세포 내 칼슘 측정 ^{2 +} 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

이 절차의 전반적인 목표는 형광 염료를 사용한 인간 정자의 세포 내 칼슘 변동을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 스윔업 방법으로 정자 샘플을 준비하고 필요한 경우 용량을 촉진함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 정자에 칼슘 형광 염료를 주입하는 것입니다.

다음으로, 기존의 형광 측정법, 유동 형광 분석, 유세포 분석 또는 단일 세포 이미징을 사용하여 실험을 수행하고 칼슘 측정을 기록합니다. 궁극적으로, 프로게스테론에 의해 유발되거나 용량 형성 과정 중에 유발되는 세포 내 칼슘 농도의 변화를 결정하기 위해 결과를 분석합니다. 방사능과 관련된 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이것이 매우 민감한 절차라는 것입니다.

안전하고 수행하기 쉽습니다. 이 방법은 세포 내 칼슘을 유도하는 화합물의 식별, 높은 공간 및 시간 해상도로 증가, 시멘 샘플에서 다양한 세포 하위 집단의 식별과 같은 SPR 칼슘 신호 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 유세포 분석 기법 사용의 의미는 남성 요계의 생리학적 상태 분석을 통한 생식 능력 문제 진단으로 확장됩니다.

이 방법은 인간 정자의 칼슘 동원 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 종의 남성 간과 같은 다른 유형의 세포나 뉴런이나 근육 세포와 같은 다른 유형의 세포에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 사용하는 개인은 정자 처리가 쉽지 않고 실험을 통해 생존 가능한 운동 세포를 얻기 위해 적절한 조건을 유지하는 것이 중요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 우리는 서로 다른 분야를 사용하는 전략을 결합하여 이러한 기술의 사용을 구현했습니다.

이 방법의 시각적 시연은 샘플의 준비 및 취급뿐만 아니라 화합물의 첨가는 절차 중에 정자 세포가 손상될 수 있고 화합물의 편집 중에 반응의 아티팩트를 얻을 수 있기 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 정자 샘플을 준비하려면 각 500마이크로리터의 액화 정액 위에 1ml의 햄 F 10 배지를 조심스럽게 겹쳐 놓아야 합니다. Eloqua, 마이크로 피펫 끝으로 튜브 벽을 만지고 샘플 위에 매체를 부드럽게 분배합니다.

샘플과 중간 층이 혼합되지 않도록 천천히 수행하는 것이 중요합니다. 배지에는 2밀리몰의 염화칼슘과 BSA 밀리리터당 5밀리그램이 보충됩니다. in vitro에서 정전력을 높이려면 튜브를 약 30도 각도로 조심스럽게 기울이십시오.

이렇게 하면 두 액체 사이의 표면적이 증가하여 배양 중에 샘플에서 배지로 정자 세포의 변위 또는 수영이 향상됩니다. 다음으로, 린(Lean) 시험관을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터 안에 넣습니다. 1 시간 후 1 시간 동안 95 % 공기.

마이크로 피펫을 사용하여 각 튜브에서 현재 motil spermatozoa가 들어있는 hams F 700 매체의 상위 10 마이크로 리터를 조심스럽게 제거합니다. 수집된 모든 샘플을 하나의 깨끗한 유리관에 모아 기포 형성을 방지합니다. 10마이크로리터의 풀링된 샘플을 황반 계수 챔버 베이스의 광학 평면 유리에 놓고 커버 유리를 놓습니다.

챔버 내부에 기포가 형성되면 세포 수가 부정확해질 수 있으므로 피하십시오. 20 x 대물렌즈가 장착된 복합 현미경으로 관찰합니다. 황반 계수실의 덮개 유리에는 100개의 작은 사각형으로 구성된 큰 사각형이 있습니다.

10개의 사각형으로 구성된 스트립에 있는 셀을 계산합니다. 이 숫자는 밀리리터당 수백만 개의 세포에서 세포 농도를 나타냅니다. 두 개의 추가 10 제곱 스트립에서 계수를 반복하고 형광 염료로 세포를 로드하기 위해 세 카운트의 평균을 계산합니다.

