세포 내 칼슘 측정

본 절차의 전반적인 목표는 형광 염료를 사용하여 인간 정자의 세포 내 칼슘 변동을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 swim up법으로 정자 샘플을 준비하고, 필요한 경우 capacitation을 촉진함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 정자에 칼슘 형광 염료를 로딩하는 것입니다.

다음으로, 일반적인 형광 측정법, 정지 유동 형광 측정법, 유세포 분석법 또는 단일 세포 이미징을 사용하여 실험을 수행하고 칼슘 측정값을 기록합니다. 최종적으로, 프로게스테론에 의해 유도되거나 수정능 획득 과정 중에 발생하는 세포 내 칼슘 농도의 변화를 결정하기 위해 결과를 분석합니다. 방사능을 이용하는 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 매우 민감한 절차라는 점입니다.

이 방법은 안전하고 수행하기 쉽습니다. 이 방법은 높은 공간 및 시간 분해능으로 세포 내 칼슘 증가를 유도하는 화합물의 식별이나, 단일 샘플 내의 서로 다른 세포 하위 집단 식별과 같이 SPR 칼슘 신호 전달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 유세포 분석법을 사용하는 것은 남성 배우자의 생리적 상태 분석을 통한 가임력 문제 진단으로까지 그 활용 범위가 확장됩니다.

이 방법은 인간 정자의 칼슘 동원 연구에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다른 종의 수컷 배우자나 뉴런 또는 근육 세포와 같은 다른 유형의 세포에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 사용하는 경우 정자 취급이 쉽지 않고, 실험 과정 전반에 걸쳐 생존력과 운동성을 가진 세포를 얻기 위해 적절한 조건을 유지하는 것이 중요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 연구진은 서로 다른 분야의 전략들을 결합하여 이러한 기술들의 활용을 구현하였습니다.

시료의 준비와 취급, 그리고 화합물의 첨가 과정에서 정자 세포가 손상될 수 있고 화합물 처리 중에 반응에 인위적인 결과(artifact)가 나타날 수 있어 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 정자 시료를 준비하려면, 액상 정액 500 microliter 위에 hams F 10 배지 1 milliliter를 조심스럽게 층이 지도록 쌓아야 합니다. 마이크로 피펫 팁으로 튜브 벽면을 살짝 터치하여 시료 위로 배지를 천천히 분주하십시오.

시료층과 배지층이 섞이지 않도록 천천히 수행하는 것이 매우 중요합니다. 배지에는 2mM calcium chloride와 5mg/mL BSA가 첨가되었습니다. 체외에서 수정을 위한 성숙(capacitation)을 촉진하기 위해, 튜브를 약 30도 각도로 조심스럽게 기울입니다.

이렇게 하면 두 액체 사이의 표면적이 증가하여, 배양하는 동안 시료에서 배지로 정자 세포의 치환 또는 상향 유영이 촉진됩니다. 다음으로, 경사진 시험관을 37 °C, 5% carbon dioxide 및 95% air 조건의 배양기에 넣고 1시간 동안 배양합니다.

마이크로 피펫을 사용하여 각 튜브에서 운동성 정자가 포함된 hams F 10 배지의 상층 700 µL를 조심스럽게 제거합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 수집한 모든 샘플을 하나의 깨끗한 유리 튜브에 모읍니다. 모아진 샘플 10 µL를 마큘러 카운팅 챔버 베이스의 광학 평면 유리에 떨어뜨린 후 커버 글라스를 덮습니다.

챔버 내부에 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오. 기포가 생기면 세포 수가 부정확하게 측정될 수 있습니다. 20배 대물렌즈가 장착된 복합 현미경으로 관찰하십시오. 마클러 카운팅 챔버(macular counting chamber)의 커버 글라스에는 100개의 작은 정사각형으로 구성된 큰 정사각형이 있습니다.

10개 칸으로 이루어진 임의의 스트립 내 세포 수를 셉니다. 이 수치는 mL당 수백만 개의 세포 농도를 나타냅니다. 추가로 두 개의 10개 칸 스트립에서 세포 수를 세는 과정을 반복하고, 형광 염료로 세포를 염색하기 위해 세 번의 측정값에 대한 평균을 계산합니다.

