Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지

이 절차의 전반적인 목표는 간단하고 적응 가능한 생화학적 분석을 사용하여 배양된 뉴런에서 poid 관련 뉴런 단백질을 분리하고 검출하는 것입니다. 이는 에틸 또는 NEM이 있는 상태에서 표적 단백질을 추출하고 고정시켜 모든 유리 티올 그룹의 차단을 보장함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 고정된 표적 단백질을 하이드록실 평균 또는 햄으로 처리하여 손바닥 시스테인 잔기와 팔미테이트 분자 사이의 티오에스테르 연결을 절단하는 것입니다.

이렇게 하면 Palmated cystine 스타일 그룹이 해제되고 세 번째 단계에서 라벨링에 사용할 수 있습니다. 고정된 표적 단백질은 비오틴으로 태그된 비오틴 B-M-C-C-A 파일 특이적 분자와 함께 배양되며, 이 비오틴은 원래 pyl이었던 Thile 그룹입니다. 마지막 단계는 Strp Aden에 대한 SDS 페이지 및 웨스턴 블로팅을 통해 타겟 단백질의 pation 수준을 검출하는 것입니다.

궁극적으로, IP A BE 분석법은 신경 세포 표적 단백질에 가역적으로 부착된 팔미틴 지질의 수준을 보여주는 데 사용되며 표적 단백질의 미묘한 변화도 감지할 수 있습니다. Pation 수준. 단백질 검출, palmate 형질과 함께 대사 라벨링을 사용한 손바닥 절단과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 아실 비오틴 교환 분석이 더 민감하고 시간이 덜 걸린다는 것입니다.

A BE 분석은 또한 손바닥 절단에 대한 보다 정량적인 추정을 가능하게 하며 손바닥 절단 수준의 작은 변화를 감지하는 데 가장 적합합니다. 이 방법은 손바닥 단백질과 배양된 해마 뉴런을 식별하는 데 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 뇌 영역, 이종 세포주 및 1차 조직의 1차 신경 배양과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 배양된 1차 해마 뉴런에서 표적 단백질 추출을 시작하려면 이 비디오와 함께 제공되는 서면 절차에 설명된 대로 용해 완충액과 NEM 용액을 준비합니다.

다음으로, 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브에 0.5 밀리리터의 2 몰 NEM 용액을 첨가하여 용해 완충액과 NEM 용액을 결합합니다. 상단에 20ml의 용해 완충액을 추가합니다. 항상 NEM 에탄올 용액을 먼저 넣고 용해 완충액을 두 번째로 첨가하여 섭씨 4도의 냉장실에서 두 가지를 적절하게 혼합하고 혼합물을 흔들 플랫폼에 빠르게 놓고 5분 동안 완전히 혼합되도록 합니다.

배양된 1차 쥐 해마 뉴런을 인큐베이터에서 제거하고 배양 방법에 대한 지침을 제공합니다. 뉴런은 배양된 뉴런을 얼음 위에 올려놓은 후 텍스트에서 찾을 수 있습니다. 셀룰러 매체를 부드럽게 제거합니다.

차가운 인산염 완충 식염수로 뉴런을 두 번 부드럽게 씻습니다. 다음으로, 300마이크로리터의 용해 완충액과 50밀리몰 NEM을 해마 뉴런의 첫 번째 웰에 추가하고 일회용 세포 리프터를 사용하여 세포를 긁어냅니다. 세포 용해물을 수집한 다음 용해물을 해당 그룹의 다음 웰로 배출합니다.

세포 리프터를 사용하여 두 번째 웰 내의 세포를 긁어냅니다. 필요한 경우 세 번째 우물을 사용하여 수집하고 반복합니다. 용해물을 더욱 농축하려면 세포 용해물을 예냉각된 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 모으십시오.

첫 번째 웰에 100마이크로리터의 용해 완충액과 50밀리몰 NEM을 추가하고 용접 스크래핑 과정을 반복하여 남아 있는 세포 용해물을 수집합니다. 전체 세포 용해물을 26 및 1/2 게이지 주사기에 5-6회 통과시켜 기계적 용해를 돕습니다. 용액에 거품이 불어오지 않도록 주의하십시오.

원심분리 후 섭씨 4도에서 최소 30분 동안 세포 용해물을 돌연변이시킵니다. 세척된 세포 용해물을 얼음 위의 새로운 사전 냉각 1.5ml 튜브에 수집합니다. 모든 세포 그룹에 대해 입증된 수확 프로토콜을 반복합니다.

BCA 분석을 사용하여 모든 용해물 샘플에서 단백질 농도를 측정합니다. 제조업체의 지침에 따라. 세포 그룹에서 모든 용해물 샘플의 부피를 권장되는 최소 500마이크로그램으로 정확히 동일한 단백질을 갖도록 정규화합니다.

모든 시료를 용해 버퍼와 50 millimolar NEM으로 총 부피 500 마이크로리터로 채웁니다. 다음으로, 각 용해물 샘플에 표적 단백질에 대한 1-5마이크로그램의 1차 항체를 추가합니다. 항체 용해물 혼합 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 돌연변이시킨 후 표적 단백질을 침전시키고 고정시킵니다.