1.5 밀리리터 fuge 튜브에 필요한 양의 정자 현탁액을 충분한 1 밀리 몰 독감 오 3:00 AM 재고 용액과 결합하여 2 마이크로 몰 독감 오 3:00 AM의 최종 농도를 얻습니다 섭씨 37 도에서 30 분 동안 배양하고 5 분 동안 750 G에서 튜브를 광 원심 분리로부터 보호합니다. 펠릿이 아닌 구름이 형성된다는 것은 세포의 상태가 양호하고, 상층액을 흡인 및 폐기하고, 펠릿을 적절한 부피의 인간 정자 배지 또는 HSM에 재현탁한다는 것을 나타냅니다. 이 실험을 시작하려면 평평한 바닥 유리관에 570마이크로리터의 HSM과 30마이크로리터의 정자 세포 현탁액을 이전에 독감으로 로드하고 HSM에 재현탁액을 결합하여 밀리리터당 10에서 8번째 세포의 1배를 얻습니다.

유리관 내부에 자기 교반 막대를 놓고 섭씨 37도로 예열된 분광계의 판독 챔버에 튜브를 삽입합니다. 시료는 수집 시간 내내 교반해야 합니다. oli 소프트웨어를 사용하여 실험을 시작하고 300초 동안 0.5Hz의 주파수에서 형광 값을 획득합니다.

30초 동안 기초 형광을 얻은 후 Hamilton Micro 주사기를 사용하여 100초에 미세몰 프로게스테론에 대해 적절한 양의 테스트 화합물을 주입합니다. 20 마이크로 몰 이온 마이신을 양성 대조군으로 사용하여 최대 형광 값을 얻습니다. 이 실험에서는 세포 내 칼슘 변화를 높은 시간 해상도로 측정합니다.

광견병동 역학 광학 시스템에 연결된 SFM 20 정지 흐름 혼합기를 사용하여 기기 주사기 중 하나에 독감 1ml를 채웁니다. 오전 3:00에 장전된 정자 세포와 두 번째 주사기에 테스트할 화합물 1ml를 채웁니다. HSM에 용해된 20마이크로몰 프로게스테론.

이 예에서는 액체를 주사기로 끌어들이는 동안 기포 형성을 피하는 것이 중요합니다. 두 기구 피스톤이 실린지 플런저의 끝에 닿을 때까지 들어 올립니다. 이 경우 총 샘플링 시간을 50초로, 주파수를 10밀리초로 설정하여 셀 손상을 최소화하고, 측정 가능한 응답 트리거를 제공하는 최소값으로 유속을 설정합니다.

시약의 혼합, 원시 형광 대 백리향의 흔적이 컴퓨터 화면에 표시됩니다. 유세포분석 전에 프로게스테론을 HSM을 음성 대조군으로, 10마이크로몰 이온 마이신을 양성 대조군으로 교체하는 이 절차를 반복합니다. 테스트할 각 조건에서 세포분석기 튜브당 500마이크로리터의 세포 현탁액을 배치하여 실험 샘플을 준비합니다.

장비 소프트웨어를 사용하여 실험을 설정합니다. 먼저 새 폴더, 실험 표본 및 튜브 수를 만듭니다. 그런 다음 O 3:00 AM 독감에 대한 적절한 세포 분석기 설정을 선택합니다. 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 프로피듐 요오드화물 필터를 사용합니다.

세포분석기에서 염색되지 않은 control tube 1과 2를 실행합니다. 전방 및 측면 산란 데이터를 수집하여 임계값 설정이 적절한지 확인하고 세포에서 파편을 구별하기 위해 해당 게이트를 생성합니다. 실험용 튜브를 실행하고 10, 샘플당 000개의 이벤트에서 형광 데이터를 수집합니다.

끝에. 모든 데이터를 분석에 사용할 수 있는 소프트웨어로 내보냅니다. 각 커버 슬립의 중앙에 5마이크로리터의 폴리 L 라이신 용액을 떨어뜨려 이 절차에 필요한 원형 커버 슬립을 준비합니다.

