Name: 고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 학습하세요 전립선 종양 세포에서 자가소화를 정량 분석하는 고급 3D 형광 현미경법을. 아르기나아제 처리 후 자가소식체와 리소좀의 동역학을 시각화하여 세포 사멸 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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보조금 지원 : NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ 쿵), NIH CA150197S1 (CA Changou), 바이오 포토닉스 과학 &amp; 기술 (DL 울프슨, FYS 추앙), DOD PC073420 (RJ 굵게)에 대한 NSF PHY-0120999 센터, 연구 노르웨이 의회, Leiv 에릭손 여행 그랜트 209286/F11 (BS Ahluwalia는). HJ 쿵푸는 오번 커뮤니티 암 기부 기금의 지원을 인정합니다. RJ 굵은는 J. 맥도날드 기부금의 지원을 인정합니다. 우리는 ADI의 관대 한 공급 박사 제니 웨이 - 젠 쿵푸와 DesigneRx 박사 보르 - 원자바오 우 감사합니다.

1. 1 부 : 세포 배양 및 면역 형광 라벨링 <ol><li> 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 글루타민을 포함하는 RPMI (Mediatech, VA) 6 - 잘 접시에 배치 유리 coverslips는 (# 1.5 170 μm의 두께)에 CWR22 RV1 인간의 전립선 암 세포를 성장. </li><li> 인산염 완충 식염수 (PBS)에있는 아르기닌 deiminase (ADI, 0.3 ㎍ / ㎖)를 선택한 샘플을 처리하여 autophagy를 유도. </li><li> RT에서 10 분 동안, coverslip에 100 μL, PBS에 희석 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA, 피셔 과학, NH)로 세포를 고정합니다. </li><li> 1 ML HBS / BSA와 배 세포를 씻으십시오. </li><li> RT에서 15 분 HEPES (HBS) / BSA, coverslip에 100 μL, 0.05 %의 사포닌 (시그마, MO)로 세포를 Permeabilize. </li><li> 이전 면역 라벨, HBS / BSA, coverslip에 100 μL, 2.5 % 카제인 (시그마, MO)와 실온에서 1 시간 동안 블록 샘플을합니다. </li><li> 2.5 % 카제인 / HBS / BSA, coversl 당 100 ㎕의 희석 일차 항체 고정 된 세포를 배양4에서 IP, O / N ° C. </li><li> 1 ML HBS / BSA와 배 세포를 씻으십시오. </li><li> RT에서 1 시간 동안 2.5 % 카제인 / HBS / BSA, coverslip에 100 ㎕의 희석 차 항체 고정 된 세포를 품어. </li><li> 1 ML HBS / BSA와 배 세포를 씻으십시오. </li><li> SlowFade 골드와 일반 유리 현미경 슬라이드에 준비의 coverslips를 탑재, 4를 포함하는 골드 antifade 시약 (Invitrogen 사, CA) &#39;,6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)을 연장. </li><li> 매니큐어와 씰 coverslip을 사용하면 가장자리. 최고의 이미징 결과를, 반대로 퇴색 미디어 시간 (이상적으로 O / N) 철저하게 세포를 침투 할 수 있습니다. </li><li> 메탄올 및 / 또는 클로로포름 깨끗한 coverslip을 표면. </li><li> 침수 오일 (굴절률 1.520 영상 37 ° C, 또는 1.516 RT에서 영상) 60X 1.42 NA 대물 렌즈 (올림푸스, 일본) 있습니다. 추가 </li><li> 위치 현미경 무대에 슬라이드와 관심의 세포로 포커스를 설정합니다. </li></ol> 2. 2 부 : 라이브 영상을위한 준비 세포 <ol><li> CWR 성장35mm 폴리 - D - 라이신 코팅 유리 바닥 문화 요리 (MatTek, MA)에 10 % FBS와 1 % 항생제가 포함 된 RPMI 배양액에서 녹색 형광 단백질 결합 라이트 체인 3 (LC3-GFP)을 발현 22 RV1 세포. 세포는 빠르게 증식을 촉진하기에 충분한 밀도로 도금,하지만 너무 많은 세포가 자란 및 이미징의 시간에 응집 것을.