<td>1-300</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax6</td>
			<td>1-500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2</td>
			<td>1-500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1</td>
			<td>1-50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-cadherin</td>
			<td>1-500</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZO-1</td>
			<td>1-100</td>
		</tr>
<tr>
<td>P-Vimentin</td>
			<td>1-1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tpx2</td>
			<td>1-500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acetylated α-tubulin</td>
			<td>1-500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa488 ms 안티</td>
			<td>1-1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa488 rb 안티</td>
			<td>1-1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa555 ms 안티</td>
			<td>1-1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa555 rb 안티</td>
			<td>1-1000</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 하루 20에서 organoids의 품질 관리에 대 한 항 체.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>뇌관</td>
			<td>시퀀스</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2 앞으로</td>
			<td>tgcaggggttcttctgtgat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2 역</td>
			<td>agggtcagagcaattgacca</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxG1 앞으로</td>
			<td>ccctcccatttctgtacgttt</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxG1 역</td>
			<td>ctggcggctcttagagat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1 앞으로</td>
			<td>agacgcaggtgaaggtgtgg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1 역</td>
			<td>caggcaggcaggctctcc</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxA2 앞으로</td>
			<td>ccaccaccaaccccacaaaatg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxA2 역</td>
			<td>tgcaacaccgtctccccaaagt</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax5 앞으로</td>
			<td>aggatgccgctgatggagtac</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax5 역</td>
			<td>tggaggagtgaatcagcttgg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB2 앞으로</td>
			<td>tttagccgttcgcttagagg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB2 역</td>
			<td>cggatagctggagacaggag</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxA4 앞으로</td>
			<td>ttcagcaaaatgccctctct</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxA4 역</td>
			<td>taggccagctccacagttct</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB4 앞으로</td>
			<td>acacccgctaacaaatgagg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB4 역</td>
			<td>gcacgaaagatgagggagag</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB6 앞으로</td>
			<td>gaactgaggagcggactcac</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB6 역</td>
			<td>ctgggatcagggagtcttca</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 앞으로</td>
			<td>ttccttggaccggcgcaag</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 역</td>
			<td>gccgcatcgccggtcgg</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 뇌관 그리고 유전자 표현 프로 파일에 대 한 입문 시퀀스.

