Name: 세포 내 칼슘 측정 2 + 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: 학습하세요 형광 염료를 이용한 정자 내 칼슘 변동 측정 방법을 통해 생식 생물학 연구를 수행하는 기법입니다. 이 민감한 기술은 프로게스테론 및 capacitation 영향 분석에 활용됩니다.

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저자는 기술 지원 호세 루이스 드 라 베가, 에리카 Melchy 박사 타쿠야 Nishigaki 감사합니다. Dirección 일반 드 Asuntos 델 개인 Académico / 국립 대학교 AUTONOMA 드 멕시코 (CT에 IN202212-3),이 작품은 Consejo 나시 오날 드 Ciencia Y Tecnología (CONACYT-멕시코) (CT에 99333 및 128566)에 의해 지원되었다.

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우리는 공개 아무것도 없어.

세포 내 신호는 대부분의 세포 활동을 위해 매우 중요합니다, 칼슘 2 + 수명주기의 끝에, 수정의 기원에서 자신의 전체 수명에 걸쳐 포유 동물 세포와 함께 유비쿼터스 메신저이다. 다른 자극에 대한 응답으로, [칼슘 2 +] 나는 증가, 발진 및 시공간적 화와 감소, 따라서, 다양한 프로세스가 활성화됩니다, 변조 또는 칼슘 2 + 인코딩 메시지가 종료되었습니다. 내 Ca 2 +이 이온 신호 전달 과정의 복잡한 오케스트레이션에 포함되는 역학, 정자의 생리에 매우 중요하다. 이러한 칼슘의 지식 + 변동 해독 칼슘 2 + 참여 채널, 뚜렷한 신호 계곡에서의 특정 역할의 분자 식별 할 수 있습니다. 칼슘 2 +에 민감한 형광 염료는 민감도와 특이도가 매우 높은 칼슘 2 + M을 가능하게 그들을 연구하는 강력한 도구를 구성살아있는 세포의 농도 변화를 추적하는 데 ...