해야한다 </li><li> PBS의 ADI (0.3 ㎍ / ㎖)을 선택한 셀 샘플을 처리합니다. </li><li> 영상에 앞서 약 1 시간이 LysoTracker 레드 DND-99 (Invitrogen 사, CA) 20 ML RPMI의 1.5 μl를 희석. 10 % FBS와 1 % 항생제를 포함. 선택한 샘플에 대한 ADI를 포함하는 솔루션을 사용합니다. ° C 전에 배양 접시에 추가하기 37 모든 미디어를 따뜻하게. </li><li> RPMI 37 ℃에서 15-45 분간 LysoTracker 레드 DND-99을 함유 세포를 배양 </li><li> 영상에 앞서 약 30 분, 웨더 환경 인클로저를 켜고 37 평형 할 수 있도록 ° C와 5 % CO 2 (humidif로처음 엔 공기). </li><li> PBS로 세포를 씻어 표준 RPMI는 10 % FBS와 1 % 항생제가 포함 된 용지를 교체하십시오. 표시된대로 샘플 ADI를 추가합니다. </li><li> 마운트 35mm는 커버 글라스 바닥 문화 정의 어댑터 (정밀, 주식, 워싱턴 적용)의 요리, 그리고 현미경 단계에 위치. 60X 1.42 NA의 대물 렌즈에 침수 오일 (굴절률 1.520)를 사용하고, 무대에 탑재 된 배양 접시를 놓습니다. </li></ol> 3. 제 3 부 : 디컨 볼 루션 현미경 및 분석 이 섹션의 프로토콜은 DeltaVision 개인 DV의 디컨 볼 루션 현미경 및 관련 SoftWorX 응용 프로그램 제품군 (응용 정밀, 주식 회사, WA)의 사용을 가정합니다. <ol><li> 취득 워크 스테이션과 악기 컨트롤러를 포함, 현미경 시스템을 켭니다. 크세논 광원에서 현미경 스테이지 및 회전을 초기화하는 Resolve3D 응용 프로그램을 엽니 다. 따뜻하게하고 안정 상태에 도달하는 광원 10 분을 허용합니다. </li><li> 추가침수 기름의 드롭 60X 1.42 NA의 대물 렌즈와 대물 렌즈를 통해 센터 슬라이드 표본 (아래 커버 슬립 얼굴)에 (37 라이브 샘플에 대한 굴절률 1.520 ° C 또는 실온에서 고정 된 샘플 1.516). </li><li> 침수 기름의 구슬 거꾸로 커버 유리와 접촉 할 때까지 두 시야 또는 외부 조명과 거친 초점 조절 노브를 사용하여, 천천히 대물 렌즈를 올립니다. (이 시점에서, 세포 층은 미세 초점 노브를 조정하는 몇 회전에서 초점이되어야합니다.) 슬라이드에 고정 된 샘플로 작업 할 때, 그것은 거품 모든 지역 내 또는 주변 세포를 방지하는 것이 좋습니다. 유리 바닥 접시에 살고 샘플 볼 때, 유리 coverslip에의 경계 외부의 대물 렌즈를 이동하지 마십시오. </li><li> Autophagosomes은 EGFP 신호 (녹색)에 의해 식별 할 수 있습니다. 리소좀은 LysoTracker 레드 (실시간 샘플) 또는 방지 램프 1 형광 항체 (고정 샘플)에 의해 식별됩니다. 세포 핵은 DAPI 성으로 식별됩니다(고정 샘플) aining. </li><li> 보기 원하는 필드를 선택합니다. 이상적으로, 세포가 적절한 모든 채널에서 좋은 형광 신호를 전시하며, 충분히 부착 세포 내용을 시각화하기 쉬운 수 있도록 coverslip을 표면에 확산. 측면 X, Y 및 Z 초점의 작은 조정은 Acquire3D 인터페이스를 사용하여 컴퓨터에 의해 제어 할 수 있습니다. 보기 원하는 필드 (더 많은 세포가 비닝 (binning)는 2 × 2로 설정되는 필드에서 볼 수있다)에 따라, 1X1 또는 2 × 비닝 (binning)을 설정합니다. </li><li> 셀의 중앙부를 통해 지정된 이미지의 경우 최대 픽셀 강도는 3,000 수를 초과하지 않는 등 노출 매개 변수 (예 : % 전송 전력 및 노출 시간)을 설정합니다. 일반적으로, % 전송은 1 초에 해당하는 노출 시간을 발생시키지 않고, 가능한 한 낮게 설정해야합니다. 최고 품질의 이미지를 얻기 위해 이미지에 표시 할 모든 형광 색상 및보기의 각 개별 필드에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> U를 설정각각의 세포 샘플의 상단과 하단에 단지 약간의 초점을 조절하여 Z-스택의 pper과 하한. 에서 이미지의 총 수는 Z-스택을 제공함으로써 이러한 제한에 의해 및 레이어 (0.2 μm의 기본값) 사이의 간격에 의해 결정됩니다. </li><li> 이미지 수집 중에 모션 아티팩트를 최소화하기 위해, 우리는 고정 샘플 &quot;그 파장 Z-스택&quot;및 &quot;다음에 z 스택 파장&quot;라이브 샘플로 이미지 획득 모드를 설정하는 것이 좋습니다. </li><li> 형광 이미지는 SoftWorX (응용​​ 정밀, WA)를 사용하여 deconvolved 이상 (퍼킨 엘머, MA 지금, 순발력) VoloCITY를 사용하여 분석됩니다. </li></ol> 4. 