Name: Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: 배우세요 아실-비오틴 거래소(ABE) 분석법을 사용하여 양식 해마 뉴런의 단백질 팔미토일화를 검출하는 방법을. 이 생화학적 기법은 신경 세포 내 단백질 이동 연구에 민감하고 정량적인 결과를 제공합니다.

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이 작품은 건강 연구 청소 - 81,158 캐나다 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. 양식 기본 Hippocampal 뉴런에서 대상 단백질의 추출 <ol><li> 단백 분해 효소 억제제로, 기본 hippocampal 세포 내생 단백질을 수확하기 전에 용해 완충액 (표 1 LB)를 준비합니다. 용해 버퍼의 10 ML에, 10mM의 최종 농도에 0.1 ML의 phenylmethanesulfonyl 불화 솔루션 (PMSF)를 추가, 1 프로테아제 억제제 칵테일 태블릿을 추가합니다. </li><li> 동결 건조 된 분말에서 N-ethylmaleimide (NEM) 솔루션을 (표 1) 준비합니다. 부드럽게 실온 (RT)에 100 % EtOH에 용해. 항상 실험 날짜에 신선한 NEM 솔루션을 준비합니다. </li><li> 다음 용해 버퍼와 NEM 조화를 이루고 있습니다. 신선한 50 ML 원뿔 튜브에 200 NEM 솔루션의 0.5 ML를 추가합니다. 상위 20여 ML의 LB, 빠르게 장소 LB를 추가합니다 4에 흔들 플랫폼 ° C가 완전히 5 분에 혼합에 + NEM (50mM의 최종 농도). 항상 제대로 두 혼합 할 수 있도록, NEM / EtOH 솔루션 첫 번째와 LB 초를 추가합니다. </li><li> 보육과 얼음의 *의 장소에서 배양 된 뉴런을 제거합니다. 부드럽게 세포 미디어를 제거하고 부드럽게 감기에 인산을 두 번 씻어 염분 (PBS) 1X는 버퍼. 일회용 휴대 리프터를 사용하여 hippocampal 뉴런, 그리고 흠집 셀의 첫 번째 우물 LB 300 ML + 50mM NEM을 추가합니다. 세포 lysate를 수집 한 다음 해당 그룹의 다음 잘에 lysate를 방전. 셀 리프터를 사용하여 잘 두 번째 내에서 세포를 긁어 수집, 그리고 더 lysate을 집중하기 위해 필요한 경우, 세 번째도를 사용하여 반복합니다. </li><li> 예비 냉각 (얼음), 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포 lysate를 수집합니다. 남아있는 세포 lysate를 수집하는 LB 100 μl + 50mM NEM을 사용하여 1.4 단계를 반복합니다. 솔루션에 거품을 날려 버리지 않도록 조심하는 것 기계 용해에 도움 26 ½ 게이지 주사기 5-6 시간을 통해 총 세포 lysate를 전달합니다. 장비를 사용할 수있는 경우 하나는 대신 얼음에 15 초에 sonicate 수 있습니다. 4 ° C.에서 ≥ 30 분에 세포 lysate를 Nutate </li><li> 셀 lysa을 명확히테 순서에 따라 펠릿을 취소 lysed 세포와 세제 - 불용성 물질로 16,000 XG / 30 분에서 원심 분리에 의해. </li><li> 얼음에 새로운 미리 냉각 1.5 ML 튜브에 세포 lysate (표면에 뜨는)를 해제 수집합니다. 셀의 모든 그룹에 대한 수확 프로토콜을 반복합니다. 측정 단백질 BCA 분석을 사용하는 모든 lysate 샘플의 농도, 500 μg의 권장 최소 정확히 같은 총 단백질을 가지고 세포의 그룹에서 모든 lysate 샘플의 볼륨을 정상화. 모든 샘플 LB + 50mM NEM 500 μl 전체 볼륨을 맨. </li><li> lysate 시료의 각 대상 단백질에 대한 감독 차 항체의 1-5 μg을 추가합니다. 4에 밤새 항체 - lysate 혼합 샘플 ° C.를 Nutate </li></ol> * 기본 쥐 hippocampal 뉴런은 B27 neuronal 보충제를 포함하는 혈청이없는 미디어 / 잘 6 잘 접시에 약 250,000 세포의 밀도에 배양해야 이전과 욕망에 대해 5 설명하고, 성장시간의 d 개의 길이, 성숙을 달성하기위한 일반적 14~16일 인 체외 (DIV). 총 단백질 500 μg의 최소 성공적으로 immunoprecipitate 일반적으로 6 잘 접시로부터 2-3 우물을 필요로하는 대상 neuronal 단백질을 biotinylate하는 것이 좋습니다. 2. 항체 바인딩 된 대상 단백질의 강수량 <ol><li> 대상 단백질을 precipitating과 immobilizing하기 전에, 단백질, 또는 단백질 G-코팅 세 파로스 비즈의 50 % 슬러리를 준비합니다. 특히, 모든 샘플은 구슬의 동등한 양을 수 있도록, 1.5 ML 튜브에 샘플 당 세 파로스 비즈 ≥ 60 μl를 추가합니다. 장비를 사용할 수있는 경우 자기 구슬도 적합합니다. </li><li> 각 항체 - lysate 샘플의 50 % 슬러리의 동일한 볼륨을 추가, 4에서 ≥ 1 시간에 nutate ° C. </li></ol> 3. 아실 - 비오틴 교류 : 히드 록실 아민 (햄) 절단 <ol><li> 단계 2.2을 수행하는 동안, 디의 용해 버퍼 (LB)와 튜브의 수를 준비fferent PHS. pH는 다음과 같이 매우 중요하며 항상 산도 측정기를 사용하여 조정해야합니다. LB 샘플 당 산도 7.2, 및 샘플 당 엄격한 버퍼 (표 1)의 0.5 ML의 2 ML을 준비합니다. 또한 단계 1.1-1.3에서와 같이, 0.5 ML의 LB에게 샘플 당 + 10mM NEM을 준비합니다. 단계 1.1에서와 같이, 모든 용해 버퍼에 PMSF 및 프로테아제 억제제의 정제를 추가합니다. </li><li><ol class="lalpha"><li> 히드 록실 아민 (햄)는 그의 절단 palmitate의 cysteines에서 biotinylation (그림 1)가 필요합니다 강력한 환원제이다, 그리고 햄 절단의 누락이 대조군 역할을합니다. 샘플 두개, 햄 절단 단계를 (-햄) 생략 하나, 햄 단계 (+ 햄)를 포함 하나에 구슬의 각 샘플을 분할. 햄 치료로 인한 단백질의 저하에 정상화하기 위해, 하나는 - 햄 제어에 사용되는 구슬의 1 / 3과 3 가지로 각각의 샘플을 분할하고, 나머지 3분의 2는 + 햄 치료에 사용됩니다. </li><li> 추가 1 준비합니다.