서면 프로토콜에 설명된 대로 단백질 A 또는 단백질 G 코팅된 SRO 속도의 50% 슬러리를 준비합니다. 마지막 단계로, 각 항체 용해물 샘플에 동일한 부피의 50%슬러리를 첨가하고 섭씨 4도에서 최소 1시간 동안 돌연변이를 일으킵니다. ael을 수행할 때 모든 완충액과 시약의 적절한 pH와 온도, 그리고 신선도를 교환하는 것이 중요합니다.

성공적인 실험을 보장하기 위해. 서로 다른 phs의 용해 완충액이 있는 여러 튜브를 준비하여 햄 분열을 시작합니다. pH는 이러한 단계에서 매우 중요하며 항상 조정해야 합니다.

샘플당 pH 측정기를 사용하여 2ml의 lysis buffer pH 7.2와 0.5ml의 lysis buffer를 lysis buffer에서 준비합니다. 또한 샘플당 0.5ml의 용해 완충액과 10mmolar NEM을 준비합니다. PMSF 및 프로테아제 억제제 정제를 모든 용해 완충액에 추가합니다.

하이드록실 평균 또는 햄은 손바닥 시스테인과 팔미테이트 지방산 사이의 티오에스테르 결합을 절단하는 데 사용됩니다. 이는 손바닥 모양의 시스테인 스타일 그룹을 확보하고 비오틴으로 표지할 수 있도록 하는 데 필수적입니다. 따라서 햄 분열의 생략은 유용한 음성 대조군으로 작용할 수 있습니다.

세포 용해물로 항체를 배양한 후 각 샘플에 대해 마이너스 햄 대조군으로 표시된 얼음에 추가로 1.5mL 튜브를 준비합니다. 그런 다음 구슬을 사용하여 얼음 위의 튜브와 함께 섭씨 4도에서 1분 동안 0.5배 G로 모든 샘플 구슬을 부드럽게 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 600마이크로리터의 용해 완충액과 10밀리몰 NEM에 비드를 현탁시킵니다.

Resus를 현탁시킨 후 모든 샘플 비드를 즉시 200마이크로리터의 샘플, 용해물 비드 슬러리를 수집하고 얼음 위의 해당 샘플의 마이너스 햄 튜브로 배출하여 각 샘플의 용해물 비드 슬러리 400마이크로리터를 플러스 햄 샘플용 튜브에 남겨둡니다. 이것은 햄 처리로 인한 표적 단백질의 제한된 분해를 설명하기 위한 것입니다. 비드의 1/3은 마이너스 햄 트리트먼트에 사용되고 나머지 2/3는 플러스 햄 트리트먼트에 사용됩니다.

마이너스 햄 샘플에 300마이크로리터의 용해 완충액과 10밀리몰 NEM을 추가합니다. 각 샘플에 총 500마이크로리터를 더한 햄 샘플에 100마이크로리터를 추가로 피펫팅합니다. 얼음에서 튜브를 10분 동안 배양한 다음 서면 절차에 설명된 대로 마이너스 햄 및 플러스 햄 샘플을 세척한 다음 모든 마이너스 햄 샘플에 대해 lysis buffer pH 7.2 샘플당 0.5ml로 샘플을 세척합니다.

모든 플러스 햄 샘플에 햄 버퍼 샘플당 0.5밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 모든 샘플을 돌연변이시킵니다. 햄 치료 후 1시간을 초과하지 마십시오.

서면 절차에서 논의된 바와 같이 비오틴 BMCC 라벨링에 의한 아실 비오틴 교환을 수행합니다. 비오틴 BMCC 라벨링이 완료되면 텍스트에 설명된 대로 샘플을 부드럽게 세척합니다. 최종 세척의 상층액을 제거하고 펠릿화된 비드를 튜브 바닥에 완충액이 남아 있는 슬러리에 남겨둡니다.

작은 직경의 팁이 있는 피펫을 슬러리를 통해 튜브의 맨 아래에 담그고 남아 있는 버퍼를 빠르게 수집합니다. 구슬을 집지 않도록 주의하세요. 각 샘플에 40-50마이크로리터의 2개의 샘플 버퍼와 5밀리몰 DTT를 추가합니다.

필요한 경우. 비드를 소용돌이치게 하여 시료 완충액과 완전히 혼합하고 즉시 고속으로 원심분리하여 시료 완충액에 잠긴 펠릿의 모든 비드를 수집합니다. 샘플을 끓이고 다시 원심분리한 후, 각 샘플의 상등액에서 용출된 단백질의 전체 부피를 웨스턴 블로팅에 적합한 폴리 아크릴아미드 겔 내의 단일 레인에 추가합니다.

SDS 페이지를 사용하여 단일 샘플에 대한 마이너스 햄 제어 elu 및 플러스 햄 elu가 서로 바로 인접하게 실행되도록 모든 샘플을 구성합니다. SDS 페이지 다음 SDS 페이지를 A-P-V-D-F 또는 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮기는 동안 서면 절차에 설명된 대로 세척 및 차단으로 웨스턴 블로팅을 시작하고, TBST와 0.3% BSA의 항체 용액을 준비하고, 증류수에 밀리리터당 1밀리그램으로 재구성된 스트렙타비딘 HRP 항체를 추가합니다. TBST에서 10분 동안 멤브레인을 한 번 세척합니다.

