인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 절차의 전반적인 목표는 인간 만능 줄기 세포에서 고도로 표준화되고 재현 가능한 전뇌 유형 오가노이드를 생성하는 것입니다. 이 방법은 새로운 개발 NTZ의 메커니즘을 모델링하기 위한 강력한 도구입니다. 특히, 초기 인간 피질 발생과 관련된 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 개별 오가노이드와 오가노이드 배치 간의 변동이 거의 없이 인간 피질 조직을 표준화되고 시간 효율적으로 생성할 수 있다는 것입니다. 오가노이드 기술은 인간 뇌의 발달, 구조 및 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 특히 하등 종의 뇌 모델에서는 발견되지 않는 측면에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 만능 줄기 세포 응집체를 생성하려면 줄기 세포 배양이 70-90% 포화도에 도달하면 6개의 웰 배양 플레이트 중 하나의 웰에 500마이크로리터의 세포 해리 시약을 추가하여 세포를 분리합니다.

단층 배양 조건에 적응하는 유도 만능 줄기 세포는 해리 및 응집 절차 중 스트레스로 인한 세포 사멸이 적기 때문에 응집체를 생성하기에 좋은 세포 유형입니다. 섭씨 37도에서 5분에서 10분 후 플레이트를 부드럽게 두드리고 2밀리리터의 DMEM/F-12를 사용하여 웰 바닥에서 세포를 세척합니다. 생성된 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 더 많은 DMEM/F-12 배지를 사용하여 세포 용액의 부피를 최대 10ml까지 가져옵니다.

계수 후, 만능 줄기 세포 응집체 당 3번째 세포로 4.5 곱하기 10을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 펠릿을 적절한 부피의 만능 줄기 세포 배지에 현탁시키고 50 마이크로몰 암석 억제제를 보충하여 배지 농도 150 마이크로리터당 3번째 세포의 4.5 배 10을 달성합니다. 다음으로, 150 마이크로리터의 세포를 96-well 낮은 부착 U-바닥 플레이트의 개별 웰에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다.

전방 신경외배엽 유도를 모니터링하기 위해 조직 배양 현미경을 사용하여 저배율에서 매일 만능 줄기 세포 응집체의 형태학적 변화를 면밀히 관찰합니다. 첫째 날에는 경계가 명확한 세포 응집체를 관찰해야 합니다. 2일차에는 각 웰 바닥의 세포 응집체를 방해하지 않고 배지의 약 2/3를 조심스럽게 흡인하고 폐기된 배지를 100마이크로리터의 새로운 만능 줄기 세포 배지로 교체합니다.

4일에서 6일 사이에 세포 응집체의 직경이 350 - 450 마이크로미터에 도달하고 가장자리가 매끄러워지면 수정된 100 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 최대 20개의 응집체를 5밀리리터의 피질 유도 배지를 포함하는 단일 6cm 낮은 부착 배양 플레이트로 옮깁니다. 3일에 한 번씩 피질 유도 배지를 새로운 배지로 교체하고 4X 대물렌즈 하에서 매일 응집체의 형태를 모니터링합니다. 피질 유도 배지에서 4-5일이 지나면 세포 응집체의 가장자리가 표면에서 밝아지기 시작하여 신경외배엽 분화가 나타나고 가성층화된 상피의 방사상 조직이 나타나야 합니다.

신경외배엽 응집체를 매트릭스 골격에 삽입하려면 기저막 추출물을 얼음 위에서 2-3시간 동안 해동합니다. 추출물이 해동되는 동안 멸균 가위를 사용하여 플라스틱 파라핀 필름을 16개의 오가노이드당 4 x 4cm 정사각형으로 자르고 각 필름 조각을 빈 100마이크로리터 마이크로피펫 팁 트레이 위에 놓습니다. 파라핀 필름을 장갑을 낀 손끝으로 작은 보조개가 나타나도록 누르고 70% 에탄올로 필름을 청소합니다.

밀폐된 멸균 생물 안전 캐비닛에서 30분 동안 UV 방사선을 조사한 후 1.5mm에서 2mm 구멍이 있는 변형된 100마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 세포 응집체를 필름의 딤플 하나로 이동합니다. 모든 응집체가 옮겨졌을 때 절단되지 않은 100마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 딤플에서 배지를 조심스럽게 흡입하고 각 세포 응집체에 40마이크로리터의 희석되지 않은 기저막 추출물을 추가합니다. 피펫 팁을 거칠게 조작하거나 흡인하여 오가노이드를 손상시키면 발달 중인 신경 상피가 손상될 수 있으므로 주의해야 합니다.