각 샘플에 대한 - 햄 제어로 분류 얼음 5 ML 튜브. 단계 2.2 후, 부드럽게 4 ° C (이 속도, 기간 및 달리 명시되지 않은 모든 나머지 단계 온도에서 원심 분리기)에서 0.5 XG / 1 분에 모든 샘플 &#39;구슬을 원심 분리기, 얼음에 튜브를 삽입, 표면에 뜨는을 제거하고 LB + 10mM NEM 600 μl의 구슬을 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li><li> 용해 버퍼 + NEM 10mM에서 다시 일시 중지 샘플 &#39;구슬 후, 즉시 얼음에 그 샘플의 - 햄 관에 200 샘플의 lysate - 비즈 슬러리의 μl, 그리고 퇴원를 수집합니다. LB의 추가 300 μl + - 햄 샘플에 10mM NEM, 각 샘플 500 μl의 총 + 햄 샘플에 대한 추가 100 μl를 추가합니다. 얼음에 10 분 동안 튜브를 품다. </li><li> 다시 일시 중지 (세탁) - 햄과 + 햄 샘플을 부드럽게 0.5 ML 엄격한 버퍼와, 샘플 당. 더 이상 SDS의 부화가에서 바인딩 된 항체의 제거 될 것이기 때문에 빨리이 단계를 수행구슬. </li><li> 부드럽게 LB의 산도 7.2의 0.5 ML / 샘플의 모든 샘플을 세 번 씻어하고, 단계 3.2b에서와 같이 세차 사이에 스핀 다운. </li><li> 단계 3.5을 수행하는 동안, 햄 버퍼 (표 1) 준비합니다. 0.5 ML LB의 산도 7.2, 당 + 햄 샘플의 볼륨에서 1M의 최종 농도를 달성하기 위해, 새로운 튜브로 히드 록실 아민 용액의 적절한 볼륨을 추가합니다. 항상 실험 일의 신선한 햄 버퍼를 준비합니다. 모든 햄 샘플, 모든 + 햄 샘플에 햄 버퍼의 0.5 ML / 샘플에 LB의 산도 7.2의 0.5 ML / 샘플을 추가합니다. </li><li> 실온 (RT)에서 1 시간에 대한 모든 샘플을 Nutate. 1 시간을 초과하지 마십시오. </li></ol> 4. 아실 - 비오틴 교류 : 비오틴 - BMCC 라벨링 <ol><li> 단계 3.6을 수행하는 동안, LB의 pH를 2 ML을 준비 단계 3.1에서와 같이 샘플 당 6.2 (표 1). 필요한 때까지 얼음에 LB의 pH를 6.2 배치합니다. 또한 사용하기 전에 바로 비오틴 - BMCC (표 1)의 주식 솔루션을 준비합니다. 정확히는를 달다비오틴 - BMCC의 tly 2.1 MG는 1.5 ML 튜브에 수집하고, 부드럽게 필름 농도를 (분말을 깨고 피펫을 사용하지 않는 달성하기 위해, RT에서 흔들 플랫폼에 배치하여 0.5 ML 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 용해 ). </li><li> 단계 3.6가 완료되면 부드럽게 잔류 햄 버퍼를 제거하는, 산도 6.2 용해 버퍼에 한 번 구슬을 씻는다. 표면에 뜨는을 제거하고 얼음에 샘플을 배치합니다. </li><li> 비오틴 - BMCC는 cysteines 무료 thiol 그룹 (그림 1)에 대한 높은 친화력을 가지고 maliemide 복합 비오틴 분자입니다. 단계 4.2 수행하는 동안, 5 μM으로는 0.5 μM 사이의 작업 농도에서 샘플 당 비오틴 - BMCC 버퍼의 0.5 ML (표 1) 준비합니다. 5 μm의 초과 농도 가능성이 대상 단백질 6 포화되며, 일반적으로 초과하지 말아야하지만이 원하는 대상 단백질에 따라 다를 수 있습니다. 각 샘플에 비오틴 - BMCC 버퍼의 0.5 ML를 추가하고, 4에서 정확히 1 시간에 nutate℃ 일, C. 1 시간을 초과하지 마십시오. </li></ol> 5. 비오틴 - 복합 대상 단백질과 SDS-PAGE의 용출 <ol><li> 단계 4.3가 완료되면 부드럽게 LB의 pH를 6.2에 한 번 모든 샘플을 씻는다. 세차 사이에 얼음에 모든 샘플을 보관. -20 ° C 저장로부터 환원제 (표 1) 배 SDS 샘플 버퍼를 제거하고 천천히 얼음을 녹여. </li><li> 부드럽게 LB의 pH를 7.5에서 샘플을 세 번 씻어 + PMSF / 억제제 및 세차 사이에 얼음 샘플을 유지. </li><li> 튜브의 바닥에 남아있는 버퍼와 슬러리의 pelleted 구슬을두고, 세 번째 세척 표면에 뜨는을 제거합니다. 슬러리를 통해 관의 맨 ​​아래에 작은 직경 팁 (겔 로딩 팁이나 P2 피펫 팁은 충분)와 피펫을 찍어, 신속하게 모든 구슬을 차지하지 않도록주의하는 것 남아있는 버퍼를 수집합니다. </li><li> 5mM의 최종 농도를 달성 할 수 DL-Dithiothreitol (DTT)의 2 배 SDS 샘플 버퍼를 보완. 추가각 샘플에 2 배 샘플 버퍼의 40-50 μl가 + 5mM DTT. 필요 소용돌이 구슬이 완전히 샘플 버퍼와 섞어 경우, 즉시 샘플 버퍼에 잠겨 펠릿의 모든 구슬을 수집하는 고속 원심 분리기. </li><li> 75-80시 10 분에 대한 모든 샘플을 삶아 ° C. 완전히 펠릿 구슬로 16,000에서 ≥ 10 벤치 위에 분, 및 원심 분리기 XG / 3 분에 RT로 시원한 샘플을 보자. </li><li> 서쪽은 SDS-PAGE 7을 사용, blotting에 적합한 polyacrylamide 젤에서 단일 차선 각 샘플에서 용출 단백질 (표면에 뜨는)의 전체 볼륨을 추가합니다. 하나의 샘플에 대한 - 햄 제어 eluent와 + 햄의 eluent는 SDS-PAGE (그림 2) 동안 서로에 즉시 옆에 실행되도록 모든 샘플을 구성합니다. SDS-PAGE 후, PVDF 또는 니트로 셀룰로스 막에 전송할 수 있습니다. </li></ol> 6. Blotting 및 대상 단백질의 Palmitoylation의 검색 서양 <ol><li> 단계 5.6이 완료되면, 멤브레인을 씻어두 번에 RT에서 흔들 플랫폼에서 10 분에 식염 (TBS 1X)를 트리스 버퍼. </li><li> TBS 1X의 볼륨에 3 % 무게를 달성하기 위해, (BSA) 소 혈청 알부민을 무게가 아닌 특정 라벨을 차단하기 위해 차단 버퍼를 준비 + 완전히 잠기 멤브레인을에 충분합니다 초반-20 0.05 % (TBS-T) . streptavidin이 blotting를 들어, 항상 BSA를 차단 아니라 분유. 흔들 플랫폼에서 RT에서 1 시간 동안 멤브레인을 차단합니다. </li><li> TBS-T + 0.3 % BSA의 항체 솔루션을 준비합니다. Streptavidin-HRP 항체 추가 1:5,000-1:10,000에 희석 증류수 1 MG / ML에서 재구성. 