조직 샘플의 피부 세포 표현형 및 증식 상태를 평가하기 위한 고처리량 이미징 및 분석 워크플로우

이 프로토콜은 다중 광학 이미징 방법, IBEX 및 Click-iT EDU 라벨링을 결합하여 피부 복구와 같은 매우 역동적인 과정에서 분열하는 세포 유형을 검출하고 분류합니다. 또한 처리량이 많은 이미지 획득 및 분석을 위한 새로운 오픈 소스 이미징 처리 파이프라인을 제공합니다. 24웰 플레이트를 200마이크로리터의 크롬 알루미늄 젤라틴으로 코팅하고 플레이트를 로커 셰이커에서 15분 동안 배양합니다.

그런 다음 젤라틴을 완전히 제거하고 코팅된 우물을 40도 오븐에서 60분 동안 건조시킵니다. 극저온 조절기에서 15 내지 30마이크로미터 두께의 OCT 포매 조직을 절단하고 2밀리리터의 PBS가 들어 있는 코팅된 웰로 빠르게 옮깁니다. 조직 절편을 웰 중앙에 유지하는 것을 목표로 1밀리리터 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 제거합니다.

이를 효과적으로 수행하려면 웰 가장자리에서 PBS를 천천히 흡인하고 필요에 따라 피펫 위치를 조정하여 조직이 이동하는 것을 방지합니다. 조직 절편을 섭씨 37도 오븐에서 1시간 동안 건조시킵니다. 1밀리리터 PBS로 5분 동안 재수화합니다.

실온에서 30분 동안 500마이크로리터의 0.5% Triton으로 조직을 투과화합니다. PBS로 조직을 두 번 짧게 세척하고 실온에서 30분 동안 Click-iT 반응을 수행합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하십시오.

PBS로 조직을 두 번 짧게 세척합니다. 실온에서 차단 완충액으로 1시간 동안 차단합니다. 첫 번째 주기에 대한 1차 항체를 추가합니다.

그리고 접시를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. PBS로 세 번 세척합니다. 2차 항체 염색을 수행합니다.

첫 번째 주기의 경우, 핵 대조 염색과 함께 결합되지 않은 1차 항체에 대한 2차 항체를 적용합니다. 빛으로부터 보호된 샘플을 실온에서 60분 동안 배양합니다. 실온에서 5분 동안 1밀리리터 PBS로 조직을 세 번 세척합니다.

각 웰에 약 500마이크로리터의 PBS를 남겨두고 플레이트를 현미경으로 가져옵니다. Meta Express 소프트웨어에서 심사를 클릭한 다음 획득 설정을 클릭합니다. 꺼내기 버튼을 클릭합니다.

플레이트 바닥을 70% 에탄올로 청소하고 플레이트를 현미경에 삽입합니다. 로드 플레이트 버튼을 클릭합니다. 대물렌즈 및 카메라 탭에서 원하는 배율을 선택합니다.

획득 모드로 공초점 51마이크로미터 슬릿 모드를 선택합니다. 플레이트 탭에서 플레이트 모델을 선택합니다. 플레이트 사이트 방문 탭으로 이동합니다.

사이트 옵션에서 고정 사이트 수를 클릭합니다. 대략 전체 우물이 덮이도록 열과 행의 수를 모두 설정합니다. 겹치는 부위를 클릭합니다 10% 플레이트 맵에서 해당 웰을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 획득할 첫 번째 웰만 선택합니다.

획득 자동 초점 탭으로 이동합니다. 웰 간 자동 초점의 경우 플레이트 및 웰 하단 옵션을 선택합니다. 사이트 자동 초점의 경우 모든 사이트 옵션을 선택합니다.

파장 탭으로 이동하여 현재 주기에서 이미징할 염료 수를 선택합니다. 첫 번째 파장 탭으로 이동합니다. Z 위치 지정에 대해 Z 오프셋이 있는 레이저를 선택하고 오프셋 계산 버튼을 클릭하여 올바른 이미징 높이를 설정합니다.