1.5 mL 원심분리 튜브에 필요한 부피의 정자 현탁액과 최종 농도가 2 µM이 되도록 충분한 양의 1 mM Fluo-3 AM 스톡 용액을 혼합합니다. 37 °C에서 30분 동안 빛을 차단하여 배양한 후, 튜브를 750 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠렛 대신 구름 형태의 층이 형성되면 세포 상태가 양호함을 나타냅니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 펠렛을 적절한 부피의 인간 정자 배양액(Human Sperm Medium, HSM)에 재현탁합니다. 실험을 시작하려면, 바닥이 평평한 유리 튜브에 570 µL의 HSM과 앞서 Fluo-3 AM을 로딩하고 HSM에 재현탁하여 1 × 10⁸ cells/mL 농도가 된 정자 세포 현탁액 30 µL를 혼합합니다.

유리 튜브 안에 마그네틱 스터 바를 넣고, 37 °C로 예열된 분광광도계의 측정 챔버에 튜브를 삽입합니다. 샘플은 데이터 수집 시간 동안 계속 교반되어야 합니다. oli 소프트웨어를 사용하여 실험을 시작하고, 300초 동안 0.5 Hz의 빈도로 형광값을 측정합니다.

30초 동안 기저 형광을 측정한 후, Hamilton 마이크로 시린지를 사용하여 100초 시점에 테스트 화합물을 적절한 부피로 주입합니다. 여기서는 micromolar 농도의 progesterone를 사용하며, 최대 형광 값을 얻기 위해 양성 대조군으로 20 micromolar ionomycin을 사용합니다. 본 실험에서는 세포 내 칼슘 변화를 높은 시간 분해능으로 측정합니다.

급속 반응 광학 시스템과 결합된 SFM 20 stopped flow 믹서를 사용하여, 기기의 주사기 하나에는 HSM에 희석된 3:00 AM 로딩 정자 세포 1 mL를 채우고, 두 번째 주사기에는 테스트할 화합물인 HSM에 용해된 20 µM progesterone 1 mL를 채웁니다.

이 예제에서는 주사기로 액체를 흡입할 때 기포가 형성되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 두 기구의 피스톤을 주사기 플런저의 팁에 닿을 때까지 들어 올리십시오. 세포 손상을 최소화하기 위해 이 경우 총 샘플링 시간을 50 seconds로, 빈도를 10 milliseconds로 설정하고, 측정 가능한 반응 트리거를 제공하는 최소 값으로 유속을 설정하십시오.

시약을 혼합하면, 시간에 따른 원시 형광 추적이 컴퓨터 화면에 표시됩니다. 유세포 분석을 수행하기 전, 프로게스테론 대신 HSM을 음성 대조군으로, 10 $\mu\text{M}$ 이오노마이신을 양성 대조군으로 대체하여 이 절차를 반복하십시오. 테스트할 각 조건에 대해 사이토미터 튜브당 500 $\mu\text{L}$의 세포 현탁액을 넣어 실험 샘플을 준비하십시오.

장비 소프트웨어를 사용하여 실험을 설정하십시오. 먼저 새 폴더, 실험 표본 및 튜브 수를 생성합니다. 그런 다음 flu O 3:00 AM에 적합한 사이토미터 설정을 선택하십시오. 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 프로피듐 아이오다이드 필터를 사용하십시오.

염색하지 않은 대조군 튜브 1과 2를 사이토미터에서 분석합니다. 전방 산란광 및 측방 산란광 데이터를 수집하여 임계값 설정이 적절한지 확인하고, 세포와 세포 부스러기를 구별하기 위한 해당 게이트를 생성합니다. 실험군 튜브를 분석하여 샘플당 10,000개의 이벤트로부터 형광 데이터를 수집합니다.

마지막으로, 분석에 사용할 소프트웨어로 모든 데이터를 내보냅니다. 각 커버슬립 중앙에 poly L lysine 용액 5 µL 한 방울을 떨어뜨려 본 절차에 필요한 원형 커버슬립을 준비합니다.