사용하기 최소 1시간 전에 그대로 두었다가 처리된 부위를 물로 헹굽니다. 이렇게 하면 과도한 폴리리신이 제거되고 편모가 계속 움직일 수 있는 동안 정자 세포가 머리에서 미끄러지는 덮개에 부착할 수 있습니다. 커버 슬립을 녹음실 내부에 조립합니다.

10 마이크로 리터의 독감 오 3:00 AM로드 된 세포를 1 곱하기 10의 농도로 1 밀리리터 당 7 번째 세포에 놓습니다. 커버 슬립의 중앙에. 200마이크로리터의 사전 예열 HSM으로 셀을 덮습니다.

챔버를 현미경의 스테이지에 놓고 섭씨 37도로 예열하고 위상차를 사용하여 셀을 봅니다. 세포 밀도가 이미징에 적합한 영역을 선택합니다. 셀이 너무 많으면 중복되는 신호로 인해 분석이 어렵습니다.

세포는 머리로 덮개 슬립에 단단히 부착되어야 하지만 편모 움직임을 보여 생존 능력을 확인합니다. 시계열 이미지 획득 소프트웨어를 활성화하여 실험을 시작합니다. 일반적으로 초당 4개의 이미지가 필요하며 이미지당 2밀리초의 조명이 필요합니다.

라이브 모드에서 형광 이미지를 획득합니다. 초점과 밝기를 조정합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 이 경우 테스트 화합물 프로게스테론을 조심스럽게 적가하고 필요에 따라 이미지 획득을 계속합니다.

동일한 챔버에 두 개의 순차적 제어 추가를 수행합니다. 최대 형광을 얻기 위해 20 마이크로몰 이온 마이신을 사용하고 최소 형광을 얻기 위해 5 밀리몰 망간 클로라이드를 얻습니다. IQ 소프트웨어를 사용하여 오프라인으로 이미지 분석을 수행합니다.

각 셀 또는 셀의 일부 주위에 관심 영역 또는 ROI를 그립니다. 또한 소프트웨어에 의한 자동 배경 빼기를 위해 셀이 없는 영역을 선택합니다. 그런 다음 각 ROI에 대해 시간 형광 강도 시리즈를 얻고 이러한 데이터를 추가 분석을 위해 Microsoft Excel로 내보낼 수 있습니다.

프로게스테론은 알려진 아크로솜 반응 유도 물질 중 하나이며, 예상대로 기존 형광 측정법으로 측정한 바와 같이 인간 정자에서 일시적인 세포 내 칼슘 농도 증가를 유발합니다. 적색 형광 미량 대 시간은 음성 대조군 HSM으로 4개의 마이크로몰 프로게스테론의 첨가로 인한 세포 내 칼슘 농도 변화를 보여주며, 이는 청색 형광 미량이 양성 대조군으로 표시된 바와 같이 세포 내 칼슘 농도 수준의 변화를 일으키지 않았습니다. 10 마이크로몰 이온 마이신에 의해 유도된 변화는 각 트레이스에 대해 표시됩니다.

이 칼슘 이오노포어를 추가하면 최대 RA 세포 칼슘 농도가 증가하여 기저 수준으로 돌아가지 않습니다. 이 막대 그래프는 각 조건에서 형광 델타 F의 평균 변화를 보여주며, 여기서 N은 3이고 별표는 대조군과 비교하여 0.001 미만의 P 값을 나타냅니다. 프로게스테론에 의한 세포 내 칼슘 농도 증가는 중단된 흐름 형광 측정법에 의해 더 큰 시간 분해능으로 측정되었으며 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.

원시 흔적은 패널 A에 표시되며, 빨간색 선으로 표시되는 프로게스테론과 파란색 선으로 표시되는 이온 마이신은 모두 세포 내 칼슘 농도를 급격히 증가시켰습니다. 녹색 흔적은 세포가 HSM과 혼합된 음성 대조군입니다. 패널 B는 프로게스테론 또는 이온 마이신으로 유도된 신호에 대한 수정된 트레이스를 보여주며, 해당 원시 신호에서 제어 신호를 빼서 얻었습니다.

