Diseksiyon, Kültür ve Analizi Xenopus laevis Embriyonik Retina Doku

Bu prosedürün genel amacı, ksenopus retinal hücrelerinin birincil hücre kültürünü hazırlamaktır. Bu, önce retinayı ortaya çıkarmak için çevredeki dokuların çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, retina dokusunu eksize etmektir.

Daha sonra, retina dokusu tek hücrelere ayrılır. Son adım, retina hücrelerini Klonlanmamış bir tabak üzerine yerleştirmek ve kalsiyum görüntüleme için sabah 4:00'te grip eklemektir. Sonuç olarak, retina hücre kültüründe kalsiyum aktivitesini tespit etmek için konfokal mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem, gelişim biyolojisi, nörobiyoloji ve hücre biyolojisi alanlarında, retina gelişiminde kalsiyum ve elektriksel aktivitenin rolü ve ayrıca tek hücre düzeyinde gen ekspresyonu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu prosedüre yeni başlayan bireyler mücadele edecektir çünkü zamanında ve doğru diseksiyonlar için ince motor hareketler gereklidir. Bu yöntemin görsel gösterimi, karmaşık el-göz hareketlerinin gerekli olması nedeniyle diseksiyon adımlarının zor olması nedeniyle kritik öneme sahiptir.

Bu işleme davlumbazın içinde başlamak için, 10 mililitre içeren 60 milimetrelik bir plastik Petri kabı hazırlayın ve etiketleyin. Diseksiyon plakası olarak kullanılacak hücre kültürü ortamı. İsteğe bağlı olarak, 10 miligram kollajenaz B, evre 25 veya daha genç embriyoların diseksiyonu için doku tabakasının ayrılmasına yardımcı olmak için mililitre başına 1.0 miligramlık bir nihai konsantrasyon için diseksiyon plakasına eklenebilir.

Ayrıca, iki mililitre içeren 1 35 milimetre lon yüzey tabağı hazırlayın. Kültür plakası olarak kullanılacak hücre kültürü ortamı. Eksplan ayrışma tüpü olarak kullanılacak bir adet boş 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü ve 15 mililitre içeren bir adet 15 mililitrelik konik şahin tüpü.

Hücre kültürü ortamı. Daha sonra, biri explan dissosiyasyon plakası olarak, diğeri davlumbazın dışında bir X explan durulama plakası olarak kullanılmak üzere, diseksiyon için CMF olmak üzere iki mililitre içeren 2 adet 35 milimetrelik plastik Petri kabı hazırlayın. 10 mililitre içeren iki adet 60 milimetrelik plastik Petri kabı hazırlayın.

0.1 XMMR, biri tutma plakası olarak kullanılacak, diğeri kardeş plaka olarak kullanılacak ve 10 mililitre, 0.1 XMMR artı mililitre başına 0.5 miligram içeren bir 60 milimetre plastik Petri kabı. HANIM 2 22. Bundan sonra, explan ayrışma plakasına CMF'de% 40 mikrolitre,% 5 tripsin ekleyin.

Karıştırmak için döndürün, ardından bir kenara koyun. Daha sonra, iki çift ince forseps kullanarak bir diseksiyon kapsamı kullanarak diseksiyona devam edin. Embriyonun ventral tarafında, arka uçtan başlayarak ve embriyonun ön kısmındaki çimento bezi boyunca devam eden orta sagital bir kesim yapın.

Kesiğin her iki tarafını da yayarak embriyoyu dikkatlice açın. Bu, embriyonun dorsal tarafının diseksiyon plakasına bakmasına neden olur. Ardından endoderm ve mezodermi ortaya çıkarmak için ventral ektodermi açın.

Daha sonra, endodermi ve mezodermi bu dokunun ilk ve en büyük tabakasını çıkarın. Endoderm, büyük hücreler ve çok az belirgin organizasyon ile görünüşte çok kabarıktır. Bu tabakayı çıkardıktan sonra somitler ve Noor görünür hale gelecektir.

Daha iyi kontrast için, embriyoyu 10 mililitre, hücre kültürü ortamı ve 100 mikrolitre% 1 Nil mavisi sülfat çözeltisi içeren ayrı bir 60 milimetre plastik Petri kabına aktarın ve iki ila üç dakika inkübe edin. Daha sonra, diseksiyon plakasına geri aktarın. Bu, daha kolay tanımlama ve yönlendirme için ektodermi, somitleri ve Noor'u lekeleyecektir.