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 만능 줄기 세포에서 고도로 표준화되고 재현 가능한 전뇌 유형 오가노이드를 생성하는 것입니다. 이 방법은 새로운 개발 NTZ의 메커니즘을 모델링하기 위한 강력한 도구입니다. 특히, 초기 인간 피질 발생과 관련된 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 개별 오가노이드와 오가노이드 배치 간의 변동이 거의 없이 인간 피질 조직을 표준화되고 시간 효율적으로 생성할 수 있다는 것입니다. 오가노이드 기술은 인간 뇌의 발달, 구조 및 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 특히 하등 종의 뇌 모델에서는 발견되지 않는 측면에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 만능 줄기 세포 응집체를 생성하려면 줄기 세포 배양이 70-90% 포화도에 도달하면 6개의 웰 배양 플레이트 중 하나의 웰에 500마이크로리터의 세포 해리 시약을 추가하여 세포를 분리합니다.단층 배양 조건에 적응하는 유도 만능 줄기 세포는 해리 및 응집 절차 중 스트레스로 인한 세포 사멸이 적기 때문에 응집체를 생성하기에 좋은 세포 유형입니다. 섭씨 37도에서 5분에서 10분 후 플레이트를 부드럽게 두드리고 2밀리리터의 DMEM/F-12를 사용하여 웰 바닥에서 세포를 세척합니다. 생성된 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 더 많은 DMEM/F-12 배지를 사용하여 세포 용액의 부피를 최대 10ml까지 가져옵니다.계수 후, 만능 줄기 세포 응집체 당 3번째 세포로 4.5 곱하기 10을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 펠릿을 적절한 부피의 만능 줄기 세포 배지에 현탁시키고 50 마이크로몰 암석 억제제를 보충하여 배지 농도 150 마이크로리터당 3번째 세포의 4.5 배 10을 달성합니다. 다음으로, 150 마이크로리터의 세포를 96-well 낮은 부착 U-바닥 플레이트의 개별 웰에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다.전방 신경외배엽 유도를 모니터링하기 위해 조직 배양 현미경을 사용하여 저배율에서 매일 만능 줄기 세포 응집체의 형태학적 변화를 면밀히 관찰합니다. 첫째 날에는 경계가 명확한 세포 응집체를 관찰해야 합니다. 2일차에는 각 웰 바닥의 세포 응집체를 방해하지 않고 배지의 약 2/3를 조심스럽게 흡인하고 폐기된 배지를 100마이크로리터의 새로운 만능 줄기 세포 배지로 교체합니다.4일에서 6일 사이에 세포 응집체의 직경이 350 - 450 마이크로미터에 도달하고 가장자리가 매끄러워지면 수정된 100 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 최대 20개의 응집체를 5밀리리터의 피질 유도 배지를 포함하는 단일 6cm 낮은 부착 배양 플레이트로 옮깁니다. 3일에 한 번씩 피질 유도 배지를 새로운 배지로 교체하고 4X 대물렌즈 하에서 매일 응집체의 형태를 모니터링합니다. 피질 유도 배지에서 4-5일이 지나면 세포 응집체의 가장자리가 표면에서 밝아지기 시작하여 신경외배엽 분화가 나타나고 가성층화된 상피의 방사상 조직이 나타나야 합니다.신경외배엽 응집체를 매트릭스 골격에 삽입하려면 기저막 추출물을 얼음 위에서 2-3시간 동안 해동합니다. 추출물이 해동되는 동안 멸균 가위를 사용하여 플라스틱 파라핀 필름을 16개의 오가노이드당 4 x 4cm 정사각형으로 자르고 각 필름 조각을 빈 100마이크로리터 마이크로피펫 팁 트레이 위에 놓습니다. 파라핀 필름을 장갑을 낀 손끝으로 작은 보조개가 나타나도록 누르고 70% 에탄올로 필름을 청소합니다.밀폐된 멸균 생물 안전 캐비닛에서 30분 동안 UV 방사선을 조사한 후 1.5mm에서 2mm 구멍이 있는 변형된 100마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 세포 응집체를 필름의 딤플 하나로 이동합니다. 모든 응집체가 옮겨졌을 때 절단되지 않은 100마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 딤플에서 배지를 조심스럽게 흡입하고 각 세포 응집체에 40마이크로리터의 희석되지 않은 기저막 추출물을 추가합니다. 피펫 팁을 거칠게 조작하거나 흡인하여 오가노이드를 손상시키면 발달 중인 신경 상피가 손상될 수 있으므로 주의해야 합니다.피펫 팁을 사용하여 응집체를 각 방울의 중간에 배치하고 멸균 집게를 사용하여 플라스틱 파라핀 필름 시트를 10cm 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 접시를 인큐베이터에 15-20분 동안 놓습니다. 추출물이 응고되는 동안 6cm 낮은 부착 배양 접시 하나에 5mm의 신선한 피질 유도 배지를 추가합니다.배양이 끝나면 파라핀 필름 시트를 뒤집고 멸균 집게를 사용하여 각 6cm 접시에 최대 16개의 중합 방울을 부드럽게 짜냅니다. 그런 다음 응집체를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 다음 날, 세포 배양 인큐베이터 내에서 14rpm에서 5도 각도로 기울어진 흔들 세포 배양 셰이커에 오가노이드 배양 접시를 옮기고 응집체가 관심 분화 단계에 도달할 때까지 매일 광학 현미경 모니터링을 수행합니다.20일째에는 3-3.5ml 입구가 있는 변형된 1ml 피펫 팁을 사용하여 응집체 배양물에서 6개의 오가노이드를 수집합니다. 500마이크로리터의 PBS가 들어 있는 24웰 플레이트의 한 웰에 오가노이드 3개를 넣고 5밀리리터 피펫을 사용하여 세척당 500마이크로리터의 새 PBS로 오가노이드를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 오가노이드를 차가운 4% 파라포름알데히드에 15분 동안 고정한 다음 실온 PBS에서 10분 동안 3회 세척한 다음 섭씨 4도에서 30% 자당 용액으로 최종 하룻밤 탈수합니다.다음 날, 탈수된 오가노이드를 1-50 Trypan Blue 희석액으로 10분 동안 사전 염색하여 동결절편 절차 중에 오가노이드를 시각화할 수 있도록 하고, 자당을 새로 준비된 포매 배지로 교체합니다. 섭씨 60도의 가열 패드에서 플레이트를 15분 동안 가열하여 임베딩 매체의 오가노이드를 평형화하고 오가노이드당 하나의 매립 몰드의 바닥을 새로운 매립 매체로 덮습니다. 주형을 얼음 위에 올려 포매 매체를 응고시키고, 오가노이드를 매립 주형으로 옮기고, 각 오가노이드가 덮일 때까지 새로운 매립 매체를 추가합니다.그런 다음 100% 에탄올 드라이아이스 냉동 수조에서 오가노이드를 최소 1분 동안 충격 동결하고 저온 유지 장치를 사용하여 면역세포화학 분석을 위해 각 오가노이드의 20마이크로미터 두께의 절편을 얻습니다. 전뇌형 오가노이드를 생성하려면 시작 집단에서 미분화된 세포의 균일한 단층으로 존재하는 IPSC 배양물만 사용합니다. 둘째 날에는 응집체가 가장자리가 부드러운 조밀한 세포 싹을 형성해야 합니다.10일차 응집체는 외부 표면에 매끄럽고 광학적으로 매끄럽고 광학적으로 반투명한 조직을 보여야 하며, 이는 신경외배엽의 유도를 나타냅니다. 프로토콜을 면밀히 따랐다면, 배치 내부 및 배치 전반에 걸쳐 편광 신경외배엽 형성에서 90% 이상의 균질성을 입증하는 고도로 표준화된 오가노이드 배치가 생성될 것입니다. 20일차 오가노이드에 대한 면역세포화학적 분석은 신경줄기세포 마커 Sox2, 전뇌 마커 Pax6 및 Otx2, 배측 피질 마커 Emx1을 발현하는 성층 신경 상피 루프를 보여줍니다.이러한 피질 루프는 N-cadherin 및 ZO-1의 정점 국소화, 정점에서 구조의 기저 측에 이르는 심실 영역 방사상 신경교세포 유래 미세소관, 인산화된 비멘틴에 대해 양성으로 염색되는 정점 위치 분열 세포에 의해 추가로 특징지어집니다. 비멘틴과 Tpx2에 대한 정점 방사상 신경교세포의 분열면을 분석하기 위해 비멘틴과 Tpx2에 대한 이중 염색을 수행하기 위해 동역학 핵 이동 중 유사분열 방추체와 정점 돌기를 시각화하는 데 사용할 수 있는 미세소관 관련 단백질을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 만능 줄기 세포에서 고도로 표준화되고 균질한 전뇌 유형 오가노이드를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술은 신경 조직 특이적 방식으로 배열된 복잡한 3D 세포 모델을 사용하여 신경 발달 장애의 인간 특이적 측면에 대한 연구를 용이하게 합니다. 이 기술이 숙달되면 이러한 피질 오가노이드는 질병 모델링 및 잠재적인 약물 테스트 또는 치료를 포함한 신경 발달, 진화 또는 유전자 기능 연구와 같은 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