칼슘 2 + 진핵 세포의 신호 전달 경로의 보편적 인 두 번째 메신저이다. 내 Ca 2 +은 (칼슘 2 + I) 흥분과 비 흥분성 세포 모두에서 많은 근본적인 생리적 인 과정의 조절에 참여하고 있습니다. 칼슘의 중요성과 보편성 + 두번째 메신저와 같은 신호 전달 이벤트 기간 동안은 세포 내에서 정보의 전송에있는 그것의 시공간적 다양성에서 파생됩니다. 칼슘 2 + 드 노보 또는 세포의 세포 내 농도 ([칼슘 2 +] i) 내에서 분해 합성 할 수없는 서로 다른 세포 지속적으로 버퍼, 격리한다는 구획화하는 메커니즘 및 /를 통해 매우 엄격한 한계 내에서 유지되거나 칼슘을 축적하는 동안 +. 이 이온의 농도의 변화는 세포 1 ~ 매우 지역화 된 지역에서 발생하고 그러한 변동을 해독하는 데 확보를 위해 필수적입니다 수 있습니다신호 메커니즘 (1) 자신의 역할, (2) 자신의 생리적 중요성 및 세포 신호 (3) 일반 기계 장치의 EPER 이해. 칼슘 2 + - 매개 신호 정자 생리학이 특히 중요하다. 정자의 운동성은 수정의 성공을 위해 가장 중요한 기능 중 하나이며, 실제로 여러 정자 운동성 결함 불임 3-5가 발생할 수 있습니다. + 편모 운동에 칼슘의 중요성은 긴 6 인식되고 있지만, 칼슘 2 + 편모 굴곡의 특정한 모양을 제어하는 방법의 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 계란 융합하기 전에 정자가 capacitation, 여성의 요로 안에 정자 거주지에 따라 복잡한 과정을 거쳐야합니다. capacitation 동안 정자 세포막의 지질 구조와 조직은 주로 세포막에서 콜레스테롤 제거의 결과로 수정됩니다. 또한, 여러 가지 단백질 티로신 형광체 있습니다7 ylated. 중요한 것은, capacitation 동안이 세포 내 pH가 증가 (산도 I)과의 [칼슘 2 +] i를하고 막 잠재력은 어떤 종 2 hyperpolarizes. Capacitation는 정자 (20-40%)의 모집단에서 발생하고, 이러한 모든 세포 변화에 관여하는 메커니즘은 명확 멀리 있습니다. 그것은 일반적으로 생리 인덕터에 노출되었을 때 capacitated 정자 만 모집단이 첨 반응 (AR)을 받아야하는 허용됩니다. AR은 (외부 및 내부 점막과 전문 소기관) 첨을 가진 모든 종에서 수정에 필요한 칼슘 2 + 조절 이벤트입니다. 이 과정에서 정자의 세포막과 외부 acrosomal 막 퓨즈, 정자 세포 달걀 (투명대 또는 ZP)를 둘러싼 글리코 단백질 성 매트릭스에 침투 할 수 있도록 가수 분해 효소를 방출. AR은 또한 상호 작용하는 새로운 fusogenic 정자 세포 표면에 노출두 배우자의 최종 융합 계란 원형질막. AR, 프로게스테론은 가장 그들 가운데 연구 중 하나 인 유도 여러 세포 리간드가 있습니다. 이 작품에서 우리는 측정하는 칼슘 2 +에 민감한 형광 염료의 사용과 관련된 네 가지 기술을 제시 [칼슘 2 +] 나는 황체 호르몬에 의해 트리거 인간의 정자의 변화 (우리는 [칼슘 2 측정하는 유동 세포 계측법을 제외 + ] 내가) 체외 capacitation 프로세스 중에 유도 증가한다. 이 특정한 경우에 우리가 사용하는 플루오을 오전 3시 (생활 기술, 그랜드 아일랜드, NY)와 막 투과성 염료 K D = 325 nm의. 체외에서 우리는 방법 세 가지와 시간의 함수로 형광 변화를 감시, 그리고 네 번째 기술로 우리는 시간에 하나의 주어진 시점에서 형광 값을 측정 하였다. 모두 그들은 공간과 시간적 해상도를 제공 이후 서로 다른 접근 방법은 서로를 보완단일 세포와 세포 인구 수준 모두에서 olution. 세포 인구 또는 대량 실험 그들은 잘 설립, 간단하고, 하나의 실험에서 세포의 수백만에서 수행되는 측정에서 정보의 평균화 수 있기 때문에 그들이 필요로하는 악기도 쉽게 사용할 수 있지만, 때문에 대량 기술이 광범위하게뿐만 아니라 사용됩니다. 기술 # 1. 기존 Fluorometry 이 기술은 시간의 함수로 형광의 변화를 모니터링, 실험은 200 ~ 1,000 μL에 이르기까지 샘플 볼륨이 유리 큐벳에서 수행됩니다. 추가 시약의 적절한 혼합은 자기 교반이 필요하며, 얻어진하므로 시간적 해상도 (초)의 순서입니다. 분석 시료의 전형적인 세포 농도 범위는 10 5 -10 8 세포 / ㎖이다. 기술 # 2. 정지 흐름 Fluorometry 티그의 기술은 또한 시간의 함수로 형광의 변화를 감시하지만, 시약을 매우 작은 샘플 볼륨 (25-100 μL에 이르기까지)를 포함하는 기록 베트로 (사용 압력) 함께 혼합된다. 따라서 시약의 균질화 (밀리 초)의 순서에서 높은 시간적 해상도를 가능하게 순간이다. 결과 형광 대 시간 트레이스의 분석은 분석 시료의 일반적인 세포 농도 범위는 짧은 반응 중간체 등에 대한 정보를 얻는 반응 메커니즘의 복잡성을 해명, 반응 속도를 결정하기에 적합한 10 5 -10 7 세포 / ML. 단일 세포 실험 대량 실험은 세포의 큰 숫자의 평균 행동을보고 있지만, 인구는 자주 측정과 같은 유형의 동안 간과 이종 특성을 보일 수 있습니다. 단일 세포 기술은 따라서 일을 보완하는 데 사용됩니다전자 정보는 세포 인구의 실험을 얻었다. 기술 # 3. 유동 세포 계측법 단일 세포 측정에서 발생하는 정보의 중요성에도 불구하고, 그것은 전체 인구 세포 특정 속성의 잘못된 추정을 방지하기 위해 세포의 큰 숫자를 분석하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로, 높은 처리량 기법을 선호하고 가장 인기있는 방법은 조건 10,000 세포가 종래 분석하는, 유동 세포 계측법이다. 그것의 크기 (전방 산란 (FSC)), 단위 (사이드 분산 형 (SSC)) 및 형광 강도 (항체 특정 라벨, 생존 마커 등)에 따라 세포를 분류이 방법은 이기종 인구의 다중 매개 변수 분석을 가능하게 따라서 셀 그룹에 대한 매개 변수 &#39;유통에 대한 정보를 제공한다. 유동 세포 계측법 오히려 시간에 따른 정보 8보다 인스턴트를 제공합니다. 앞으로 측면 산란 값 AR세포를 포함하지만, 형광 측정, 부정과 긍정적 인 형광 컨트롤의 세포 파편, 먼지 등을 차별 게이트를 선택하는 유용 E도 포함되어야합니다. 두 개 이상의 형광 채널을 사용하는 경우, 보상으로 알려진 과정 (자세한 내용은 참조를 위해 수행해야 <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp을</a> ). 보상 형광체 사이에 스펙트럼 중복 차별 할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은의 propidium 요오드 염색에 의해 일반적으로 죽은 세포의 차별을 할 수 있습니다. 기술 # 4. 단일 셀 이미징 현미경 단일 세포의 행동을 연구하는 또 다른 일반적인 방법입니다, 그것은 잘 시간에 따른 연구에 적합하고 또한 공간 해상도를 제공합니다. 주요 단점은 높은 처리량 분석은 현 시점에서 초기 단계에 유일한 것입니다 <s9&gt;까지.