제 4 부 : 최고 해상도, 구조적 조명 (OMX) 현미경 이 섹션의 프로토콜은 OMX 구조적 조명 현미경의 사용 (응용 정밀, WA)에 적용됩니다. <ol><li> 주 전원 원하는 레이저 (410 nm의 488 nm의, 및 / 또는 532 nm의)에 전환합니다. 20 마일 기다립니다N 레이저 용 열 안정 수 있습니다. </li><li> 60X 1.42 NA의 대물 렌즈에 침수 오일 (RT에서 고정 된 샘플에 대한 굴절률 1.516)를 추가합니다. 거품이 기름 방울을 볼 경우, 목표를 청소하고 다시 오일을 추가합니다. </li><li> 무대에서하고 필요한 경우 샘플 슬라이드를 배치, 셀의 10 분은 coverslip을에 정착 할 수 있습니다. </li><li> 취득 프로그램을 초기화합니다. 셀의 날카로운 윤곽을 볼 수있을 때까지 초점을 조절하는 형광 조명을 사용합니다. (관리는 실제 이미지 획득 할 때까지, 형광 여기에 세포의 노출을 최소화하기 위해 항상주의해야한다). </li><li> 나선형 모자이크 스캔이 관심의 세포 나 지역을 선택하려면 샘플의 큰 영역을 미리 취득 할 수 있습니다. 이 샘플을 스캔 또는 대상을 찾는 동안 짧은 노출 시간 (1-10 밀리 초) 및 낮은 구동 전력 (0.1-1 % 전송)를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> GFP-LC3의 형광에 의해 autophagosomes를 식별합니다. 알렉사 플 루어 555 안티 LAMP에 의해 리소좀을 식별(리소좀 - 관련 막 단백질)와 DAPI를 (고정 샘플)를 사용하여 세포 핵. </li><li> 여기 파장, 이미지 영역 (예를 들어 512x512 크기) 스택의 두께, 노출 시간 및 레이저 전송 비율 등의 실험 조건을 선택합니다. 슈퍼 해결 이미지의 구조화 된 조명 옵션이 활성화되어 있는지 확인합니다. OMX의 디컨 볼 루션 현미경, 기존 조명 옵션을 선택합니다. </li><li> 최고의 재건 결과, 최대 강도 계수가 획득 동안 10,000에서 15,000 명 사이가되도록 실험 조건을 선택합니다. photobleaching에이 문제가되는 경우, 낮은 노출 (5,000 ~ 10,000 사이의 카운트)의 이미지를 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 수는 전체 수집 기간 동안 2 배 이상 감소하지 말아야하며, 네 배 이상에 의한 감소는 피해야한다. 필요한 경우, 지속적인 강도 수를 보장하기 위해 스택 두께를 줄일 수 있습니다. 카메라에 너무 최대 64,000 카운트에 포화긴장이를 초과해서는 안됩니다. 좋은 샘플을 위해, 우리는 1 % 레이저 전송을 10으로 실험 조건 ~ 50 밀리 초 노출 시간을 발견했다. 반복적으로 이미지화 할 수있는 밝고 photostable 샘플이 바람직하다. 안정 얼룩은 시간 경과, 슈퍼 해결할 이미지가 필요합니다. </li><li> 소음, 95MHz 판독 속도 (중간 속도 옵션), 2 밀리 이상 획득 시간을 단축하는 것이 좋습니다. 증가 된 유물은 샘플 수집하는 동안 이동 재구성 군데에서 얻을 수 있습니다. 이 영향으로 인해, 짧은 노출은 비 부착 또는 빠르게 움직이는 세포를 권장합니다. </li><li> 다중 채널 영상을 동시에 또는 순차적으로 수행 할 수 있습니다. Sequential (순차) 모드 수율 적은 크로스 토크 및 따라서 권장합니다. </li><li> photobleaching에 줄이기 위해 일반적으로 첫 번째 이상 여기 파장 (다음 532 nm의 488 nm의 410 nm의)에 이미지를 권장합니다. 그러나 그림 3의 실험 결과,이 순서는 반대했다이 특정 샘플의 광 안정성으로 인해 D (즉, 48 nm의 532 nm의 410 nm의). </li><li> 세포의 위 / 아래는 초점이 약간 때까지 현미경 스테이지를 이동하여 Z-스택의 상한 / 하한을 설정합니다. 복원 소프트웨어는 기본적으로이 값을 각 이미지 사이의 원하는 거리를, 최고 해상도 이미징을위한 0.125 μm의에서 일정하게 유지되어야한다. </li><li> SoftWorX (응용​​ 정밀, WA)를 사용하여 이미지 스택을 재구성하고 VoloCITY 6.0 (퍼킨 엘머, MA)를 사용하여 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

