고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

이 절차의 전반적인 목표는 치료된 전립선 종양 세포의 정량적 이미지를 얻어 서로 다른 시점에서 자가포식의 정도와 정도를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 아르기닌, 다제 또는 기타 실험용 시약으로 세포를 처리하여 자가포식 및/또는 세포 사멸을 유도함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 살아있는 세포를 이미징할지 아니면 고정 세포를 이미징할지 결정하고 그에 따라 샘플을 준비하는 것입니다.

다음으로, 광시야, 디콘볼루션 또는 구조화 조명 형광 현미경을 사용하여 살아 있거나 고정된 세포의 3D 형광 이미지를 얻습니다. 마지막 단계는 자가포식솜 크기 분포 및 다른 세포 내 구조와의 공동 국소화에 대한 통계 데이터를 수집하는 것입니다. 디지털 3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하는 이 접근 방식은 아르기닌 다아제에 의한 자동 파지 유도가 전립선 종양 세포 사멸을 유발할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 세포가 세포사멸 및 괴사와 관련된 변화와 형태학적으로 구별되는 구조적 변화를 보인다는 결과를 얻을

현재 존재하는 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 정량적 3D 이미징이 살아있는 세포 내부에서 발생하는 특정 분자 이벤트가 언제 어디서 발생하는지 보여준 다음 3차원 형식으로 제시할 수 있다는 것입니다.녹색 형광 단백질을 발현하는 인간 전립선암 세포를 성장시키기 시작하려면 35mm 폴리 드 리신 코팅 유리 바닥 배양 접시에 3개의 경쇄를 결합해야 합니다. 빠른 증식을 촉진할 수 있는 충분한 밀도에서 세포가 이미징 시점까지 과도하게 성장하고 뭉쳐질 정도는 아닙니다. 선별된 세포 샘플을 PBS의 아르기닌 다아제 또는 DI로 처리하여 유리 아르기닌 세포를 고갈시키고 암세포의 대사 스트레스를 유발하기 약 1시간 전에 1.5마이크로리터의 Lyo tracker red를 10%FPS 및 1%의 항생제를 함유한 20ml의 RPMI로 희석합니다. 모든 매체를 섭씨 37도로 가온 후 처리된 선택한 샘플에 대해 DI가 있는 용액을 준비합니다.

각 배양 접시에 적절한 배지를 추가하고 이미징 약 30분 전에 섭씨 37도에서 15-45분 동안 LYO Tracker red를 함유한 RPMI로 세포를 배양합니다. 기상 관측소 환경 인클로저를 켜고 섭씨 37도로 평형을 이루고 5% 이산화탄소로 셀을 세척하고 미디어를 10% FBS 및 1% 항생제만 함유된 표준 RPMI로 교체합니다. 표시된 대로 샘플에 DI를 추가합니다.

35mm 커버 유리 바닥 배양 접시를 맞춤형 어댑터에 장착합니다. 6개의 DX 배율, 1.42 개구수 대물 렌즈에 이멀젼 오일을 사용하고 장착된 배양 접시를 현미경 스테이지에 배치합니다. 이 비디오에서는 Delta vision personal IDV applied position, deconvolution microscope 및 Associated Soft Works 애플리케이션 제품군을 사용하여 3D 현미경을 시연합니다.

시작하려면 수집 워크스테이션 및 기기 컨트롤러를 포함한 현미경 시스템을 켭니다. resolve 3D 컴퓨터 제어 응용 프로그램을 열어 현미경 스테이지를 초기화하고 크세논 광원을 켭니다. 광원이 예열되고 안정적인 상태에 도달할 때까지 10분 동안 기다립니다.

6개의 DX 배율, 1.42 개구수 대물 렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 추가하고 명시야 또는 외부 조명과 거친 초점을 사용하여 대물 렌즈 위에 덮개 슬립이 앞면이 아래로 향하게 하여 슬라이드 표본을 중앙에 놓습니다. 조정 손잡이는 침지 오일의 비트가 거꾸로 된 커버 유리에 닿을 때까지 대물 렌즈를 천천히 올립니다. 이 시점부터 셀 레이어는 미세 초점 조정 노브를 몇 바퀴 돌리면 초점이 맞춰져야 합니다.

슬라이드에서 고정 샘플로 작업할 때는 기포가 있는 영역 내부 또는 근처의 셀을 피하는 것이 좋습니다. 언제 view라이브 샘플과 함께amp유리 바닥 접시에 대물 렌즈를 유리 커버 슬립의 경계 밖으로 이동하지 마십시오. 원하는 시야를 선택합니다.

이상적으로, 세포는 모든 적절한 채널에서 양호한 형광 신호를 나타내야 하며, 세포 내 내용물을 쉽게 시각화할 수 있도록 커버 슬립 표면에 충분히 부착되고 퍼져 있어야 합니다. 측면 X, Y 및 Z 초점의 작은 조정은 획득 3D 인터페이스를 사용하여 컴퓨터에 의해 제어될 수 있습니다. 셀의 중간 부분을 통해 주어진 이미지에 대한 원하는 시야에 따라 베닝을 1 x 1 또는 2 x 2로 설정하고 최대 픽셀 강도가 3000 카운트를 초과하지 않도록 노출 매개변수를 설정합니다.