<table><tbody><tr><td>Ham's F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물 약. 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Makler Counting Chamber</td><td>SEFI Medical Insruments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 바이알/50 &mu; g 각</td></tr><tr><td>이오노마이신</td><td>알로몬</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S-9888</td><td>인간 정자 배지(HSM)용 시약</td></tr> <tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>P-3911</td><td>인간 정자 배지(HSM)중</td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>JT 베이커</td><td>3506</td><td>시약 인간 정자 배지 (HSM) 용염화</td></tr><tr><td>마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>인간 정자 배지 (HSM) 용 시약무</td></tr><tr><td>수 염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>인간 정자 배지 (HSM) 용 시약</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>인간 정자 배지 (HSM) 용 시약</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>인간 정자 용 시약 매체 (HSM)</td></tr> <tr><td>나트륨 피루브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>P-2256</td><td>인간 정자 배지 (HSM) 용 시약</td></tr><tr><td>나트륨 L- 젖산 나트륨 (약 99 %)</td> <td>시그마-알드리치</td><td>L-7022</td><td>인간 정자 배지 (HSM) 용 시약프로</td></tr><tr><td>피듐 요오드 </td><td>인비트로겐</td><td>L-7011</td><td>구성 요소 B</td></tr><tr><td>트리톤 X-100 (t-옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올)</td> <td>시그마- 알드리치</td><td>X-100</td><td>2.4 mM 용액 물 속에서 </td></tr><tr><td>원형 커버 슬립 </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>25mm 직경</td></tr><tr><td>폴리 -L- 라이신 용액 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>염화망간</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor; 세포 챔버, 현미경 검사용</td><td>Life Technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 fluorometry은 흐름 fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