피펫 팁을 사용하여 응집체를 각 방울의 중간에 배치하고 멸균 집게를 사용하여 플라스틱 파라핀 필름 시트를 10cm 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 접시를 인큐베이터에 15-20분 동안 놓습니다. 추출물이 응고되는 동안 6cm 낮은 부착 배양 접시 하나에 5mm의 신선한 피질 유도 배지를 추가합니다.

배양이 끝나면 파라핀 필름 시트를 뒤집고 멸균 집게를 사용하여 각 6cm 접시에 최대 16개의 중합 방울을 부드럽게 짜냅니다. 그런 다음 응집체를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 다음 날, 세포 배양 인큐베이터 내에서 14rpm에서 5도 각도로 기울어진 흔들 세포 배양 셰이커에 오가노이드 배양 접시를 옮기고 응집체가 관심 분화 단계에 도달할 때까지 매일 광학 현미경 모니터링을 수행합니다.

20일째에는 3-3.5ml 입구가 있는 변형된 1ml 피펫 팁을 사용하여 응집체 배양물에서 6개의 오가노이드를 수집합니다. 500마이크로리터의 PBS가 들어 있는 24웰 플레이트의 한 웰에 오가노이드 3개를 넣고 5밀리리터 피펫을 사용하여 세척당 500마이크로리터의 새 PBS로 오가노이드를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 오가노이드를 차가운 4% 파라포름알데히드에 15분 동안 고정한 다음 실온 PBS에서 10분 동안 3회 세척한 다음 섭씨 4도에서 30% 자당 용액으로 최종 하룻밤 탈수합니다.

다음 날, 탈수된 오가노이드를 1-50 Trypan Blue 희석액으로 10분 동안 사전 염색하여 동결절편 절차 중에 오가노이드를 시각화할 수 있도록 하고, 자당을 새로 준비된 포매 배지로 교체합니다. 섭씨 60도의 가열 패드에서 플레이트를 15분 동안 가열하여 임베딩 매체의 오가노이드를 평형화하고 오가노이드당 하나의 매립 몰드의 바닥을 새로운 매립 매체로 덮습니다. 주형을 얼음 위에 올려 포매 매체를 응고시키고, 오가노이드를 매립 주형으로 옮기고, 각 오가노이드가 덮일 때까지 새로운 매립 매체를 추가합니다.

그런 다음 100% 에탄올 드라이아이스 냉동 수조에서 오가노이드를 최소 1분 동안 충격 동결하고 저온 유지 장치를 사용하여 면역세포화학 분석을 위해 각 오가노이드의 20마이크로미터 두께의 절편을 얻습니다. 전뇌형 오가노이드를 생성하려면 시작 집단에서 미분화된 세포의 균일한 단층으로 존재하는 IPSC 배양물만 사용합니다. 둘째 날에는 응집체가 가장자리가 부드러운 조밀한 세포 싹을 형성해야 합니다.

10일차 응집체는 외부 표면에 매끄럽고 광학적으로 매끄럽고 광학적으로 반투명한 조직을 보여야 하며, 이는 신경외배엽의 유도를 나타냅니다. 프로토콜을 면밀히 따랐다면, 배치 내부 및 배치 전반에 걸쳐 편광 신경외배엽 형성에서 90% 이상의 균질성을 입증하는 고도로 표준화된 오가노이드 배치가 생성될 것입니다. 20일차 오가노이드에 대한 면역세포화학적 분석은 신경줄기세포 마커 Sox2, 전뇌 마커 Pax6 및 Otx2, 배측 피질 마커 Emx1을 발현하는 성층 신경 상피 루프를 보여줍니다.

이러한 피질 루프는 N-cadherin 및 ZO-1의 정점 국소화, 정점에서 구조의 기저 측에 이르는 심실 영역 방사상 신경교세포 유래 미세소관, 인산화된 비멘틴에 대해 양성으로 염색되는 정점 위치 분열 세포에 의해 추가로 특징지어집니다. 비멘틴과 Tpx2에 대한 정점 방사상 신경교세포의 분열면을 분석하기 위해 비멘틴과 Tpx2에 대한 이중 염색을 수행하기 위해 동역학 핵 이동 중 유사분열 방추체와 정점 돌기를 시각화하는 데 사용할 수 있는 미세소관 관련 단백질을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 만능 줄기 세포에서 고도로 표준화되고 균질한 전뇌 유형 오가노이드를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술은 신경 조직 특이적 방식으로 배열된 복잡한 3D 세포 모델을 사용하여 신경 발달 장애의 인간 특이적 측면에 대한 연구를 용이하게 합니다. 이 기술이 숙달되면 이러한 피질 오가노이드는 질병 모델링 및 잠재적인 약물 테스트 또는 치료를 포함한 신경 발달, 진화 또는 유전자 기능 연구와 같은 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.