설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

이 절차의 전반적인 목표는 설치류 배아에서 설치류 비뇨생식기, 부비동 간엽 또는 UGSM을 분리하고 조직 혼합물을 인간 전립선 상피를 형성할 수 있는 신장 캡슐에 이식하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐 또는 쥐 배아에서 비뇨생식기 부비동을 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, 비뇨생식기 부비동 중간엽(urogenital sinus mesenchyme)이 상피에서 분리됩니다.

그런 다음 비뇨생식기 부비동 중간엽의 단세포 현탁액이 만능 줄기 세포와 결합됩니다. 마지막으로, 세포 혼합물을 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래에 이식합니다. 궁극적으로, 인간 특이적 PSA 발현의 검증을 통해 마우스 신장에 형성된 인간 전립선 상피를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 전립선 기능 및 질병 시작에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 인간 전립선 종양의 이종 이식 및 종양 형성을 위한 주간 종양 생성 세포주 유도와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 임신한 생쥐나 쥐를 안락사시키고 배아를 분리한 후, 양수 자루에서 분리하고 탯줄을 잘라 얼음처럼 차가운 행크가 들어 있는 50ml 튜브로 옮깁니다. 소금 용액의 균형을 맞추고 얼음 위에 보관하십시오.

배아를 100mm 페트리 접시에 넣고 가위를 사용하여 덩어리 수준에서 배아를 이등분합니다. 위와 소장을 제거한 다음 방광 수준에 위치한 신장의 배아 또는 남성의 고환에서 발견되는 여성 배아의 난소를 찾습니다. 해부 범위 아래.

베니스 가위를 사용하여 복벽을 잘라 복부의 방광과 후벽을 노출시킵니다. 부착물로부터 상부 생식기를 분리하고 탯줄을 풀어줍니다. 치골을 자르고 dumont 가는 끝 집게로 자릅니다.

직설적으로 비뇨생식동(urogenital sinus)의 전벽(anterior wall)에서 분리하십시오. 비뇨생식동의 후벽을 직장에서 분리하고 방광이 아래쪽에 오도록 비뇨생식동을 절단합니다. 그런 다음 방광과 비뇨생식동을 분리한다.

비뇨생식동을 보관하고 얼음처럼 차가운 HBSS에 차단합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS의 1%트립신이 함유된 50ml 튜브에 비뇨생식동을 옮기고 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 트립신을 제거하고 10%FBS와 DM A MF 12 배지를 첨가하여 소화를 중화시킵니다.

다음으로, 바늘이나 가는 집게를 사용하여 상피관에서 끈적끈적한 중간엽 소매를 조심스럽게 놀립니다. 상피관을 온전하게 유지하면 간엽의 상피 세포 오염 가능성을 줄일 수 있습니다. 이로 인해 줄기 세포 유래 인간 선 상피와 함께 설치류 땀샘이 형성될 수 있습니다.

UGSM을 10%FBS 10%펜패름, 1%비필수 아미노산 및 1나노몰을 포함하는 DMM F 12 배지를 포함하는 새로운 50ml 튜브로 옮깁니다. R 1 8 81 섭씨 37도에서 튜브를 5%CO2로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 200 G.Disbarkant를 버리고 펠릿을 세척하기 위하여 PBS를 이용하십시오에 조직을 원심 분리하십시오.

PBS를 제거한 후, D-M-A-M-F 12에서 0.2%Collagenase에 조직을 재현탁시키고 섭씨 37도에서 1시간 동안 온화한 흔들림으로 소화 조직을 3번 격렬하게 소용돌이치고, 균질한 단세포 혼합물이 될 때까지 소화 조직을 3번 격렬하게 소용돌이치고, 10%FBS, 1%pen, 연쇄상구균, 1%non-non-essential 아미노산 및 1나노몰, R, 1, 8, 81, 12, 배지, D-M-A-M-F 12를 첨가하여 콜라겐분해효소를 중화합니다. 200G에서 펠릿화하여 세포를 세 번 세척하고 Resus를 HBSS에 현탁시킵니다. 마지막으로, DMM F 12에서 중간엽 세포를 현탁시키고 혈구 분석기를 사용하여 계수하여 이식을 수행합니다.

무균 수술 부위를 준비하고 케타민 자일라진의 IP 주사로 남성 흉선 누드 마우스를 마취한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 진정 수준을 확인하기 위해 발가락 꼬집기를 수행하고, 필요한 경우 수술 부위를 면도하여 수술 준비를 하고, 70% 알코올을 3번 번갈아 가며 닦은 후 베타딘 용액을 투여합니다. 안연고를 바른 후 뒤쪽을 1cm 세로 절개하고 0.5cm 세로 절개로 복벽을 계속 절개합니다. 복부에서 신장을 부드럽게 짜내고 멸균 식염수 한 방울을 사용하여 촉촉하게 유지하십시오.

그런 다음 27게이지 주사기 바늘을 사용하여 신장 캡슐에 부드럽게 구멍을 뚫어 세포 혼합물을 위한 주입 부위를 만듭니다. 그런 다음 28게이지 주사기 바늘에 10마이크로리터의 세포 혼합물을 채우고 천자 부위에 천천히 삽입하여 신장 실질(kinney parenchyma)을 관통합니다. 신낭 아래 영역에 도달하기 위해.

세포 혼합물 10마이크로리터를 주입하여 신낭 아래의 신장에 덩어리를 형성하고 바늘을 빼냅니다. 신장을 복강으로 되돌리고 4개의 나일론 봉합사로 복막의 근육층을 고정합니다. 봉합사나 스테이플로 피부를 닫고 멸균 식염수를 사용하여 피부에서 혈액을 청소합니다.

여기에 보이는 것은 이식 후 8주 후에 성장하는 이종이식편의 초음파 이미지입니다. 동그라미 부분은 신장 표면의 이종 이식편을 나타냅니다. 이 이미지는 신장 표면의 이종 이식편 성장을 보여줍니다.

12주 후, 비뇨생식동이 없는 상태에서 이식된 인간 ES 세포는 간엽이 큰 기형종을 형성하는 반면, 단독으로 이식된 비뇨생식기 부비동 간엽은 식별할 수 있는 구조를 형성하지 못합니다. 중앙에 표시됩니다. 이 그림의 패널은 줄기세포 유래 인간 전립선 상피와 성인 인간 전립선 조직의 대표적인 면역조직화학 염색입니다.

여기 왼쪽에서 볼 수 있듯이 땀샘에는 AR 양성 내강 상피층이 있습니다. 이는 또한 PSA 양성, P 63 양성 기저 상피 세포층 및 희귀 염색그라닌입니다. 신경내분비세포인 분비선은 숙주 거세 시 A-M-A-C-R 염색이 음성인 것처럼 암이 아닙니다.

AR PSA 양성 발광 세포는 더 이상 존재하지 않으며 특징적인 안드로겐 의존성을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 비뇨생식기 부비동 간엽을 상피와 분리하는 데 세심한 주의를 기울여야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 비뇨생식기 부비동 상피를 오염시키면 땀샘이 형성되어 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다.