정자, 특히 도달 인식하고 계란 융합 디자인 남성의 생식 세포 수 있습니다. 이 작업을 수행하려면, 정자 세포는 끊임없이 변화하는 환경에 직면하고 여러 개의 물리적 장벽을 극복 할 준비를해야합니다. transcriptionally 및 translationally 침묵하는 본질이기 때문에, 이러한 운동성이있는 세포는 방향 자체에 다양한 신호 전달 메커니즘에 깊이 의존하고 지시 패션에서 수영을하고, 계란을 찾기 위해 자신의 여행을하는 동안 환경 조건을 도전에 맞설 수 있습니다. 특히 칼슘 2 + - 매개 신호는 여러 정자 기능에 필수적이다 : 운동, capacitation (첨 반응 정자를 준비하는 복잡한 과정)과 첨 반응 (정자 - 난자의 융합을 할 수 exocytotic 이벤트)의 활성화. 이 이온의 세포 내 변화를 추적 할 수있는 형광 염료를 사용하는 응용 프로그램, 감도의 용이성으로 인해 현저한 중요성과 DET의 다양성ection. 하나의 염료 로딩 프로토콜을 사용하여 우리는 정자의 칼슘 2 + 역학을 모니터링하는 네 가지 형광 기술을 사용합니다. 각 기술은 모두 하나의 세포와 세포 인구 수준에서 데이터를 생성, 공간 및 / 또는 시간적 해상도를 가능하게 독특한 정보를 제공합니다.

<img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> 그림 1. 스 윔업 방법으로 정자 샘플 준비를위한 실험 프로토콜입니다. 운동성 정자의 분리와 그 농도 조정을위한 주요 단계의 개략적 인 다이어그램이 설명된다. capacitation이 필요한 경우 마지막 부화 단계는 수행됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig2.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50344...

세포 내 칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt; 역학 정자 생리학 및 캘리포니아에 매우 중요하다<sup&gt; 2 +</sup&gt; 민감한 형광 염료를 연구하는 다양한 도구를 구성합니다. 인구 실험 (fluorometry 및 흐름 fluorometry 중지) 및 단일 세포 실험 (유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징) 시공간적 [CA를 추적하는 데 사용됩니다<sup&gt; 2 +</sup인간의 정자 세포의&gt;] 변경됩니다.

세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

본 절차의 전반적인 목표는 형광 염료를 사용하여 인간 정자의 세포 내 칼슘 변동을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 swim up법으로 정자 샘플을 준비하고, 필요한 경우 capacitation을 촉진함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 정자에 칼슘 형광 염료를 로딩하는 것입니다.다음으로, 일반적인 형광 측정법, 정지 유동 형광 측정법, 유세포 분석법 또는 단일 세포 이미징을 사용하여 실험을 수행하고 칼슘 측정값을 기록합니다. 최종적으로, 프로게스테론에 의해 유도되거나 수정능 획득 과정 중에 발생하는 세포 내 칼슘 농도의 변화를 결정하기 위해 결과를 분석합니다. 방사능을 이용하는 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 매우 민감한 절차라는 점입니다.이 방법은 안전하고 수행하기 쉽습니다. 이 방법은 높은 공간 및 시간 분해능으로 세포 내 칼슘 증가를 유도하는 화합물의 식별이나, 단일 샘플 내의 서로 다른 세포 하위 집단 식별과 같이 SPR 칼슘 신호 전달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 유세포 분석법을 사용하는 것은 남성 배우자의 생리적 상태 분석을 통한 가임력 문제 진단으로까지 그 활용 범위가 확장됩니다.이 방법은 인간 정자의 칼슘 동원 연구에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다른 종의 수컷 배우자나 뉴런 또는 근육 세포와 같은 다른 유형의 세포에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 사용하는 경우 정자 취급이 쉽지 않고, 실험 과정 전반에 걸쳐 생존력과 운동성을 가진 세포를 얻기 위해 적절한 조건을 유지하는 것이 중요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 연구진은 서로 다른 분야의 전략들을 결합하여 이러한 기술들의 활용을 구현하였습니다.시료의 준비와 취급, 그리고 화합물의 첨가 과정에서 정자 세포가 손상될 수 있고 화합물 처리 중에 반응에 인위적인 결과(artifact)가 나타날 수 있어 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 정자 시료를 준비하려면, 액상 정액 500 microliter 위에 hams F 10 배지 1 milliliter를 조심스럽게 층이 지도록 쌓아야 합니다. 마이크로 피펫 팁으로 튜브 벽면을 살짝 터치하여 시료 위로 배지를 천천히 분주하십시오.시료층과 배지층이 섞이지 않도록 천천히 수행하는 것이 매우 중요합니다. 배지에는 2mM calcium chloride와 5mg/mL BSA가 첨가되었습니다. 체외에서 수정을 위한