LC3에 대한 형광 프로브로 표시된 세포의 직접 관찰이 널리 자식 작용 반응 6, 양적 3D 동일한 시스템 (우리가했던 것처럼)의 영상 세포 자식 작용의 복잡한 과정에 대해 전례없는 정보와 세부 정보를 제공합니다 확인하는 표준 방법으로 인정되고 있지만 . 특히, 우리는 살아있는 세포에있는 autophagosomes의 수백 (수천하지 않을 경우) autophagy를 유도 80 분 내에 형성되는 것을 관찰합니다. 마찬가지로, 우리는 autophagy에 유도시 리소좀 구획의 분포에서 매우 흥미로운 형태 학적 변화를 관찰한다. 주어진 셀 내, autophagosome 수의 감소와 시간에 자신의 평균 크기의 해당 증가, 그 autophagosomes는 폼 autolysosomes에 리소좀과 결합하기 전에, 서로 융합하여 더 큰 성장을하는 것이 좋습니다. 살아있는 세포의 고해상도 3D 형광 이미징 autophagosomes가 중요한 크기 befor를 도달해야하는지 여부를 조사하기 위해 우리를있게리소좀과 전자 융합, 또...

<table><tbody><tr><td>아르기닌 데이미나제 (ADI)</td><td>DesigneRx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>카제인</td><td>시그마</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>피셔</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 안티 마우스 555</td><td>인비트로젠</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 안티 래빗 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21244</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>anti-Lamp1</td><td>DSHB</td><td>H4A3</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cadherin</td><td>Cell Signaling</td><td>#3195</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>35 mm poly-d-lysine 코팅 유리 바닥판</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-1.4-C</td><td></td></tr><tr><td>No.1, 22mm 커버슬립</td><td>Corning</td><td>#2865-22</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>글로브 사이언티픽</td><td>1324G</td><td></td></tr></tbody></table>