샘플에 가장 잘 초점을 맞춘 이미지를 선택합니다. 초점 버튼을 누릅니다. 조직의 초점 이미지가 표시됩니다.

조명 파워를 50%로 설정 대상 최대 강도를 2000으로 설정하고 자동 노출을 누릅니다. Z 시리즈의 경우 Z 시리즈 및 2D 투영 이미지를 선택하고 음영 보정의 경우 FL 음영만을 선택합니다. 다른 파장에 대해 단계를 반복하되 Z-오프셋이 있는 레이저 대신 W1에서 Z-오프셋을 선택하고 0을 선택합니다.

Z 시리즈 단계로 이동하여 원하는 단계 크기를 입력합니다. 포커스 버튼을 클릭합니다. 티슈 바닥에 도달할 때까지 현재 위치 화살표를 드래그하고 B 설정 버튼을 클릭합니다.

위치 화살표를 티슈 상단으로 드래그하고 T 설정 버튼을 클릭합니다. F2, 중지를 클릭하고 라이브 시작을 다시 누릅니다. 스테이지를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 첫 번째 우물에 있는지 확인합니다.

조직의 경계를 찾고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 획득할 조직이 포함된 모든 부위를 표시합니다. 실행 탭으로 이동하여 플레이트 이름을 입력합니다. 프로토콜 저장을 클릭합니다.

다른 모든 유정에 대한 획득 영역을 설정합니다. Control, Journal을 실행하고 녹음을 시작한 다음 즉시 Control, Journal, 녹음을 중지합니다. 생성된 저널을 저장하고 Control, Journal, Edit Journal을 통해 다시 엽니다.

왼쪽 패널에서 플레이트 획득으로 이동하여 파일에서 프로토콜을 로드하고 플레이트 획득을 클릭하여 해당 단계를 저널에 추가합니다. Edit Plate Acquisition을 두 번 클릭하고 파일에서 프로토콜을 로드한 다음 첫 번째 웰에 대해 저장된 프로토콜을 선택합니다. 획득할 각 웰에 대해 단계를 반복하고 항상 해당 프로토콜을 로드해야 합니다.

저널 실행을 클릭하여 획득을 시작합니다. 저널이 끝나기 30분 전에 표백 시약 준비를 시작합니다. 10mg의 수소화붕소리튬을 10ml의 이중 증류된 H2O에 녹이고 0.22마이크로미터 필터를 통과시킵니다.

10분 동안 그대로 두십시오. 용액이 거품을 형성하기 시작해야 합니다. 효율적인 표백을 위해서는 준비 후 4시간 이내에 표백 시약을 사용하십시오.

표백액을 샘플에 첨가하고 샘플을 주변 조명에 노출시키면서 15분 동안 배양합니다. 조직에 작은 거품이 나타나야 합니다. 표백된 샘플을 실온에서 5분 동안 1밀리리터 PBS로 세 번 세척합니다.

다음 주기를 위해 1차 항체를 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. Click-iT EDU 라벨링과 결합된 다중 IBEX 이미징은 상처 피부의 다양한 구조와 증식하는 세포 유형을 보여줍니다. 동결 보존 샘플에 대한 EDU 라벨링은 파라핀 포매 조직 절편에서 KI-67에 대한 항체 면역형광 라벨링을 수행할 때뿐만 아니라 유세포 분석을 사용하여 KI 67로 세포를 라벨링할 때 유사한 것으로 나타났습니다.

이 프로토콜을 사용하면 복잡한 생물학적 과정에서 세포 증식을 정확하게 검출할 수 있습니다. 또한 오픈 소스 이미징 처리 파이프라인은 프로그래밍 경험이 필요하지 않으며 Fiji 및 quPath와 같은 비상업적 소프트웨어로 처리할 수 있는 파일을 생성합니다. 또한 이 프로토콜은 값비싼 장비가 필요하지 않으므로 대부분의 연구 환경에서 수행할 수 있습니다.