요리사 tdTomato를 사용하여 Zebrafish Somatosensory의 뉴런의 Optogenetic 활성화

이 절차의 전반적인 목표는 유충 얼룩말 물고기에서 단일 체성 감각 뉴런을 활성화하는 것입니다. 이것은 먼저 광 케이블을 준비하고 A-D-P-S-S 블루 레이저에 연결하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 1-2개의 세포기 배아에 전이유전자를 주입하는 것입니다.

다음으로 체성 감각 뉴런에서 C-H-E-F-T-D 토마토를 발현하는 지방 배아를 스크리닝하고 체내 장착합니다. 마지막 단계는 단일 뉴런 활성화를 위해 짧은 청색광 펄스를 전달하고 그 결과로 나타나는 행동을 기록하는 것입니다. 채널 루트 옵션 2를 사용하는 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 이 접근 방식을 사용하여 입원 후 최소 4일까지 활성화된 단일 뉴런에서 행동 반응을 이끌어낼 수 있다는 것입니다.

이 방법은 유충 제브라피쉬의 특정 체성 감각 뉴런의 기능에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용되고 있습니다. 이 접근 방식은 내부 뉴런 또는 운동 뉴런과 같은 제브라피시 뉴런 개체군에 의해 유발되는 행동을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 이 유전적 접근법은 생체 내에서 특정 뉴런을 활성화하고, 기능 발달을 특성화하고, 행동에 대한 특정 단백질의 돌연변이 또는 현상학적 차단의 영향을 평가하고, 뚜렷한 행동 반응을 유도하는 다운스트림 뉴런 네트워크를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 유리의 테이퍼진 넥을 녹여 광 케이블용 저장 장치를 만듭니다. 파스타 피펫을 번트와 버너 위에 올려 150도 각도를 만듭니다. 그런 다음 와이어 커터 또는 면도날을 사용하여 광 케이블을 조심스럽게 두 조각으로 자릅니다.

각 조각의 한쪽 끝은 노출되어 있고 한쪽 끝에는 FC PC 어댑터가 있어야 합니다. 그런 다음 광섬유 재킷을 제거하고 섬유를 강화하고 케이블 절단단의 5.0cm에서 코팅하여 광 케이블을 클래딩까지 벗겨냅니다. 그런 다음 준비된 파스타 피펫에 광 케이블을 삽입합니다.

케이블이 다이아몬드 유리 커터 또는 끝이 미세한 집게를 사용하여 피펫 팁 안팎으로 쉽게 움직일 수 있는지 확인하십시오. 유리 섬유에 흠집을 내고 끝을 잘라 섬유 끝을 깔끔하게 자릅니다. 그런 다음 광 케이블을 파스타 피펫에 집어넣습니다.

그런 다음 현미경 아래의 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 파스타 피펫에 광 케이블을 수동으로 배치하고 한 쌍의 집게를 사용하여 24-48 HPF 배아를 COATE한 다음 형광 해부 현미경을 사용하여 0.02% trica를 사용하여 유충을 마취합니다. Ron Beard 뉴런 또는 삼차 뉴런 발현으로 유충 식별 쉽게 식별할 수 있는 세포에서 희박하게 발현되는 배아가 가장 좋지만 개별 뉴런은 광섬유 케이블로 활성화를 목표로 하므로 광범위한 발현 밀도가 허용됩니다. 유충을 신선한 PTU 파란색 배아 물을 넣은 새 접시로 옮깁니다.

원하는 실험 단계까지 배아를 섭씨 28.5도의 어두운 곳에서 보관합니다. 이 섹션에서는 1.5% 낮은 맥아제와 이중 증류수를 만들어 섭씨 42도의 열 블록에 보관하여 응고되는 것을 방지합니다. 유리 파스타 피펫을 사용하여 사전 스크리닝 유충 중 하나를 가능한 한 적은 파란색 배아 물과 함께 1.5% 저용융 아가로스 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 아가로스 한 방울에 담긴 유충을 작은 페트리 접시에 옮깁니다. 해부 현미경으로 용암이 응고될 때 용암 등쪽이 위로 향하게 놓습니다. 얇은 면도날을 사용하여 용암의 양쪽에서 용암을 잘라냅니다.

aros 주변 지역을 배아 푸른 물로 채웁니다. 다음으로, 용암이 흠집이 나지 않도록 주의하면서 노른자의 양쪽을 대각선으로 두 개 자릅니다. 그런 다음 용암의 줄기와 꼬리에서 agrow를 당겨 빼냅니다.

이제 고속 카메라를 해부 스코프에 장착하고 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 그런 다음 컴퓨터와 고속 카메라를 켭니다. 비디오 이미징 소프트웨어를 열고 카메라 설정을 조정합니다.

다음으로 광 케이블, 레이저 및 자극기를 함께 연결합니다. 그런 다음 자극기를 켜고 최대 5볼트와 펄스 지속 시간을 5밀리초로 설정합니다. 그런 다음 레이저를 켭니다.

다음으로, 형광 해부 현미경을 사용하여 C-H-E-F-T-D 토마토 발현을 가진 뉴런 세포체 근처에 광학 케이블 끝을 배치합니다. 청색광 펄스를 전달하여 감각 뉴런을 활성화합니다. 그런 다음 고속 카메라를 사용하여 응답을 기록합니다.

초당 500 또는 1000 프레임으로 설정하고, 습관화를 피하기 위해 활성화 사이에 최소 1 분으로 실험을 반복하고, 용암을 방출하기 위해, 집게로 Aris를 방출하고, 동물에게 inre하지 않도록주의하십시오. 그런 다음 신선한 파란색 배아 물에 옮깁니다. 동물이 더 발달하도록 할 수 있으며 더 어린 단계에서 절차를 반복할 수 있습니다.

또한 배아를 다시 장착하여 활성화된 세포의 고해상도 컨포칼 이미징을 수행하여 세포 구조와 행동을 연관시킬 수 있습니다. 여기에 다이어그램으로 표시된 제브라피쉬 용암은 부분적으로 1.5% 저맥아 아리스에 장착되어 있으며, 이는 로스트랄 부분을 둘러싼 점선으로 표시됩니다. 삼차 뉴런과 로한 수염 뉴런은 그림에서 점선으로 윤곽이 그려진 빨간색 입 세포에 묘사되어 있습니다.

다음은 약 35 HPF 용암에서 C-H-E-F-T-D 토마토를 발현하는 단일 Rohan 수염 뉴런의 활성화가 행동 반응을 이끌어내는 것을 보여주는 영화입니다. 이 영화는 60 HPF 용암에서 Rohan 수염 뉴런을 발현하는 C-H-E-F-T-D 토마토의 활성화를 보여주며, 이 영화는 4개의 DPF 용암에서 C-H-E-F-T-D 토마토 발현 Rohan 수염 뉴런의 활성화를 보여줍니다. 이 독창적인 접근 방식은 1시간 이내에 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 다양한 시점에서 개별 뉴런과 유충 천칭자리 물고기를 활성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 안전 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.