프로게스테론은 매우 빠르고 일시적인 세포 내 칼슘 농도 증가를 일으켰으며, 인덕터 첨가 후 2.7초 후에 최대 형광 값이 발생했습니다. 반면에, CIN은 50초 동안 빠르고 지속적인 세포 내 칼슘 농도 증가를 일으켰습니다. 패널 B의 삽입은 각 응답에 대한 처음 500밀리초의 확장된 보기를 보여줍니다.

프로게스테론이 유도한 세포 내 칼슘 농도 증가가 지연되지 않는 것은 프로게스테론이 중간 신호 전달 없이 칼슘 채널 고양이 박차를 직접 활성화한다는 것을 시사하는 이전 보고서와 일치합니다. 세포 내 칼슘 농도는 또한 유세포 분석을 사용하여 용량 및 비용량 인간 정자에서 측정되었습니다. 이러한 대표적인 전방 및 측면 산점도에서.

용량화된 셀은 파란색이고 용량이 없는 셀은 빨간색입니다. 선택한 게이트는 파란색 선으로 표시되며 해당 영역 내의 셀만 추가 분석에 사용되었습니다. 패널 B는 염색되지 않은 정자(unstained, spermatozoa)의 Fitzy 채널의 형광 히스토그램을 보여주고, 패널 D는 패널 D에서 관찰된 바와 같이 독감 oh 3:00 AM 염색된 정자(stained spermatozoa)의 FZ 채널의 형광 히스토그램을 보여줍니다. 파란색 흔적으로 표시되는 용량성 정자에 대한 형광 값의 분포는 빨간색 흔적으로 표시되는 비용량성 정자에 비해 더 높은 값으로 이동합니다.

패널 C는 염색되지 않은 세포의 PI 채널에 있는 형광 히스토그램을 보여주고, 패널 E는 죽은 세포의 PI 채널에 있는 형광 히스토그램을 보여줍니다. 각 개별 세포에 대한 형광 값은 여기에 표시된 2차원 형광 점도표에서 관찰할 수 있습니다. 염색되지 않은 세포와 독감 oh 3:00 AM 및 pi로 이중 염색된 세포의 경우 각 사분면에 기록된 세포의 비율은 빨간색 숫자로 표시됩니다.

중요한 것은 죽은 세포에서 발생하는 신호를 제거할 수 있다는 것입니다. 마지막으로, 프로게스테론에 의해 유도된 세포 내 칼슘 농도 변화는 프로게스테론, CIN 및 염화망간 첨가 시작과 후에 시각화된 세포를 보여주는 이러한 대표적인 의사 색상 이미지를 이미징하여 단일 정자 세포에서 측정되었습니다. 프로게스테론을 첨가하면 세포 내 칼슘 농도가 증가하며, 정자 머리와 염화 망간 모두에서 독감을 줄이는 데 사용됩니다.

Oh 3:00 AM 담금질에 의한 형광, 실험에서 나온 9개의 개별 세포의 대표적인 정규화된 형광 흔적이 이 그림에 나와 있습니다. 집단 실험에서 관찰된 바와 같이, 단세포 분석은 프로게스테론과 이온 마이신에 대해 각각 일시적 및 지속적인 증가를 보여주었습니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 3-4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 세포의 생존 능력을 확인하고 이 절차에 따라 적절한 제어를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 전기 생리학과 같은 다른 방법은 개발 후 proppe 솔루션 및 시뮬레이션 프로토콜을 사용하여 칼슘 증가와 관련된 특정 이온 채널의 식별과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 세포 생리학 분야의 연구자들이 높은 공간 및 시간 해상도로 살아있는 세포의 칼슘 역학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 답변하고자 하는 특정 질문에 따라 모든 유형의 세포에서 형광 dy를 사용하여 세포 내 칼슘 증가를 측정하는 데 가장 적합한 기술을 선택하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 시멘 샘플로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 건강이 입증된 기증자를 사용하는 것과 같은 예방 조치가 필요할 수 있음을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 시술 중 라텍스 글로브를 사용하고 용액 및 재료를 적절하게 폐기해야 합니다.