사용 전 최소 1시간 동안 그대로 둡니다. 이후 처리된 부위를 물로 헹굽니다. 이렇게 하면 과도한 polylysine이 제거되어, 정자 세포의 편모는 여전히 움직일 수 있으면서 머리 부분이 커버슬립에 부착될 수 있습니다. 기록 챔버 내부에 커버슬립을 조립합니다.

10⁷ cells/mL 농도의 flu oh 3:00 AM 로딩 세포 10 µL를 커버슬립 중앙에 분주합니다. 세포 위에 미리 데워둔 HSM 200 µL를 덮어줍니다.

37°C로 예열된 현미경 스테이지 위에 챔버를 놓고 위상차 현미경으로 세포를 관찰합니다. 이미징에 적합한 세포 밀도를 가진 영역을 선택합니다. 세포가 너무 많으면 신호가 겹쳐 분석이 어려워집니다.

세포의 머리 부분이 커버슬립에 단단히 부착되어 있어야 하며, 생존 여부를 확인하기 위해 편모 운동이 나타나야 합니다. 타임랩스 이미지 획득 소프트웨어를 활성화하여 실험을 시작하십시오. 일반적으로 초당 4장의 이미지가 필요하며, 이미지당 조명 시간은 2밀리초로 설정합니다.

라이브 모드에서 형광 이미지를 획득합니다. 초점과 밝기를 조절하십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 테스트 화합물(이 경우 프로게스테론)을 조심스럽게 한 방울씩 첨가하고, 필요에 따라 이미지 획득을 계속하십시오.

동일한 챔버에 두 가지 대조군을 순차적으로 첨가하십시오. 최대 형광을 얻기 위해 20 µM ionomycin을 첨가하고, 최소 형광을 얻기 위해 5 mM manganese chloride를 첨가합니다. IQ 소프트웨어를 사용하여 오프라인으로 이미지 분석을 수행하십시오.

각 세포 또는 세포의 일부분 주변에 관심 영역(ROI)을 지정합니다. 또한, 소프트웨어가 자동으로 배경 감산(background subtraction)을 수행할 수 있도록 세포가 없는 영역을 선택합니다. 그런 다음 각 ROI에 대한 시간별 형광 강도 시리즈를 획득하며, 이 데이터는 추가 분석을 위해 Microsoft Excel로 내보낼 수 있습니다.

프로게스테론(Progesterone)은 알려진 첨체 반응 유도제 중 하나이며, 예상대로 일반적인 형광 측정법으로 측정했을 때 인간 정자의 세포 내 칼슘 농도를 일시적으로 증가시킵니다. 시간에 따른 적색 형광 추적선은 4 µM 프로게스테론 첨가로 인한 세포 내 칼슘 농도 변화를 보여주며, 음성 대조군으로 첨가된 HSM은 청색 형광 추적선에서 나타나듯이 세포 내 칼슘 농도 수준에 아무런 변화를 일으키지 않았습니다. 양성 대조군으로서 10 µM 아이오노마이신(ionomycin)에 의해 유도된 변화가 각 추적선에 표시되어 있습니다.

이 칼슘 이온ophores를 첨가하면 RA 세포 내 칼슘 농도가 최대치로 증가하며, 이는 기저 수준으로 회복되지 않습니다. 이 막대 그래프는 각 조건에서 형광 변화량 delta F의 평균값을 나타내며, N=3일 때의 표준 오차(±)를 함께 표시하였고, 별표(*)는 대조군과 비교하여 P 값이 0.001 미만임을 나타냅니다. 프로게스테론으로 유도된 세포 내 칼슘 농도 증가는 stopped flow fluorometry를 통해 더 높은 시간 분해능으로 측정되었으며, 그 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다.

패널 A에 가공되지 않은 트레이스가 표시되어 있으며, 빨간색 선으로 표시된 progesterone와 파란색 선으로 표시된 ion mycin 모두 세포 내 칼슘 농도의 급격한 증가를 유발했습니다. 녹색 트레이스는 세포를 HSM과 혼합한 음성 대조군입니다. 패널 B는 각 가공되지 않은 신호에서 대조군 신호를 빼서 얻은, progesterone 또는 ion mycin으로 유도된 신호의 보정된 트레이스를 보여줍니다.