generation-standardized-reproducible-forebrain-type-cerebral

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 유도 만능 줄기 세포에서 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 신경권이 어떻게 다른 세균층의 형성을 억제하는 신경외배엽층을 형성하는지 보여줍니다. 신경구는 3D 젤 매트릭스에 내장되어 신경 상피 새싹을 형성합니다. 오가노이드 배지로 배양하면 이러한 신경 상피 새싹은 특정 뇌 영역으로 분화되어 성숙한 뇌 오가노이드를 형성합니다.

인간 뇌 오가노이드를 생성하는 체외 방법

이 동영상은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 대뇌 오가노이드를 생성하는 분석을 보여줍니다. 인간 iPSC는 배아체(EB)를 형성하도록 유도됩니다. EB는 유도 배지를 사용하여 고분자 골격 위에서 배양되어 신경 줄기 세포, 전구 세포 및 미성숙 뉴런으로의 분화를 촉진합니다. 마지막으로, EB는 매트릭스에 삽입되어 대뇌 오가노이드 형성을 위한 유지 배지로 전달됩니다.

유도 만능 줄기 세포 유래 대뇌 오가노이드 생성

이 비디오는 인간 만능 줄기 세포(hPSC)가 구형 뇌 오가노이드로 변형되는 과정을 보여줍니다. 특정 억제제를 사용함으로써 hPSC는 신경 계통으로 분화하도록 유도되어 신경 외배엽 군체를 형성합니다. 그런 다음 특수 성장 인자를 도입하여 군체의 자기 조직화와 증식을 촉진하여 궁극적으로 구형 뇌 오가노이드의 형성으로 이어집니다.

인간 만능 줄기 세포에서 스페로이드 생성

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 전뇌형 오가노이드를 생성하는 과정을 간략하게 설명하며, 줄기 세포 응집체에서 뇌 피질을 모방하고 다양한 뉴런 유형으로 분화하는 복잡한 구조로 진행되는 과정을 보여줍니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 전뇌형 대뇌 오가노이드 생성

신경 상피 조직의 전례 없는 복잡성으로 인해 인간의 뇌 발달을 모델링하는 데 방해를 받았습니다. 여기에서는 인간 뇌 발달의 초기 사건을 묘사하고 체외에서 소두증을 모델링하기 위해 뇌 오가노이드의 강력한 생성 방법을 설명합니다.

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

이 연구에서, 우리는 표준 피더가없는 hPSC 배양물을 사용하여 간단하면서도 견고한 피질 오가노이드 배양 시스템에 대한 상세한 기술을 제공합니다. 이것은 시험관 내에서 뇌 노화의 측면을 모델링하는 오가노이드를 생성하기위한 신속하고 효율적이며 재현 가능한 프로토콜입니다.

체외에서 뇌 신경 노화를 모델링하기위한 피질 뇌 오가노이드의 강력하고 재현 가능한 생성

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

배우세요 인간 유도 만능 줄기 세포에서 표준화된 대뇌 오가노이드 생성 방법을 통해 초기 대뇌 피질 발생 메커니즘을 연구하는 기법입니다. 이 기술은 신경발달 장애 연구에 활용됩니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

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