일단 단계 6.2이 완료되고, 10 분에 TBS-T에 한 번 멤브레인을 씻고 다음 4 ° C.에 박 RT에서 1 시간에 하나의 흔들 플랫폼에 Streptavidin 항체 솔루션의 멤브레인을 품다, 또는 </li><li> 흔들 플랫폼에서 10 분에 TBS-T에 막 세 번 씻으십시오. palmitoylation 신호를 감지하기 위해, 화학을 사용하여 HRP의 발광을 노출iluminescent 기판 키트. </li><li> immunoprecipitated 된 관심 단백질의 양에 palmitoylation 수준을 정상화하기 위해, RT에서 흔들 플랫폼에서 5-10 분 동안 서부 얼룩 잎 버퍼를 사용하여 멤브레인을 제거. 6.4 원래 immunoprecipitation에 사용 된 관심의 단백질에 대한 기본 항체를 사용하여 - 단계 6.1를 반복합니다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심있는 단백질 palmitoylation을 수량화하고, immunoprecipitated 단백질의 양에 palmitoylation 수준을 정상화. </li></ol>

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<li>Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+protein+palmitoylation+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling.</a> Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).</li>
</ol>

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여기에 제시된 IP-아베 분석은 대부분 표준 생화학 기술을 사용하여, 교양 차 hippocampal 뉴런의 palmitoylated 단백질을 검출하기위한 간단하고 매우 민감한 방법입니다. 이 이미 서쪽 blotting 자료를 갖춘 실험실의 분석이 쉽게 적응합니다. IP-아베 분석이 빠른 속도로 기판 단백질에 palmitate의 수준을 감지 할 수 이전에 설명 된 아베 화학 2-4에 이어 사람의 대상 단백질을 분리하고 고정 할 수있는 표준 immunoprecipitation 프로토콜을 결합합니다. 아베 기술은 대규모 palmitoyl - proteomic 글로벌 palmitoylation 프로필 심사하고, 하나의 대상 단백질의 palmitoylation 수준의 급속한 탐지 등의 다양한 조직 및 세포 라인에 palmitoylated 단백질을 검사 용 응용 프로그램의 다양한 있습니다. 아베 화학 이전 설명은 다른 방법 셀 용해와 neuronal 제자의 세제 추출을 활용 한eins, 2, 9, 무료 thiol-길목 10, 11, biotinylation 및 대상 단백질 4 정화는 실험의 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 대상 단백질의 palmitoylated 분수의 자신의 세포 멤브레인 대한 타겟팅 및 감지에 neuronal 단백질 결과 palmitate의 추가는 이러한 멤브레인로부터 추출해야합니다. 이전에 설명 된 아베 방법은 원하는 대상 단백질을 추출 할 이온 9 비 이온 세제 8 다양한 활용 한 결과, 특정 세제의 사용은 대상 단백질과 알려진 막 거래에 따라 달라집니다. 여기, 우리는 활용 비 denaturing 및 비 이온 세제 IGEPAL CA-630 우리가 palmitoylated neuronal 단백질 δ-catenin (그림 2)의 추출 및 검출을위한 검증 한 palmitoylated 단백질을 추출 할 수 있습니다.에게 IGEPAL CA-630의 구조는하지 않습니다 부피가 큰과 강성 비 극 헤드 그룹을 포함기본 단백질 형태 나 상호 작용을 방해하지만,이를 통해 그들에게 혼 화성을 부여하고 추출을 허용, 막 관련 단백질의 소수성 영역과의 연결을 허용하는. 시냅스의 신경 막 또는 포스트 시냅스 밀도로 지역화 많은 neuronal 단백질이 IGEPAL CA-630을 사용하여 추출해야하지만 일부는 완전히 solubilize하지 않을 수 있으며,이 트라이 튼 X-100과 같은 다른 비 denaturing 세제의 사용을 요구할 수 있습니다 이전에 아베 화학 2, 8 사용되어. 아베 화학 몇 가지 설명은 또한 단백질 정제 4 다른 수단을 필요로 비오틴 - HPDP (열 과학)라는 우리가 여기서 설명하는 분자,에서 다른 thiol 반응 biotinylation 시약을 활용하고 있습니다. 비오틴 - HPDP는 구조적으로 D, maliemide 링커 암의 이황화 결합을 포함하는 다른 thiol 반응, maliemide - 복합 비오틴 분자입니다이 이황화 결합을 포함하지 않습니다 비오틴 - BMCC,에서 ifferentiating. 비오틴 - HPDP하여 단백질의 무료 또는 palmitoylated 시스테인의 thiol-biotinylation 후, 대상 단백질과 비오틴 그룹 사이의 결과 이​​황화 결합은 biotinylation를 만드는 비오틴 그룹을 해제하고 수정되지 않은 형태의 단백질을 생성하기 위해 시약을 줄여 흘리고 할 수 있습니다 비오틴 - HPDP 과도하고 치료하여. 이 biotinylation 시약 이러한 streptavidin-코팅 구슬로 고정 아비딘의 시약에 의한 대상 단백질의 정화가 필요에 따라서 사용합니다. 그러나, 비오틴 - BMCC하여 대상 단백질의 thiol-biotinylation, 우리가 설명으로 안정적이고 상대적으로 영구적이며, 항체 대상에 대한 감독과 세 파로스 구슬에 고정하여 대상 단백질의 정화가 필요합니다. 모두 아베 기술은 이전에 대규모 스크린, 단일 단백질 2, 8-10, 12 palmitoylation의 검출에 활용하고, 한우리가 여기서 설명하는 IP-아베 분석은 하나의 neuronal 대상 단백질의 palmitoylation의 급속한 탐지를위한 최적입니다. 세포 palmitoylation의 압도적 인 다수가 cysteine​​s의 thiol 그룹 (우리는이 프로토콜에 &#39;palmitoylation&#39;로 일반화 S-palmitoylation,이라고한다)에 palmitate의 치료 또한을 포함, 단백질의 그러나 매우 제한된 그룹은 글리신에 돌이킬 수없는 palmitoylation를 받게 아르 하고 안정적인 아미드 결합의 형성을 통해 시스테인 잔류 물은 N-palmitoylation 13 칭했다. 