그런 다음 STREPTAVIDIN 항체 용액에 담긴 멤브레인을 흔들 플랫폼에서 실온에서 1시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 흔들리는 플랫폼에서 10 분 동안 TBST에서 멤브레인을 세 번 씻습니다. pation 신호를 검출하려면 chemiluminescent substrate kit를 사용하여 HRP 발광을 노출시켜 pation 수준을 면역 침전된 관심 단백질의 양으로 정규화합니다.

Western blott 스트리핑 버퍼를 사용하여 실온의 흔들 플랫폼에서 5-10분 동안 멤브레인을 벗겨냅니다. 면역침전에 원래 사용되었던 관심 단백질에 대해 1차 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅(western blotting) 단계를 반복합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 단백질의 pation을 정량화하고 pation 수준을 immuno 침전된 단백질의 양으로 정규화합니다.

I-P-A-B-E 분석은 기질 단백질을 따라 시스틴 잔기의 틸 pation을 특이적으로 검출하고 면역 침전된 신경 세포 단백질의 pation을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 면역 침전된 뉴런 단백질을 햄 절단으로 처리하면 팔미테이트와 시스티나 탈 그룹 사이의 티오에스테르 연결을 통해 비오틴 BMCC를 새로 사용 가능한 파일 그룹에 특이적으로 통합할 수 있으며, 이는 이후에 웨스턴 블로팅을 사용하여 검출할 수 있습니다. 햄 분열의 생략은 비오틴 BMCC의 혼입을 방지하고 플러스 햄 샘플의 특정 poid 비오틴 의기양양에 대한 음성 대조군으로 기능합니다.

따라서 마이너스 햄 컨트롤은 항상 SDS 페이지에 의한 웨스턴 블로팅을 위한 플러스 햄 샘플에 인접하여 실행되어야 합니다. 최적화된 실험에서 신경 단백질 델타 카테닌의 pation 신호는 병렬 마이너스 및 플러스 햄 샘플에 대해 HRP와 접합된 스트렙타비딘을 사용하여 1마이크로몰 농도에서 비오틴 BMCC를 블로팅하여 쉽게 감지할 수 있습니다. 델타 Kain에 대한 특정 pation 신호는 플러스 핸드 샘플에서만 예측된 크기인 160킬로달톤으로 나타납니다.

이 신호의 특이성은 처음에 면역 침전에 사용된 특정 항체와 함께 델타 카테닌을 다시 조사하여 확인되었으며, 그 결과 동일한 예측 크기에서 두 햄 치료에서 신호가 발생했습니다. I-P-A-B-E 분석의 최적화는 플러스 햄 샘플과 쉽게 구별할 수 있고 pation 신호가 최소화되거나 전혀 없는 마이너스 햄 샘플의 웨스턴 블로팅 프로파일을 생성합니다. PALMATED CYSTINES를 표지하는 데 사용되는 비오틴 BMCC의 농도는 신중한 최적화가 필요하며, A BE 화학 단계에서 비오틴 BMCC의 과포화 농도를 사용하는 경우 과도한 백그라운드 및 비특이적 신호가 보입니다.

델타 캐틴 및 야자 절단을 위한 마이너스 및 플러스 햄 샘플 중 웨스턴 블롭 프로파일에서 결과적으로 벗겨진 avid는 서로 다른 크기에서 추가 배경 신호와 함께 4개의 마이크로몰 비오틴 BMCC로 처리했을 때 유사하게 나타나며, 이는 부적절한 비오틴이 발생했음을 나타냅니다. 하이드록시 라민은 표적 단백질의 분해를 제한하는 강력한 환원제이기 때문에 마이너스 및 플러스 햄 샘플에 사용되는 면역 침전 단백질의 양을 정규화할 필요가 있습니다. 정규화는 마이너스 햄 샘플에 비해 플러스에서 고정된 타겟 단백질의 두 배를 사용해야 하며, 이로 인해 델타 카테닌에 대해 표시된 것처럼 타겟 단백질에 대해 구별할 수 없는 웨스턴 블로팅 프로파일이 생성됩니다.

그러나, 고정된 표적 단백질의 양이 마이너스 햄 샘플과 플러스 햄 샘플 사이에서 정규화되지 않는 경우, 플러스 햄 샘플의 타겟 단백질에 대한 결과 웨스턴 블롯 신호는 두 햄 처리에서 동일한 양의 단백질이 사용되었을 때 델타 카테닌에 대해 표시된 것처럼 손실될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배양된 해마 뉴런에서 선택한 뉴런 단백질을 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. BE 화학을 사용하여 최소한의 시간 내에 손바닥 절단을 위한 기질인지 검출하고 다른 세포주 및 조직에 사용하기 위해 이 프로토콜을 조정할 수 있습니다.