고급 3d 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

수술은 발기 부전과 요실금의 중요한 위험을 수행하는 동안 전립선 암은 미국 남성들 사이 악성의 주요 형태이며, 기존의 화학 요법 방법은 대부분 실패했습니다. 호르몬 치료는 초기 단계에 효과적이지만, 종종 호르몬 불응 성 종양의 최종 개발에 실패합니다. 우리는 종양 세포의 특정 대사 결핍을 대상으로 치료제 개발에 관심이있다. 우리는 최근이 전립선 종양 세포는 특히 아미노산 아르기닌 (1)의 합성에 관여하는 효소 (argininosuccinate 합성 효소 또는 ASS)를 부족했다. 이 조건은 외생 아르기닌에 의존하는 종양 세포를 원인, 무료 아르기닌은 아르기닌 deiminase (ADI) 1,10가 고갈 될 때 신진 대사 스트레스를 겪는다. 사실, 우리는 인간의 전립선 암 세포 CWR22 RV1을 효과적으로 카스파 독립적 인 세포 사멸과 적극적인 autopha과 ADI에 의해 살해되는 것으로 나타났습니다GY (또는 macroautophagy) 1,2,3. 자식 작용은 세포가 4,5 영양 기아 동안 리소좀 고장에 의해 원치 않는 단백질을 대사 할 수 있도록 진화 - 보존 과정입니다. 이 통로의 필수 구성 요소가 6,7,8,9 잘 특성화되어 있지만, 분자 기계의 많은 부분은 여전히 불분명하다 - 특히 ADI의 치료 후 전립선 암 세포의 죽음 반응에 autophagy에의 역할을 무엇인가 ? 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 세포 자식 작용 반응의 수준과 범위를 측정하는 실험 방법을 필요 - 정확하게이 과정을 추적 할 수있는 알려진 분자 마커가 없기 때문에, 우리는 사용하여 영상 기반의 접근 방식을 개발하기로 결정했습니다 양적 3D 형광 현미경 11,12. autophagosomes과 리소좀 형광 프로브를 구체적으로 표지 된 CWR22Rv1 세포를 사용하여, 우리는 3D 이미지 스택 위스콘신 중 하나에 인수 보여defield의 ​​디컨 볼 루션 현미경 (이상, 최고 해상도, 구조적 조명 현미경)은 명확하게 autophagy에 유도의 초기 단계를 캡처 할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 디지털 이미지 분석 응용 프로그램과 함께, 우리는 쉽게 autophagosome과 리소좀 수, 크기, 분포 및 이미지 한 셀에서 colocalization을 정도에 대한 통계 정보를 얻을 수 있습니다. 이 정보는 우리가 정확하게 살아있는 세포의 자식 작용의 진행 상황을 추적 할 수 및 암 화학 요법 autophagy에의 역할에 대한 지속적인 조사를 할 수 있습니다.

그림 1의 이미지 시퀀스는 autophagy에 유도의 첫 80 분 동안 CWR22 세포에서 발생하는 신체적 변화를 보여줍니다. 이것과 다른 연구 (미도시)에서 우리는 일관되게 관찰 : 거리 세포의 중심에서 핵 (1) 변위, 초점 접착 점 (2) 감소, 그리고의 중심을 향해 autophagosomes와 리소좀 (3) 일반 전좌 셀. 또한, 우리는 또한 나중에 지점에서 autophagosomes (녹색)와 리소좀 (적색) 사이 colocalization을의 작은 증가 (노란색으로 표시), 관찰했다. 이미지 기반 세포 계측법의 데모로, 우리는 식별 카운트와 같이 CWR22 세포의 이미지에 표시된 autophagosomes과 리소좀에 대한 통계 데이터를 수집하는 VoloCITY 디지털 이미징 응용 프로그램 제품군 (버전 6.0, 순발력 / 퍼킨 - 엘머)를 사용 그림 1. 그림 2의 차트에서와 같이, T의 수와 크기그는 a...