아베 화학 중 하나 한계는 아미드 결합의 안정성 N-palmitoylation의 기인을 감지하기위한 수 없다는 것입니다, 그래서 palmitoylation에 대한 새로운 대상 단백질의 심사는 3H-palmitate 신진 대사 라벨 1을 사용 확인해야합니다. 이전에 언급 한 바와 같이, IP-아베 분석을 쉽게 트란 등의 여러 소스에서 단백질 추출물에 palmitoylation을 조사에 적용 할 수heterologous 세포 라인, 기본 조직, 여러 뇌 영역에서 기본 neuronal 문화를 sfected. IP-아베 분석은 기초 조건 10 세 미만 교양 뉴런의 시냅스 단백질의 동적 palmitate 회전율을 검토를 들면, 대상 단백질 여덟 따라 palmitoylated 시스테인의 위치를 식별 할 수있는 변이 시스테인 - 투 - 세린 단백질의 palmitoylation의 자족을 조사에 활용 된 그리고 neuronal 단백질의 palmitoylation 수준의 변화는 neuronal 활동 9 유도에 따라. IP-아베 분석의 감도 및 적응성은 neuronal 단백질의 palmitoylation 프로파일을 검토하고, palmitoylation의 역동적 인 변화를 검출하기위한 최적의하기에 이상적으로 적합합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> 시그마 </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93,482 </td><td></td></tr><tr><td> 프로테아제 억제제 칵테일 </td><td> 로슈 완벽한 미니 </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> NEM </td><td> 시그마 </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> 햄 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> BCA 단백질 분석 키트 </td><td> 열 과학 </td><td> 23,225 </td><td> 선택한 세제와의 호환성을 보장 </td></tr><tr><td> 단백질 G / A-코팅 세 파로스 비즈 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> 비오틴 - BMCC </td><td> 열 과학 </td><td> 21,900 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP </td><td> 열 과학 </td><td> 21,126 </td><td> 물 1 MG / ML에서 Reconstitute </td></tr><tr><td> 서양 얼룩 옷 벗는 다든가 버퍼 </td><td> 열 과학 </td><td> 21,059 </td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 hippocampal 뉴런의 단백질 palmitoylation의 감지

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation는 불안정한 thioester 결합을 통해 기판 단백질의 시스테인 잔류 물에 16 탄소 포화 지방산, palmitate의 첨부 파일을 포함하는 사후 병진 지질 수정입니다 [1 검토]. 기판 단백질의 Palmitoylation은 소수성을 증가 시키며, 일반적으로 세포의 세포막 대한의 거래를 용이하게한다. 최근 연구는 palmitate의 매출이 세포가 단백질의 타겟팅과 거래를 규제하는이 중요한 메커니즘입니다 제안, 뉴런 1, 2에서 가장 일반적인 지질 수정 중 하나 palmitoylation을 보여 주었다. palmitoylated 기판의 식별 및 탐지 따라서 뉴런의 단백질 인신 매매에 대한 우리의 이해를 발전 할 수 있습니다. 과거에 단백질 palmitoylation의 검출은 기술적으로 인해 기판 ​​단백질 간의 합의 순서의 부족에 방해하고, 신진 대사 labeli에 대한 의존도되었습니다3 H-palmitate, 낮은 감도와 시간이 많이 소요되는 생화학 분석과의 NG palmitoyl - 단백질. 아실-비오틴 거래소 (아베) 분석의 개발은 palmitoylated 단백질을 2-4 빠르고 고감도 검출이 가능하고, neuronal 단백질에 palmitate의 동적 매출을 측정하기위한 최적입니다. 아베 분석은 세 생화학 단계 (그림 1)로 구성되어 있습니다 : 1) 수정되지 않은 시스테인 thiol 그룹의 돌이킬 수없는 봉쇄 N-ethylmaliemide (NEM), 2) 특정 절단 및 히드 록실 아민 (햄)로부터 palmitoylated 시스테인의 thiol 그룹의 unmasking을 사용하고, thiol 반응 biotinylation 시약을 사용하여 palmitoylated 시스테인 3) 선택적 라벨, 비오틴 - BMCC. 아베 단계를 수행 thiol-biotinylated 단백질의 정제는 실험의 전반적인 목표에 따라 다릅니다 있습니다. 여기, 우리는 기본 hippocamp의 관심 palmitoylated 단백질을 정화하는 방법을 설명초기 immunoprecipitation (IP) 아베 분석 및 서부 직접 IP-아베 분석을이라고한다되는 단백질의 palmitoylation 수준을 측정 할 수 blotting 다음 단백질, 대한 감독 항체를 사용하여 단계로 야외 뉴런. 배아 쥐 hippocampal 뉴런의 낮은 밀도 문화가 널리 IP-아베 분석을 사용하여 neuronal 단백질 palmitoylation를 공부에이를 이상적으로 적합하고, 현지화, 기능, 그리고 neuronal 단백질의 인신 매매를 연구하는 데 사용되었습니다. IP-아베 분석은 주로 표준 IP와 서양 blotting 시약을 필요로하며, 대상 기판에 대한 항체의 가용성에 의해 제한됩니다. 이 분석을 쉽게 heterologous 셀 문화, 마우스 및 쥐 모두의 다양한 뇌 조직에서 파생 된 기본 neuronal 문화, 심지어는 주요 뇌 조직 자체 transfected palmitoylated 단백질의 정화 및 검출을위한 적응 할 수 있습니다.

