고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

이 절차의 전반적인 목표는 처리된 전립선 암세포의 정량적 이미지를 획득하여 서로 다른 시점에서의 자가포식 정도와 범위를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 arginine, dase 또는 기타 실험 시약으로 세포를 처리하여 자가포식 및/또는 세포 사멸을 유도합니다. 두 번째 단계는 살아있는 세포를 이미지화할지 또는 고정된 세포를 이미지화할지 결정하고 그에 따라 샘플을 준비하는 것입니다.

다음으로 광시야, 디콘볼루션 또는 구조광 조명 형광 현미경을 사용하여 살아있거나 고정된 세포의 3D 형광 이미지를 얻습니다. 마지막 단계는 오토파고솜의 크기 분포와 다른 세포 내 구조와의 공동 국소화에 대한 통계 데이터를 수집하는 것입니다. 디지털 3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용한 이 접근 방식은 arginine dase에 의한 오토파지 유도가 전립선 종양 세포 사멸을 일으킬 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 세포들이 세포사멸(apoptosis) 및 괴사(necrosis)와 관련된 변화와는 형태학적으로 구별되는 구조적 변화를 보인다는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술이 현재 존재하는 다른 방법들에 비해 가지는 주요 장점은, 정량적 3D 이미징을 통해 살아있는 세포 내부에서 특정 분자 이벤트가 언제 어디서 발생하는지 보여주고 이를 3차원 형식으로 제시할 수 있다는 점입니다. 시작을 위해, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 녹색 형광 단백질과 light chain 3가 결합된 인간 전립선암 세포를 35 밀리미터 poly-D-lysine 코팅 유리 바닥 배양 접시에서 배양하십시오. 세포는 빠른 증식을 촉진할 수 있을 만큼 충분한 밀도로 도말해야 하지만, 이미징 시점에 세포가 과성장하여 뭉치지 않도록 해야 합니다. 이미징 약 1시간 전에, 선택한 세포 샘플을 PBS 내의 arginine deaminase 또는 ADI로 처리하여 세포 내의 유리 arginine을 고갈시키고 암세포에 대사 스트레스를 유도하십시오. 1.5 µL의 LysoTracker Red를 10% FBS와 1% 항생제가 포함된 20 mL의 RPMI에 희석하십시오. 모든 배지를 37 °C로 가온한 후, ADI로 처리된 선택 샘플용 용액을 준비하십시오.

각 배양 접시에 적절한 배지를 추가하고, 이미징 약 30분 전에 LYO Tracker red가 포함된 RPMI로 37°C에서 15~45분 동안 세포를 배양합니다. 웨더 스테이션 환경 챔버를 켜고 37°C 및 5% CO₂로 평형이 맞춰질 때까지 기다립니다. PBS로 세포를 세척한 후, 10% FBS와 1% 항생제만 포함된 표준 RPMI 배지로 교체합니다. 지시된 대로 샘플에 DI를 추가합니다.

35mm 커버글라스 바닥 배양 접시를 맞춤형 어댑터에 장착합니다. 60배율의 1.42 수치구경 대물렌즈에 침강유를 사용하고, 장착된 배양 접시를 현미경 스테이지 위에 배치합니다. 본 영상에서는 Delta vision personal IDV applied position 디컨볼루션 현미경 및 관련 Soft Works 애플리케이션 제품군을 이용한 3D 현미경 관찰 방법을 시연합니다.

먼저 획득 워크스테이션과 기기 컨트롤러를 포함한 현미경 시스템의 전원을 켭니다. resolve 3D 컴퓨터 제어 애플리케이션을 실행하여 현미경 스테이지를 초기화하고 제논 광원의 전원을 켭니다. 광원이 예열되어 안정적인 상태에 도달할 때까지 10분 동안 기다립니다.

60배율, 1.42 수치구경 대물렌즈 위에 이머전 오일 한 방울을 떨어뜨리고, 명시야 조명이나 외부 조명 및 조동나사를 사용하여 커버글라스 면이 아래로 향하도록 슬라이드 표본을 대물렌즈 중앙에 맞춥니다. 조동나사를 천천히 돌려 이머전 오일 방울이 도치된 커버글라스와 접촉할 때까지 대물렌즈를 올립니다. 이 시점부터 미동나사를 몇 번 돌리면 세포층의 초점이 잡혀야 합니다.

슬라이드 상의 고정된 시료를 다룰 때는 기포가 있거나 기포 주변에 있는 세포는 피하는 것이 좋습니다. 글라스 바텀 디쉬(glass bottom dish)의 살아있는 시료를 관찰할 때는 대물렌즈가 글라스 커버슬립의 경계 밖으로 벗어나지 않도록 주의하십시오. 원하는 시야를 선택하십시오.

이상적으로는, 세포가 모든 해당 채널에서 양호한 형광 신호를 나타내야 하며, 세포 내 내용물을 쉽게 시각화할 수 있도록 커버슬립 표면에 충분히 부착되고 퍼져 있어야 합니다. 횡방향 X, Y 및 Z 초점의 미세 조정은 acquire 3D 인터페이스를 사용하여 컴퓨터로 제어할 수 있습니다. 세포의 중간 단면을 통해 얻고자 하는 이미지의 시야 범위에 따라 binning을 1x1 또는 2x2로 설정하고, 최대 픽셀 강도가 3000 counts를 초과하지 않도록 노출 파라미터를 설정하십시오.