자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

이 절차의 전반적인 목표는 처리된 전립선 암세포의 정량적 이미지를 획득하여 서로 다른 시점에서의 자가포식 정도와 범위를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 arginine, dase 또는 기타 실험 시약으로 세포를 처리하여 자가포식 및/또는 세포 사멸을 유도합니다. 두 번째 단계는 살아있는 세포를 이미지화할지 또는 고정된 세포를 이미지화할지 결정하고 그에 따라 샘플을 준비하는 것입니다.다음으로 광시야, 디콘볼루션 또는 구조광 조명 형광 현미경을 사용하여 살아있거나 고정된 세포의 3D 형광 이미지를 얻습니다. 마지막 단계는 오토파고솜의 크기 분포와 다른 세포 내 구조와의 공동 국소화에 대한 통계 데이터를 수집하는 것입니다. 디지털 3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용한 이 접근 방식은 arginine dase에 의한 오토파지 유도가 전립선 종양 세포 사멸을 일으킬 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 세포들이 세포사멸(apoptosis) 및 괴사(necrosis)와 관련된 변화와는 형태학적으로 구별되는 구조적 변화를 보인다는 결과를 얻을 수 있습니다.이 기술이 현재 존재하는 다른 방법들에 비해 가지는 주요 장점은, 정량적 3D 이미징을 통해 살아있는 세포 내부에서 특정 분자 이벤트가 언제 어디서 발생하는지 보여주고 이를 3차원 형식으로 제시할 수 있다는 점입니다. 시작을 위해, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 녹색 형광 단백질과 light chain 3가 결합된 인간 전립선암 세포를 35 밀리미터 poly-D-lysine 코팅 유리 바닥 배양 접시에서 배양하십시오. 세포는 빠른 증식을 촉진할 수 있을 만큼 충분한 밀도로 도말해야 하지만, 이미징 시점에 세포가 과성장하여 뭉치지 않도록 해야 합니다. 이미징 약 1시간 전에, 선택한 세포 샘플을 PBS 내의 arginine deaminase 또는 ADI로 처리하여 세포 내의 유리 arginine을 고갈시키고 암세포에 대사 스트레스를 유도하십시오. 1.5 µL의 LysoTracker Red를 10% FBS와 1% 항생제가 포함된 20 mL의 RPMI에 희석하십시오. 모든 배지를 37 °C로 가온한 후, ADI로 처리된 선택 샘플용 용액을 준비하십시오.각 배양 접시에 적절한 배지를 추가하고, 이미징 약 30분 전에 LYO Tracker red가 포함된 RPMI로 37°C에서 15~45분 동안 세포를 배양합니다. 웨더 스테이션 환경 챔버를 켜고 37°C 및 5% CO₂로 평형이 맞춰

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

저하 및 재활용을위한 효모 공포의 산성 루멘에 organelles의 전달을 모니터링하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 인코딩 듀얼 발광 형광 산도 - 바이오 센서 및 형광 현미경을 사용하여 개별 세포의 시각화와 대상 organelles의 특정 상표에 의존합니다.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

이 비디오에서는 전립선암 세포에서 아르기닌 데미나제 기반 자가포식 유도를 보여줍니다. 또한, 고급 형광 현미경 검사를 사용하여 자가포식소체 및 리소좀의 형성 및 분포, 자가분해소좀으로의 융합을 포함하여 자가포식 유도와 관련된 변화를 시각화할 수 있습니다.

전립선암 세포의 ADI 기반 자가포식 유도: 세포의 자가포식 반응을 측정하기 위한 효소 기반 기술

찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

기아 패드(중앙 공동이 있는 현미경 슬라이드에서 아가로스와 수돗물의 혼합물)를 사용하여 Penicillium chrysagenum의 자가포식을 연구하는 편리하고 강력한 방법이 여기에 제시되어 있습니다.

자식 작용의 분석에<em&gt; 페니 chrysogenum</em&gt; 형광 현미경과 조합 기아 패드를 사용하여

여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

단백질 집계 및 autophagic 플럭스의 초파리 모델의 중앙 신 경계에서의 형광 이미징-기반 세포 생물학 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. neurodegeneration입니다.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

우리는 autophagy및 마우스 간에서 proteasome를 통해 단백질 이화 작용에 있는 생물학 리듬을 측정하기 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다.

자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

이 프로토콜의 목표는 LC3 면역형광 및 LC3 도트 정량화를 통해 췌장암 및 췌장 전초 세포의 자가포식 수준을 결정하는 것입니다.

LC3 면역형광법을 사용하여 두 가지 다른 췌장 세포 모델에서 자가포식 수준 평가

여기서는 세포 초미세 구조와 관련된 희귀 단백질의 국소화를 조사하기 위한 도구로서 내인성 형광 표지를 기반으로 하는 최적화된 절편 상관 광전자 현미경을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법의 힘은 바필로마이신 처리 없이 굶주린 세포에서 내인성 LC3의 초구조적 국소화에 의해 입증되었습니다.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

여기에서는 면역블로팅을 통해 세포외 소포체(EV)에서 자가포식 마커 LC3-II 수준을 간결하게 평가하는 방법론을 제시합니다. EV에서 LC3-II 수준, 자가리소좀 형성 및 오메가솜 형성에 대한 분석은 자가포좀-리소좀 융합이 억제될 때 LC3-II 양성 EV의 방출에서 STX6의 새로운 역할을 시사합니다.

세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

학습하세요 전립선 종양 세포에서 자가소화를 정량 분석하는 고급 3D 형광 현미경법을. 아르기나아제 처리 후 자가소식체와 리소좀의 동역학을 시각화하여 세포 사멸 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

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