IP-아베 분석은 특별히 기판 단백질을 따라 시스테인 잔류의 thiol-palmitoylation를 감지하고, 그림 1에 묘사하는 방식으로 immunoprecipitated neuronal 단백질의 palmitoylation를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 햄 (그림 1)과 함께이 immunoprecipitated neuronal 단백질의 치료는 이후 서쪽 blotting을 사용하여 검색 할 수있는 새로 사용 가능한 thiol 그룹에 비오틴 - BMCC의 특정 결합을 허용하는, palmitate 및 시스테인의 thiol 그룹 사이의 thioester의 연동을 cleaves. 햄 (마이너스 - 햄) 절단의 누락은 비오틴 - BMCC의 설립 및 더하기 햄 샘플의 특정 palmitoyl - biotinylation에 대한 부정적인 제어 같은 기능을 방지하고, 따라서 항상 서쪽에있는 플러스 기호 (+) - 햄 샘플에 인접 해 실행해야합니다 SDS-PAGE (그림 2)에 의해 blotting. 최적화 실험 (그림 2A), palmitoylation에서neuronal 단백질 δ-catenin 2의 신호는 쉽게 병렬 빼기와 더하기 햄 샘플과 비교, HRP와 복합 streptavidin을 사용하여 1 μm의 농도에서 비오틴 - BMCC에 blotting에 의해 감지 할 수 있습니다. δ-catenin에 대한 특정 palmitoylation 신호는 더하기 햄 샘플에 160kD 자사의 예상 크기에 나타납니다. 이 신호의 특이성은 처음 같은 예측 크기로 모두 햄 트리트먼트의 신호 그 결과를 immunoprecipitate하는 데 사용 된 특정 항체와 δ-catenin에 대한 reprobing에 의해 확인되었다. IP-아베 검정 (그림 2A)의 최적화 더하기 햄 샘플에서 쉽게 구별이 마이너스 - 햄 샘플의 서쪽 blotting 프로필에 결과없이 palmitoylation 신호에 최소한의 전시합니다. palmitoylated cysteine​​s 라벨을 사용 비오틴 - BMCC의 농도는주의 최적화되어 있어야하고, 경우 양방향의 수퍼 포화 농도otin-BMCC은 아베 화학 단계 (그림 2B), 과도한 배경 및 비 특정 신호를하는 동안 사용되는이 표시됩니다. 비오틴 - BMCC을 사용하여 palmitoylated neuronal 단백질, α7 nicotinic 아세틸 콜린 수용체의 biotinylation을위한 선형적인 응답 곡선은 이전에 6 결정하고, 5-10 μm의 농도에서 완전 채도 근처에 표시되어 있습니다. 비오틴 - BMCC 최적의 농도가 약간 neuronal 대상 단백질에 따라 이탈 않지만, 5 μm의 초과 농도에서 비오틴 - BMCC 치료 가능성이 보이는 배경으로 서부 얼룩 프로필의 대상 단백질, 그리고 결과를 초 포화 것 및 비 특정 신호. 비오틴 - BMCC 0.5 μm의 농도는 이전에 SNAP-25, huntingtin, AMPA 수용체 subunits GluA1와 GluA2, 그리고 paralemmin 8, 소설에 대한 최적의 농도 결정 등 다른 neuronal 단백질의 palmitoylation를 감지하는 데 사용 된대상 단백질은 우리가 여기에 설명하는 0.5-5 μm의 범위 내에서 시작 시행 선형 패션 오류로 수행 할 수 있습니다. 다른 크기, 그 부적절한 biotinylation가 발생 나타냅니다에서 추가 배경 신호 4 μM 비오틴 - BMCC (그림 2B)로 처리 할 때 δ-catenin palmitoylation의 마이너스와 플러스 - 햄 샘플 간의 결과 streptavidin 서양 얼룩 프로필 비슷한 나타납니다. 히드 록실 아민은 강력한 환원제이다 thioester 연동의 효율적 절단에 추가하여 대상 단백질의 제한 저하의 결과가. 따라서, 아베 화학 최적화는 마이너스와 플러스 - 햄 샘플 (- 3.3 단계 3.2)에 사용 immunoprecipitated 단백질의 양을 정상화을 필요로. 정규화는 실제로 구분할 수 wester에 결과 더하기 대비 마이너스 - 햄 샘플에 고정 대상 단백질의 두 양의 사용을 필요로N으로 δ-catenin (그림 2A, B)에 도시 된 바와 같이, 대상 단백질에 대한 프로필을 blotting. 고정 타겟 단백질의 양이 마이너스와 플러스 - 햄 샘플 사이에 표준화되어 있지 않은 경우 그러나, 더하기 햄 예제에서 대상 단백질에 대한 결과 서부 얼룩 신호가 δ-catenin에 도시 된 바와 같이, 손​​실 될 수있는 경우 동일한 양의 단백질은 두 햄 트리트먼트 (그림 2C)에 사용되었습니다. palmitoylated 단백질을 라벨에 대한 아베 화학의 특이성은 매우 민감하고 최적화가 필요합니다. IP-아베 분석에 발생한 일반적인 함정은 하위 최적 그림 2B와 2C에 표시된 결과, 일반적으로 나이가 시약 및 버퍼로 인해 발생하는 햄 치료, 그리고 잘못된 산도의 독립적 인 대상 단백질의 저하 등이 있습니다. 이 함정을 방지하고 하위 최적의 아베 화학에 대한 해결하기 위해, 시약의 신선함과 집중이 필요표 1에 나열된 버퍼는 항상 검토해야하고, 모든 버퍼의 pH 조정은 항상 실험을 실행하기 전에 확인해야합니다. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 버퍼 </td><td> 작업 농도 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 용해 버퍼 (LB) </td><td> 1% IGEPAL CA-630 50mM 트리스 - HCL pH7.5 150mM NaCl 10 % 글리세롤 : 소주 H 2 O에서 </td><td> N / A </td><td> 4에 실험과 매장하기 전에 준비 ° C </td></tr><tr><td> NEM 솔루션 </td><td> NEM 동결 건조 된 분말 : 100 % EtOH에 </td><td> 2 M </td><td> 바로 사용하기 전에, 신선한 준비합니다. </td></tr><tr><td> 엄격한 버퍼 </td><td> 10 MM 가상 0.1 % SDS : LB에 </td><td> N / A </td><td> 사용하기 전에 바로 준비, 얼음 계속. </td></tr><tr><td> LB의 산도 7.2 </td><td> LB 년 : 정확히 