프로게스테론은 유도제 첨가 후 2.7초에 최대 형광값이 나타나며 매우 빠르고 일시적인 세포 내 칼슘 농도 증가를 유발했습니다. 반면, CIN은 50초 동안 세포 내 칼슘 농도의 급격하고 지속적인 증가를 유발했습니다. 패널 B의 삽입도는 각 반응의 처음 500밀리초를 확대한 모습입니다.

프로게스테론으로 유도된 세포 내 칼슘 농도 증가에 지연이 없다는 점은 프로게스테론이 중간 신호 전달 과정 없이 칼슘 채널 CatSper를 직접 활성화한다는 이전 보고들과 일치합니다. 유능화된 인간 정자와 비유능화된 인간 정자의 세포 내 칼슘 농도 또한 유세포 분석법을 이용하여 측정하였습니다. 다음은 이에 대한 대표적인 전방 산란 및 측방 산란 도표입니다.

수정 능력을 획득한 세포는 파란색으로, 수정 능력을 획득하지 않은 세포는 빨간색으로 표시되어 있습니다. 선택된 게이트는 파란색 선으로 표시되어 있으며, 해당 영역 내의 세포들만 추가 분석에 사용되었습니다. 패널 B는 염색되지 않은 정자의 Fitzy 채널 형광 히스토그램을 보여주며, 패널 D는 패널 D에서 관찰된 flu oh 3:00 AM 염색 정자의 FZ 채널 형광 히스토그램을 보여줍니다. 파란색 트레이스로 표시된 수정 능력을 획득한 정자의 형광 값 분포는 빨간색 트레이스로 표시된 수정 능력을 획득하지 않은 정자에 비해 더 높은 값으로 이동해 있습니다.

패널 C는 염색되지 않은 세포의 PI 채널 형광 히스토그램을 보여주며, 패널 E는 사멸한 세포의 PI 채널 형광 히스토그램을 보여줍니다. 개별 세포의 형광 값은 여기에 제시된 2차원 형광 도트 플롯에서 확인할 수 있습니다. 염색되지 않은 세포 및 flu oh 3:00 AM과 pi로 이중 염색된 세포의 경우, 각 사분면에서 기록된 세포의 백분율이 빨간색 숫자로 표시되어 있습니다.

중요한 점은, 사멸한 세포에서 발생하는 신호를 제거할 수 있다는 것입니다. 마지막으로, 프로게스테론으로 유도된 단일 정자 세포의 세포 내 칼슘 농도 변화를 이미징을 통해 측정하였습니다. 이 대표적인 유사색(pseudocolor) 이미지들은 프로게스테론, CIN 및 염화 망간 첨가 전과 후의 세포를 시각화하여 보여줍니다. 프로게스테론 첨가는 정자 머리와 루멘 모두에서 세포 내 칼슘 농도의 증가를 유발하며, 염화 망간은 형광을 감소시키는 데 사용됩니다.

소광에 의한 형광 분석 결과, 실험에 사용된 9개 개별 세포의 대표적인 정규화된 형광 추적 곡선이 이 그림에 표시되어 있습니다. 집단 실험에서 관찰된 바와 같이, 단일 세포 분석 결과 progesterone은 일시적인 증가를, ionomycin은 지속적인 증가를 나타냈습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3~4시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때 세포의 생존능력을 확인하고, 절차 완료 후 적절한 대조군 실험을 수행하는 것이 중요합니다. 이후 적절한 용액과 시뮬레이션 프로토콜을 사용하여 칼슘 증가에 관여하는 특정 이온 채널의 식별과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 전기생리학과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 세포 생리학 분야의 연구자들이 높은 공간 및 시간 해상도로 살아있는 세포 내의 칼슘 역학을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후에는, 해결하고자 하는 구체적인 질문에 따라 모든 유형의 세포에서 형광 염료를 이용해 세포 내 칼슘 증가를 측정하기 위한 가장 적절한 기술을 선택하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인간 시료를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 건강 상태가 확인된 기증자의 시료를 사용하는 것과 같은 예방 조치가 필요함을 잊지 마십시오. 또한 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 라텍스 장갑을 착용하고, 용액 및 재료를 적절하게 폐기해야 합니다.