Embriyonun ön kısmına odaklanarak, beyni ve optik vezikülleri ortaya çıkarmak için Noor'u ve kalan mezodermi dikkatlice çıkarın. Beyin ve optik veziküller tamamen açığa çıktığında, nöral tüpü ve beynin hemen arkasındaki alttaki ektodermi kesmek için forsepsleri kullanın. Ektoderm üstte olacak şekilde bu kısmı ters çevirin.

Altta yatan optik veziküllere zarar vermemek için dikkatli olun ve ektodermi dikkatlice çıkarın. Son olarak, evre 25'ten daha eski bir embriyoyu incelemek için optik vezikülleri forseps ile beyinden ayırın. İlk olarak, embriyonun ventral kısmını anestezi plakasındaki forseps ile çıkarın.

Daha iyi kontrast için, embriyoyu ektodermi lekelemek için iki ila üç dakika boyunca 10 mililitre, 0.1 XMMR ve 100 mikrolitre% 1 Nil mavisi sülfat içeren 60 milimetrelik bir plastik Petri kabına aktarın. Ardından diseksiyon plakasına aktarın. Daha sonra embriyoyu yerinde tutarak, üst üste binen ektodermin hemen altında bulunan retinayı veya optik vezikülü dikkatlice çıkarın.

Optik vezikül veya retina diseke edildikten sonra, aerosole dayanıklı bir uç kullanarak bir P 100 mikro pipet ile dikkatlice X explan durulama plakasına aktarın. Herhangi bir hava sıvısı sınırına temas etmesine izin vermemeye dikkat edin. Ardından explan'ın 30 saniye oturmasına izin verin.

Daha sonra, CMF'de 80 mikrolitre% 0.1 tripsin ekplan ayrışma plakasından dış ayrışma tüpüne aktarın. Bundan sonra, retina veya optik vezikülü explan durulama plakasından explan dissosiyasyon tüpüne aktarın. Explan durulama çözeltisinin aktarılmasından kaçınmak.

Daha sonra dokunun oda sıcaklığında bir saat boyunca explan ayrışma tüpünde ayrışmasına izin verin. Deney boyunca hücrelerin birden fazla görüntüsü alınacaksa, kültür plakasının alt tarafına küçük damlalar halinde süper yapıştırıcı ile bir ızgara yapıştırın. Bu, hücreleri plakalamak için prosedürün farklı noktalarında aynı oryantasyonlardaki aynı hücrelerin görüntülerinin alınmasına izin verecektir.

İlk olarak, 40 mikrolitre çözeltiyi explan ayrışma tüpünden yavaşça çıkarın ve atın. Ardından, hücreleri yavaşça kültür plakasına aktarmak için aerosole dirençli bir uçla P 100'ü kullanın. Hücreleri plakaya aspire ederken, yavaşça pipetleyin ve hücreleri plakanın ortasındaki küçük bir alanda tutun.

Bu şekil, bir saatlik görüntüleme boyunca tek bir hücrenin kalsiyum aktivitesinin bir örneğini göstermektedir. Bu rakamlar, farklı gelişim aşamalarında analiz edildiği gibi embriyonik retina hücrelerinde kalsiyum görüntüleme deneylerinin temsili sonuçlarını sağlar. Kısaca sonuçlar, kalsiyum aktivitesini belirli bir prob için pozitif hücrelerle ilişkilendirme açısından 35. aşamada ani zirvelerle kalsiyumun gelişimsel olarak düzenlendiğini göstermektedir.

Balık deneylerinde, istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmasa da, bir GABAerjik belirteç için pozitif hücrelerin, glutamaterjik bir belirteç veya PT F1 AA gen kodlaması için pozitif hücrelerden daha yüksek seviyelerde kalsiyum sıçrama aktivitesi gösterme eğilimi vardı, GABAerjik fenotipin teşvik edilmesiyle ilişkili bir transkripsiyon faktörü Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa bir plaka için yaklaşık üç saat 30 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, hangi hücrelerin spesifik fenotipik belirteçleri eksprese ettiği gibi ek soruları yanıtlamak veya elektrofizyolojik kayıtları analiz etmek için hücre kültürü ve C iki hibridizasyonu veya elektrofizyolojik kayıtlar gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, retina dokusunun nasıl diseksiyon yapılacağını, retina dokusunun nasıl ayrıştırılacağını ve retina hücrelerinin nasıl plaka yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.