7.2에 PH를 조정 </td><td> N / A </td><td> 바로 사용하기 전에 pH를 조정 산도 측정기를 사용하십시오. </td></tr><tr><td> 햄 버퍼 </td><td> 주식 햄 솔루션 : LB의 pH를 7.2에서 </td><td> 1 M (최종 햄 농도) </td><td> 사용하기 전에 바로 준비합니다. </td></tr><tr><td> LB 산도 6.2 </td><td> LB 년 : 정확히 6.2으로 pH를 조정 </td><td> N / A </td><td> LB의 산도 7.2에 대한 동일 </td></tr><tr><td> 주식 비오틴 - BMCC 솔루션 </td><td> DMSO에서 : 2.1 MG 비오틴 - BMCC 솔루션 </td><td> 8 MM </td><td> 사용하기 전에 바로 준비합니다. </td></tr><tr><td> 비오틴 - BMCC 버퍼 </td><td> LB의 산도 6.2에서 : 비오틴 - BMCC 솔루션을 추가 </td><td> 1-5 μM (최종 비오틴 - BMCC 농도) </td><td> 사용하기 전에 바로 준비합니다. </td></tr><tr><td> 이X SDS 샘플 버퍼, 아니 환원제 </td><td> 5% SDS 5% 글리세롤 125mM 트리스 - HCL 산도 6.8 0.01 % Bromophenol 블루 : 소주 H 2 O에서 </td><td> N / A </td><td> 사용 할 때까지 -20 ° C에서 실험하고, 저장하기 전에 준비합니다. 사용하기 전에 5 밀리미터 DTT를 보완. </td></tr></tbody></table> 표 1. IP-아베 분석에 필요한 버퍼를하고 시약. 용해 버퍼의 대부분은 아베 화학의 성공을 보장하기 위해 실험, 그러나 산도을 선택해야하며 산도 측정기와 함께 사용하기 전에 바로 조정을 시작하기 전에 준비 할 수 있습니다. 재고 솔루션의 대부분은 바로 사용하기 전에 모든 실험을 위해 새로운 준비를해야합니다. 버퍼의 대부분은 생화학을위한 시설을 갖추고 대부분의 실험실에 공통적으로 시약을 필요로하고, 공급 업체 정보와 전문 시약은 시약 및 장비의 표에 나열되어 있습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> 1 그림. neuronal 단백질의 palmitoylation을 정화하고 검색 할 수있는 Immunoprecipitation와 아실-비오틴 거래소 (IP-아베) 분석의 개략적. 양식 hippocampal 뉴런이 lysed 있으며, (1) 대상 단백질은 다음 대상 특정 항체를 사용하여 정제하고, 세 파로스에 고정되어 있습니다 구슬은 정화 대상 단백질 (2)가 돌이킬 바인딩하고 수정되지 않은 cysteines (C) 함께 무료 thiol (-SH) 그룹을 차단하는 N-ethylmaliemide (NEM)로 치료 단백질 G 또는 A.으로 코팅. 대상 단백질 그 다음 (3) palmitoylated cysteines, 무료 palmitoylated thiol 그룹 (-SH)의 unmasking에서 thioester 채권의 특정 절단의 결과로, 히드 록실 아민 (햄)의 치료를 받게됩니다. 다음 대상 단백질 (4) treate입니다palmitoylated 시스테인의 특정 biotinylation의 결과 thiol 반응 비오틴 분자, 비오틴-BMCC과 D. 마지막으로, (5) biotinylated 대상 단백질이 용출하고 항체와 구슬에서 제거됩니다. 비오틴 태그가 자사의 palmitoylated 시스테인 (들)과 대상 단백질은 이제 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 및 정화 neuronal 단백질의 palmitoylation에 감지 할 수 streptavidin과 blotting 서쪽에 적합합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> 그림 2. IP-아베 분석을 사용하여 neuronal 단백질 δ-catenin의 palmitoylation의 검출은. 기본 쥐 hippocampal 뉴런은 사전으로 성장했다viously, 14DIV에서 성숙까지 130 세포 / mm 2의 밀도에, 5 설명 후 lysed되었고, 최근에 확인 된 palmitoylated neuronal 기판, δ-catenin 2 palmitoylation를 검색 할 IP-아베 검정을 받게. 정화는 (IPS) δ-catenin (타겟 단백질)의를 immunoprecipitates 샘플 당 δ-catenin 항체 5 μg (BD의 도입 실험실)을 사용하여 격리 된 후 병렬 빼기와 더하기 히드 록실 아민 (햄)에 SDS-PAGE를 받게되었습니다 샘플. Palmitoylation는 서부는 streptavidin-HRP (palmitoylation)와 (WB) blotting에 의해 감지 된, 그리고 막은 제거 및 δ-catenin에 대한 reprobe WB를 받게되었습니다. IP 샘플 thiol-palmitoylated 단백질을 검출하기위한 아베 화학의 특이성을 설명 palmitoylated δ-catenin (화살촉) 1 μM 비오틴 - BMCC로 치료에 대한 (A) 최적화 대표 IP-아베 결과입니다. (B) A 하위 최적의 repre모두 마이너스와 플러스 - 햄 샘플 (화살표)에 비 특정 신호와 배경의 결과로 4 μM 비오틴 - BMCC의 초과 농도가 사용 된 δ-catenin, 대한 sentative IP-아베 결과입니다. (C) 비오틴 - BMCC의 과도한 4 μM 농도가 사용 된 δ-catenin, 그리고 더하기 햄 IP 샘플에 사용되는 단백질의 양에 대한 또 다른 하위 최적의 대표 IP-아베 WB는 햄 - 매개을위한 표준화되지 않았습니다 δ-catenin에 대한 reprobe WB의 손실 신호의 결과로 단백질 저하는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

단백질 palmitate의 치료뿐만 아니라이 세포 내 단백질 인신 매매의 중요한 조절기입니다. 이것은 많은 시냅스 단백질이 palmitoylated 아르 뉴런에 특별한 관심입니다. 우리는 여러 세포 유형과 조직에 적용 할 수 있습니다 교양 뉴런에 palmitoylated 단백질을 감지하는 간단한 생화학 방법을 사용합니다.

Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

이 절차의 전반적인 목표는 간단하고 적응 가능한 생화학적 분석을 사용하여 배양된 뉴런에서 poid 관련 뉴런 단백질을 분리하고 검출하는 것입니다. 이는 에틸 또는 NEM이 있는 상태에서 표적 단백질을 추출하고 고정시켜 모든 유리 티올 그룹의 차단을 보장함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 고정된 표적 단백질을 하이드록실 평균 또는 햄으로 처리하여 손바닥 시스테인 잔기와 팔미테이트 분자 사이의 티오에스테르 연결을 절단하는 것입니다.이렇게 하면 Palmated cystine 스타일 그룹이 해제되고 세 번째 단계에서 라벨링에 사용할 수 있습니다. 고정된 표적 단백질은 비오틴으로 태그된 비오틴 B-M-C-C-A 파일 특이적 분자와 함께 배양되며, 이 비오틴은 원래 pyl이었던 Thile 그룹입니다. 마지막 단계는 Strp Aden에 대한 SDS 페이지 및 웨스턴 블로팅을 통해 타겟 단백질의 pation 수준을 검출하는 것입니다.궁극적으로, IP A BE 분석법은 신경 세포 표적 단백질에 가역적으로 부착된 팔미틴 지질의 수준을 보여주는 데 사용되며 표적 단백질의 미묘한 변화도 감지할 수 있습니다. Pation 수준. 단백질 검출, palmate 형질과 함께 대사 라벨링을 사용한 손바닥 절단과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 아실 비오틴 교환 분석이 더 민감하고 시간이 덜 걸린다는 것입니다.A BE 분석은 또한 손바닥 절단에 대한 보다 정량적인 추정을 가능하게 하며 손바닥 절단 수준의 작은 변화를 감지하는 데 가장 적합합니다. 이 방법은 손바닥 단백질과 배양된 해마 뉴런을 식별하는 데 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 뇌 영역, 이종 세포주 및 1차 조직의 1차 신경 배양과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 배양된 1차 해마 뉴런에서 표적 단백질 추출을 시작하려면 이 비디오와 함께 제공되는 서면 절차에 설명된 대로 용해 완충액과 NEM 용액을 준비합니다.다음으로, 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브에 0.5 밀리리터의 2 몰 NEM 용액을 첨가하여 용해 완충액과 NEM 용액을 결합합니다. 상단에 20ml의 용해 완충액을 추가합니다. 항상 NEM 에탄올 용액을 먼저 넣고 용해 완충액을 두 번째로 첨가하여 섭씨 4도의 냉장실에서 두 가지를 적절하게 혼합하고 혼합물을 흔들 플랫폼에 빠르게 놓고 5분 동안 완전히 혼합되도록 합니다.배양된 1차 쥐 해마 뉴런을 인큐베이터에서 제거하고 배양 방법에 대한 지침을 제공합니다. 뉴런은 배양된 뉴런을 얼음 위에 올려놓은 후 텍스트에서 찾을 수 있습니다. 셀룰러 매체를 부드럽게 제거합니다.차가운 인산염 완충 식염수로 뉴런을 두 번 부드럽게 씻습니다. 다음으로, 300마이크로리터의 용해 완충액과 50밀리몰 NEM을 해마 뉴런의 첫 번째 웰에 추가하고 일회용 세포 리프터를 사용하여 세포를 긁어냅니다. 세포 용해물을 수집한 다음 용해물을 해당 그룹의 다음 웰로 배출합니다.세포 리프터를 사용하여 두 번째 웰 내의 세포를 긁어냅니다. 필요한 경우 세 번째 우물을 사용하여 수집하고 반복합니다. 용해물을 더욱 농축하려면 세포 용해물을 예냉각된 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 모으십시오.첫 번째 웰에 100마이크로리터의 용해 완충액과 50밀리몰 NEM을 추가하고 용접 스크래핑 과정을 반복하여 남아 있는 세포 용해물을 수집합니다. 전체 세포 용해물을 26 및 1/2 게이지 주사기에 5-6회 통과시켜 기계적 용해를 돕습니다. 용액에 거품이 불어오지 않도록 주의하십시오.원심분리 후 섭씨 4도에서 최소 30분 동안 세포 용해물을 돌연변이시킵니다. 세척된 세포 용해물을 얼음 위의 새로운 사전 냉각 1.5ml 튜브에 수집합니다. 모든 세포 그룹에 대해 입증된 수확 프로토콜을 반복합니다.BCA 분석을 사용하여 모든 용해물 샘플에서 단백질 농도를 측정합니다. 제조업체의 지침에 따라. 세포 그룹에서 모든 용해물 샘플의 부피를 권장되는 최소 500마이크로그램으로 정확히 동일한 단백질을 갖도록 정규화합니다.모든 시료를 용해 버퍼와 50 millimolar NEM으로 총 부피 500 마이크로리터로 채웁니다. 다음으로, 각 용해물 샘플에 표적 단백질에 대한 1-5마이크로그램의 1차 항체를 추가합니다. 항체 용해물 혼합 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 돌연변이시킨 후 표적 단백질을 침전시키고 고정시킵니다.서면 프로토콜에 설명된 대로 단백질 A 또는 단백질 G 코팅된 SRO 속도의 50% 슬러리를 준비합니다. 마지막 단계로, 각 항체 용해물 샘플에 동일한 부피의 50%슬러리를 첨가하고 섭씨 4도에서 최소 1시간 동안 돌연변이를 일으킵니다. ael을 수행할 때 모든 완충액과 시약의 적절한 pH와 온도, 그리고 신선도를 교환하는 것이 중요합니다.성공적인 실험을 보장하기 위해. 서로 다른 phs의 용해 완충액이 있는 여러 튜브를 준비하여 햄 분열을 시작합니다. pH는 이러한 단계에서 매우 중요하며 항상 조정해야 합니다.샘플당 pH 측정기를 사용하여 2ml의 lysis buffer pH 7.2와 0.5ml의 lysis buffer를 lysis buffer에서 준비합니다. 또한 샘플당 0.5ml의 용해 완충액과 10mmolar NEM을 준비합니다. PMSF 및 프로테아제 억제제 정제를 모든 용해 완충액에 추가합니다.하이드록실 평균 또는 햄은 손바닥 시스테인과 팔미테이트 지방산 사이의 티오에스테르 결합을 절단하는 데 사용됩니다. 이는 손바닥 모양의 시스테인 스타일 그룹을 확보하고 비오틴으로 표지할 수 있도록 하는 데 필수적입니다. 따라서 햄 분열의 생략은 유용한 음성 대조군으로 작용할 수 있습니다.세포 용해물로 항체를 배양한 후 각 샘플에 대해 마이너스 햄 대조군으로 표시된 얼음에 추가로 1.5mL 튜브를 준비합니다. 그런 다음 구슬을 사용하여 얼음 위의 튜브와 함께 섭씨 4도에서 1분 동안 0.5배 G로 모든 샘플 구슬을 부드럽게 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 600마이크로리터의 용해 완충액과 10밀리몰 NEM에 비드를 현탁시킵니다.Resus를 현탁시킨 후 모든 샘플 비드를 즉시 200마이크로리터의 샘플, 용해물 비드 슬러리를 수집하고 얼음 위의 해당 샘플의 마이너스 햄 튜브로 배출하여 각 샘플의 용해물 비드 슬러리 400마이크로리터를 플러스 햄 샘플용 튜브에 남겨둡니다. 이것은 햄 처리로 인한 표적 단백질의 제한된 분해를 설명하기 위한 것입니다. 