measuring-intracellular-ca2-changes-human-sperm-using-four-techniques

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

현재 사용 가능한 대부분의 칼슘 지표는 배양된 평활근 세포의 근 소포체에서 방출된 칼슘의 간접적인 측정으로 세포질 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 sarcoplasmic reticulum lum lumen 내에서 칼슘 신호를 직접 측정할 수 있는 특정 FRET 기반 지표의 사용을 설명합니다.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

여기, 우리는 spermatozoan 막 무결성, 정자의 수정 능력와 관련 된 세포 기능을 평가 하는 방법론을 제시. 우리 정자 세포 막의 fluorimetric 평가 대 한 세 가지 기술에 설명: 특정 형광 프로브, 형광 현미경 검사 법, 그리고 고급 정자 전용 cytometry 동시 얼룩. 방법론을 결합의 예제도 제공 됩니다.

정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법

여기, 캘리포니아2 +에 효과의 평가 대 한 두 개의 중간 처리량 분석-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응 같습니다. 이 분석 실험은 신속 하 고 쉽게 화면에 캘리포니아2 +효과 대 한 화합물의 큰 금액을 사용할 수 있습니다-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응.

매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응

이 프로토콜은 이온 채널 활동을 직접 기록하는 것을 목표로 전체 세포 구성에서 포유류 정자 세포의 전기 기록을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 정자 이온 채널의 전기 생리학적 프로파일을 설명하는 데 중요한 역할을 했으며 분자 정체성과 조절을 밝히는 데 도움이 되었습니다.

포유류 정자 세포의 원형질막을 가로지르는 전기 전류 기록

본 프로토콜은 단일 세포분석기로 인간 정자의 세포사멸, 미토콘드리아 막 전위 및 DNA 손상을 측정할 수 있는 실용적인 솔루션을 제공합니다.

인간 정자의 기능적 결함을 검출하기 위한 바이오마커의 유세포 분석

여기에 설명된 AcroSensE 마우스 모델 및 살아있는 세포 이미징 방법은 정자 아크로솜의 세포 내 구획에서 칼슘 역학을 연구하고 막 융합 및 아크로솜 엑소사이토시스로 이어지는 중간 단계를 조절하는 방법을 연구하는 새로운 접근 방식을 제공합니다.

실시간 이미징 of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

이 논문에서는 Fura-2/AM 염료를 사용한 단일 세포 Ca2+ 이미징을 사용하여 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 실시간으로 정량적으로 모니터링하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 효율적인 염료 로딩과 형광 강도 비율을 통한 Ca2+ 수준의 정확한 계산을 가능하게 하여 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 제공합니다.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

학습하세요 형광 염료를 이용한 정자 내 칼슘 변동 측정 방법을 통해 생식 생물학 연구를 수행하는 기법입니다. 이 민감한 기술은 프로게스테론 및 capacitation 영향 분석에 활용됩니다.

세포 내 칼슘 측정

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