일반적으로 투과율(percent transmission)은 그에 상응하는 노출 시간을 늘리지 않는 범위 내에서 최대한 낮게 설정해야 합니다. 노출 시간은 1초 이상으로 설정하십시오. 이미지를 획득하려는 모든 형광 색상과 각 개별 시야(field of view)에 대해 이 과정을 반복하십시오.

최상의 품질의 이미지를 얻으려면, 세포 샘플의 상단과 하단을 각각 약간 벗어나도록 초점을 조정하여 Z-stack의 상한 및 하한 값을 설정하십시오. 따라서 특정 Z-stack의 총 이미지 수는 이러한 제한 범위와 레이어 간 간격에 의해 결정됩니다. 이미지 획득 중 모션 아티팩트를 최소화하려면 이미지 획득 모드를 파장(wavelength)으로 설정할 수 있습니다.

그다음 고정된 시료의 경우 ZS 스택을, 살아있는 시료의 경우 ZS 스택 후 파장을 설정합니다. 모든 파라미터 설정이 완료되면 형광 이미지를 획득할 수 있습니다. 획득한 형광 이미지는 soft works를 사용하여 디콘볼루션(deconvolution)한 후, 추후 velocity를 사용하여 분석합니다.

여기에 제시된 이미지 시퀀스는 자가포식 유도 후 첫 80분 동안 cwr 22 세포에서 일어나는 물리적 변화를 보여줍니다. 이 이미지에서 흰색 점선은 세포의 외곽선을 나타내며, 연하게 음영 처리된 영역은 핵의 위치를 나타냅니다. 80분 동안의 과정을 통해, 핵이 세포 중심에서 멀어지는 변위, 국소 접착 지점의 감소, 그리고 오토솜(autosome)과 리소좀의 전반적인 세포 중심부 이동이 관찰되며, 이는 이후 시점에서 각각 녹색과 빨간색으로 표시됩니다.

노란색으로 표시된 바와 같이, 상염색체와 리소좀 사이에서도 공국소화의 소폭 증가가 관찰되었습니다. 이후 velocity 디지털 이미지 분석 소프트웨어 제품군을 사용하여 CWR 22 세포 이미지 내의 표지된 상염색체와 리소좀을 식별하고 계수하며 통계 데이터를 수집하였습니다. 여기에서 상염색체는 최초 형성되어 나타난 이후 그 수와 크기가 시간에 따라 변화함을 알 수 있습니다.

자가포식 유도 후 80분 후에 자가포식소체의 수가 점진적으로 감소했으며, 이에 따라 자가포식소체의 평균 크기는 증가했습니다. 또한, 피어슨 상관계수(Pearson's correlation coefficient) 분석을 통해 자가포식소체와 리소좀의 공국소화(colocalization)가 측정 가능한 수준으로 증가했음을 확인했습니다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 자가포식 자극 시 수많은 작은 자가포식소체들이 시간이 경과함에 따라 융합되어 더 큰 자가포식소체를 형성하는 것으로 시사되었습니다.

여기 DV 모드(시뮬레이션 광시야 디콘볼루션)와 구조광 조명 모드에서 획득 및 재구성된 이미지의 나란한 비교 모습이 제시되어 있습니다. OMX 현미경을 사용하여 측방향 해상도를 기존의 회절 한계 현미경 해상도의 두 배인 최대 120 nanometers까지 개선하였습니다. 일반적인 형광 이미징으로는 거의 확인되지 않았던 상염색체와 리소좀의 소규모 공국소화 현상이 초고해상도 현미경으로는 명확하게 나타났습니다.

디콘볼루션 현미경을 사용하는 장점 중 하나는 모든 이미지를 3D 모델로 재구성하여 서로 다른 분자 간의 더욱 정확한 공간 정보를 밝혀낼 수 있다는 것입니다. 여기 제시된 이미지는 자가포식(autophagy)이 진행 중인 Cwr 22 RV 단일 세포의 전체 모습으로, 오토솜(autosome)과 리소좀(lysosome) 사이의 상당한 공국소화(colocalization)가 일어나기 시작하는 후기 시점을 보여줍니다. 흰색으로 표시된 일관된 염색은 이 영상에서 표적 세포의 외곽선을 나타냅니다.

3D 재구성 모델은 상염색체와 리소좀 사이의 융합에 대한 더 상세한 공간적 정보를 제공합니다. 노란색으로 표시된 바와 같이, 녹색의 light chain three 신호와 적색의 리소좀 신호 사이의 상호작용은 두 신호가 병합되어 노란색을 띰으로써 분명하게 나타납니다. 따라서 이 접근 방식은 자가포식을 연구하는 연구자들이 직면한 두 가지 주요 과제를 해결할 수 있을 것입니다.

우선, 현미경 스테이지 위에서 원래의 생리적 상태를 유지하기 위해 미세 유체 perfusion chamber를 사용하여 스트레스가 없는 환경을 조성하고자 합니다. 두 번째 과제는 통계적으로 유의미한 정량적 이미지 데이터를 수집하는 것인데, 고정된 세포의 경우 보통 여러 세포에서 많은 이미지를 촬영하여 유용한 정보로 취합합니다. 하지만 살아있는 세포의 경우에는 시간이 경과함에 따라 단일 세포를 추적 관찰함으로써 그와 동등한 정보를 획득합니다.

따라서 우리는 이 기술이 다른 연구자들이 다양한 장기와 질병에서 오토파지의 기능과 역할을 연구하는 것을 가능하게 할 것이라고 믿습니다.