일반적으로 퍼센트 투과율은 해당 노출을 높이지 않고 가능한 한 낮게 설정해야 합니다. 1초가 넘는 시간. 이미징할 모든 형광 색상과 각각의 개별 시야에 대해 이 절차를 반복합니다.

최고 품질의 이미지를 얻으려면 세포 샘플의 상단과 하단에서 각각 약간 초점을 조정하여 Zack의 상한과 하한을 설정하십시오. 따라서 주어진 Z 스택의 총 이미지 수는 이러한 한계와 레이어 사이의 간격에 의해 결정됩니다. 이미지 획득 중 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 이미지 획득 모드를 파장으로 설정할 수 있습니다.

그런 다음 고정 샘플에 대한 ZS 스택과 라이브 샘플에 대한 ZS 스택 다음에 파장을 계산합니다. 모든 파라미터를 설정한 후 형광 이미지를 획득할 수 있습니다. 그런 다음 형광 이미지는 소프트 워크를 사용하여 전송되고 나중에 속도를 사용하여 분석됩니다.

여기에 표시된 이미지 시퀀스는 자가포식 유도의 처음 80분 동안 cwr 22 세포에서 발생하는 물리적 변화를 보여줍니다. 이 이미지에서 흰색 점선은 세포의 윤곽을 나타내고 밝은 음영 영역은 핵의 위치를 나타냅니다. 80분 동안 이미지는 세포 중심에서 멀어지는 핵의 변위, 초점 접착점의 감소, 세포 중심을 향한 상염색체 및 리소좀의 일반적인 전좌를 보여주며, 이후 시점에서 각각 녹색과 빨간색으로 표시됩니다.

공동 국소화(colocalization)의 작은 증가는 또한 노란색으로 표시된 바와 같이 상염색체(autosomes)와 리소좀(lysosomes) 사이에서 관찰되었습니다. 그런 다음 속도 디지털 이미징 애플리케이션 제품군을 사용하여 CWR 22 세포의 이미지에서 표지된 상염색체 및 리소좀에 대한 통계 데이터를 식별, 계수 및 수집했습니다. 여기에 표시된 바와 같이, 출현 시 초기 형성 이후의 상염색체의 수와 크기는 시간에 따라 변합니다.

자가포식 유도 80분 후, 상염색체의 수가 점진적으로 감소했으며 이에 따라 상염색체의 평균 크기가 증가했습니다. 또한, Pearson의 상관 계수 분석을 기반으로 한 상염색체와 리소좀의 공동 국소화가 측정 가능한 증가를 보였습니다. 이러한 발견은 자가포식(autophagy)을 자극하면 시간이 지남에 따라 수많은 작은 상염색체가 더 큰 상염색체를 형성한다는 것을 시사합니다.

여기에 표시된 것은 DV 모드, 시뮬레이션된 광시야 디콘볼루션과 구조적 조명 모드에서 획득 및 재구성한 이미지를 나란히 비교한 것입니다. OMX 현미경을 사용하여 측면 해상도를 기존 회절 제한 현미경 검사의 해상도의 두 배인 최대 120나노미터까지 개선했습니다. 상염색체와 리소솜의 소규모 공동 국소화는 초고해상도 현미경 검사에서는 명확하게 나타났지만, 기존의 형광 이미징에서는 거의 분명하지 않았습니다.

디콘볼루션 현미경 사용의 장점 중 하나는 모든 이미지를 3D 모델로 재구성하여 서로 다른 분자 간의 보다 정확한 공간 정보를 드러낼 수 있다는 것입니다. 여기에 표시된 것은 Cwr 22 RV one cell이 상염색체와 리소좀 사이에 상당한 양의 공동 국소화가 발생하기 시작하는 나중 시점에서 자가포식을 겪는 전체 그림입니다. 흰색으로 표시된 e coherent staining은 이 영화에서 표적 세포의 윤곽을 나타냅니다.

3D 재구성 모델은 상염색체와 리소좀 사이의 융합에 대한 더 많은 공간적 세부 정보를 제공합니다. 노란색으로 표시된 바와 같이, 녹색 광 사슬 3 신호와 빨간색 리소좀 신호 간의 상호 작용은 병합 된 신호가 존재하여 노란색을 생성하는 경우 분명합니다. 따라서 이 접근 방식은 자가포식을 연구하는 연구자가 직면한 두 가지 주요 과제를 해결할 것입니다.

우선, 우리는 현미경 단계에서 원래의 생리적 상태를 유지하기 위해 풍요로운 챔버인 마이크로 유체를 사용하여 스트레스 없는 환경을 유지하고자 합니다. 두 번째 과제는 통계적으로 관련성이 있는 정량적 이미지 데이터를 수집하는 것인데, 고정된 세포의 경우 일반적으로 다른 세포에서 많은 이미지를 가져와 유용한 정보로 컴파일합니다. 그러나 생명 세포의 경우 시간이 지남에 따라 하나의 세포를 따라가기만 하면 동등한 정보를 얻을 수 있습니다.

따라서 우리는 이 기술을 통해 다른 연구자들이 다른 장기와 다른 질병에서 자가포식의 기능과 역할을 연구할 수 있을 것이라고 믿습니다.