비드의 1/3은 마이너스 햄 트리트먼트에 사용되고 나머지 2/3는 플러스 햄 트리트먼트에 사용됩니다.마이너스 햄 샘플에 300마이크로리터의 용해 완충액과 10밀리몰 NEM을 추가합니다. 각 샘플에 총 500마이크로리터를 더한 햄 샘플에 100마이크로리터를 추가로 피펫팅합니다. 얼음에서 튜브를 10분 동안 배양한 다음 서면 절차에 설명된 대로 마이너스 햄 및 플러스 햄 샘플을 세척한 다음 모든 마이너스 햄 샘플에 대해 lysis buffer pH 7.2 샘플당 0.5ml로 샘플을 세척합니다.모든 플러스 햄 샘플에 햄 버퍼 샘플당 0.5밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 모든 샘플을 돌연변이시킵니다. 햄 치료 후 1시간을 초과하지 마십시오.서면 절차에서 논의된 바와 같이 비오틴 BMCC 라벨링에 의한 아실 비오틴 교환을 수행합니다. 비오틴 BMCC 라벨링이 완료되면 텍스트에 설명된 대로 샘플을 부드럽게 세척합니다. 최종 세척의 상층액을 제거하고 펠릿화된 비드를 튜브 바닥에 완충액이 남아 있는 슬러리에 남겨둡니다.작은 직경의 팁이 있는 피펫을 슬러리를 통해 튜브의 맨 아래에 담그고 남아 있는 버퍼를 빠르게 수집합니다. 구슬을 집지 않도록 주의하세요. 각 샘플에 40-50마이크로리터의 2개의 샘플 버퍼와 5밀리몰 DTT를 추가합니다.필요한 경우. 비드를 소용돌이치게 하여 시료 완충액과 완전히 혼합하고 즉시 고속으로 원심분리하여 시료 완충액에 잠긴 펠릿의 모든 비드를 수집합니다. 샘플을 끓이고 다시 원심분리한 후, 각 샘플의 상등액에서 용출된 단백질의 전체 부피를 웨스턴 블로팅에 적합한 폴리 아크릴아미드 겔 내의 단일 레인에 추가합니다.SDS 페이지를 사용하여 단일 샘플에 대한 마이너스 햄 제어 elu 및 플러스 햄 elu가 서로 바로 인접하게 실행되도록 모든 샘플을 구성합니다. SDS 페이지 다음 SDS 페이지를 A-P-V-D-F 또는 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮기는 동안 서면 절차에 설명된 대로 세척 및 차단으로 웨스턴 블로팅을 시작하고, TBST와 0.3% BSA의 항체 용액을 준비하고, 증류수에 밀리리터당 1밀리그램으로 재구성된 스트렙타비딘 HRP 항체를 추가합니다. TBST에서 10분 동안 멤브레인을 한 번 세척합니다.그런 다음 STREPTAVIDIN 항체 용액에 담긴 멤브레인을 흔들 플랫폼에서 실온에서 1시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 흔들리는 플랫폼에서 10 분 동안 TBST에서 멤브레인을 세 번 씻습니다. pation 신호를 검출하려면 chemiluminescent substrate kit를 사용하여 HRP 발광을 노출시켜 pation 수준을 면역 침전된 관심 단백질의 양으로 정규화합니다.Western blott 스트리핑 버퍼를 사용하여 실온의 흔들 플랫폼에서 5-10분 동안 멤브레인을 벗겨냅니다. 면역침전에 원래 사용되었던 관심 단백질에 대해 1차 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅(western blotting) 단계를 반복합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 단백질의 pation을 정량화하고 pation 수준을 immuno 침전된 단백질의 양으로 정규화합니다.I-P-A-B-E 분석은 기질 단백질을 따라 시스틴 잔기의 틸 pation을 특이적으로 검출하고 면역 침전된 신경 세포 단백질의 pation을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 면역 침전된 뉴런 단백질을 햄 절단으로 처리하면 팔미테이트와 시스티나 탈 그룹 사이의 티오에스테르 연결을 통해 비오틴 BMCC를 새로 사용 가능한 파일 그룹에 특이적으로 통합할 수 있으며, 이는 이후에 웨스턴 블로팅을 사용하여 검출할 수 있습니다. 햄 분열의 생략은 비오틴 BMCC의 혼입을 방지하고 플러스 햄 샘플의 특정 poid 비오틴 의기양양에 대한 음성 대조군으로 기능합니다.따라서 마이너스 햄 컨트롤은 항상 SDS 페이지에 의한 웨스턴 블로팅을 위한 플러스 햄 샘플에 인접하여 실행되어야 합니다. 최적화된 실험에서 신경 단백질 델타 카테닌의 pation 신호는 병렬 마이너스 및 플러스 햄 샘플에 대해 HRP와 접합된 스트렙타비딘을 사용하여 1마이크로몰 농도에서 비오틴 BMCC를 블로팅하여 쉽게 감지할 수 있습니다. 델타 Kain에 대한 특정 pation 신호는 플러스 핸드 샘플에서만 예측된 크기인 160킬로달톤으로 나타납니다.이 신호의 특이성은 처음에 면역 침전에 사용된 특정 항체와 함께 델타 카테닌을 다시 조사하여 확인되었으며, 그 결과 동일한 예측 크기에서 두 햄 치료에서 신호가 발생했습니다. I-P-A-B-E 분석의 최적화는 플러스 햄 샘플과 쉽게 구별할 수 있고 pation 신호가 최소화되거나 전혀 없는 마이너스 햄 샘플의 웨스턴 블로팅 프로파일을 생성합니다. PALMATED CYSTINES를 표지하는 데 사용되는 비오틴 BMCC의 농도는 신중한 최적화가 필요하며, A BE 화학 단계에서 비오틴 BMCC의 과포화 농도를 사용하는 경우 과도한 백그라운드 및 비특이적 신호가 보입니다.델타 캐틴 및 야자 절단을 위한 마이너스 및 플러스 햄 샘플 중 웨스턴 블롭 프로파일에서 결과적으로 벗겨진 avid는 서로 다른 크기에서 추가 배경 신호와 함께 4개의 마이크로몰 비오틴 BMCC로 처리했을 때 유사하게 나타나며, 이는 부적절한 비오틴이 발생했음을 나타냅니다. 하이드록시 라민은 표적 단백질의 분해를 제한하는 강력한 환원제이기 때문에 마이너스 및 플러스 햄 샘플에 사용되는 면역 침전 단백질의 양을 정규화할 필요가 있습니다. 정규화는 마이너스 햄 샘플에 비해 플러스에서 고정된 타겟 단백질의 두 배를 사용해야 하며, 이로 인해 델타 카테닌에 대해 표시된 것처럼 타겟 단백질에 대해 구별할 수 없는 웨스턴 블로팅 프로파일이 생성됩니다.그러나, 고정된 표적 단백질의 양이 마이너스 햄 샘플과 플러스 햄 샘플 사이에서 정규화되지 않는 경우, 플러스 햄 샘플의 타겟 단백질에 대한 결과 웨스턴 블롯 신호는 두 햄 처리에서 동일한 양의 단백질이 사용되었을 때 델타 카테닌에 대해 표시된 것처럼 손실될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배양된 해마 뉴런에서 선택한 뉴런 단백질을 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. BE 화학을 사용하여 최소한의 시간 내에 손바닥 절단을 위한 기질인지 검출하고 다른 세포주 및 조직에 사용하기 위해 이 프로토콜을 조정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

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