Name: 정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 배우세요 정자 세포 막의 형광 탐침법을 이용한 정밀 평가 기법으로, 형광 현미경 및 유세포 분석을 활용하여 수정 능력과 정액 품질을 정확히 예측하는 방법입니다.

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저자는 그들의 도움과 협력, 양 리 나 (IMV 기술, L'Aigle, 프랑스) 계기 설치 및 훈련에 대 한 인공 수정 및 번 식 (Hafetz 임, 이스라엘)에 대 한 "수도회" 이스라엘 회사를 감사 하 고 싶습니다.

모든 실험 동물 복지에 대 한 1994 이스라엘 지침에 따라 수행 했다. 소 정자 인공 수정 및 번 식에 대 한 상업 이스라엘 회사에 의해 공급 되었다. 11 시카고 불스의 ejaculates이이 연구에서 평가 했다.
1. 정자 샘플 준비
참고: 절차는 로스 연구소의 프로토콜1,3를 기반으로 합니다.
<ol><li>실 온에서 15 mL 튜브에 황소 정액의 약 1-6 mL를 얻을.</li>
	<li>정액의 각 1 ml, 6 mL (37 ° C)에서 prewarmed NKM 버퍼 (110 m m NaCl, KCl, 5mm [3-N-morphilino propanesulfonic 산, pH 7.4] 20mm MOPS)의 추가 하 고 원심 600 x g, 8 분 1-2 회는 상쾌한 때까지 명확 합니다. 참고: 있다면 정자 농도 또는 초기 볼륨 매우 높은 첫 번째 세척에 2 개의 관으로 분할.</li>
	<li>즉시 제거 하 고 맑은 상쾌한 삭제 펠 릿 위에 상쾌한의 대략 1 cm를 두고.</li>
	<li>조심 스럽게 기대를 수영 하 고 37 ° c.에 수영 정 충 수 있도록 20-30 분을 기다려 하 정자에 대 한 표면 영역을 증가 30 ° 각도로 튜브 참고: 탁도 볼 수 있습니다.</li>
	<li>micropipette 신중 하 게 사용 하 여, 새로운 1.5 mL 튜브에 운동 정 충을 포함 하는 상쾌한의 상단 1 mL를 제거 합니다.</li>
	<li>37 ° C에서 사용까지 정자를 유지.</li>
	<li>Neubauer hemocytometer를 사용 하 여 정자 수를 견적 한다. 참고: 다른 세 상공 대신, 사용할 수 있습니다 하지만 계산 하는 것은 다르다.<ol>
<li>정자 움직임을 방지 하기 위해, 두 배 증류수 (DDW) (1: 100 희석) 15 mL 튜브에 10 mL와 함께 운동 정 충의 100 µ L를 희석 하 고 부드럽게 혼합 합니다.</li>
		<li>Hemocytometer coverslip의 각 측에 10 µ L의 샘플을 로드 합니다. 이 부정 확 한 정자 수 발생할 수 있으므로 챔버 내부에 거품 형성을 피하기 위해 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>20 X 목표 화합물 현미경 관찰 합니다. 참고: hemocytometer의 전체 표에 포함 9 큰 사각형, 각 1 m m2, 그리고는 coverglass 챔버의 바닥 위에 0.1 m m를 달려있다. 따라서, 중앙 세 영역 볼륨은 0.1 m m3 또는 0.1 µ L. hemocytometer의 중앙 지역 25 중간 사각형을 포함 하 고 각 중간 사각형은 단일 라인 16 작은 사각형.</li>
		<li>4 중간 코너 광장, 중앙 광장에 있는 셀의 총 수를 계산 합니다. 높은 정밀도 대 한 두 개의 챔버 (Neubauer hemocytometer의 양쪽) 세 고 평균을 사용 하 여 셀 농도 계산.</li>
		<li>5 (지역 세 당 셀의 수를 얻으려면) 및 10000 (희석된 샘플의 1 mL 당 셀의 수를 얻으려면)에 의해 평균 수를 곱하여 정자 수를 계산 합니다. 다음 희석 비율 (1: 100)에 의해 얻은 수를 곱하면 됩니다. 참고: 예를 들어 두 개의 챔버의 중앙 계산 영역 내에서 25 중간 사각형의 5에서 계산 하는 정자의 평균 수는 150 ([152 + 148] / 2). 따라서, sperms 챔버 (또는 0.1 µ L 당)의 평균 수는 150 x 5 = 750. 750 여 10000 희석된 샘플 (7500000)의 1 mL 당 셀 수 다음 원래 정액 샘플의 mL 당 75 x 107 세포를 100 (희석 요인)에 의해 곱하기를 곱하면 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 기술 #1: 여러 형광을 사용 하 여 정자 세포 막의 동시 평가 조사
참고: 정자 세포 막 (플라스마, acrosomal 및 미토 콘 드리 아) Celeghini 외10, 몇 가지 수정 하 여 앞에서 설명한 평가 됐다. Epifluorescent 현미경 검사 법, 450-490 nm에서 여기와 트리플 필터를 사용 하 여 515-565 nm에 방출 디지털 카메라와 함께 사용 되었다.
<ol><li>
재고 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>5mg DAPI의 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 50 mL에 용 해 하 여 0.1 mg/mL DAPI 재고 솔루션을 준비 합니다. 50 µ L aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에 저장 사용 하기 전에 1:10 (작업 솔루션, 10 µ g/mL)에 PBS 가진 재고 솔루션을 희석.</li>
		<li>FITC-PSA의 PBS의 1 mL에 1 mg를 용 해 하 여 1 mg/mL FITC-PSA 재고 솔루션을 준비 합니다. 50 µ L aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에 저장 사용 하기 전에 1:10 (작업 솔루션, 100 µ g/mL)에 PBS 가진 재고 솔루션을 희석.</li>
		<li>JC-1의 1 밀리 그램의 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 1 mL에 용 해 하 여 1 mg/mL JC-1 재고 솔루션을 준비 합니다. 10 µ L aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에 저장 사용 하기 전에 1:10 (작업 솔루션; 0.1 mg/mL)에서 DMSO와 재고 솔루션을 희석.</li>
		<li>PBS (주는 2.5 mg/mL)의 400 µ L에 PI의 10mg을 용 해 하 여 PI 재고 솔루션을 준비 합니다. 스토어 + 4 ° c. 1:20 (작업 솔루션, 0.125 mg/mL)에서 PBS 1 재고 희석. 재고 솔루션으로 + 4 ° C에서 저장 합니다. 주의: PI 잠재적인 돌연 이며 신중 하 게 처리 되어야 한다. 해당 지역 규정에 따라 안전 하 게의 염료를 삭제 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>새로운 1.5 mL 튜브 (25 x 106 정자/mL)을 운동 정 충 (단계 1.5)의 133 µ L를 전송 합니다. 참고: 샘플 농도 더 높은 경우에, 필요한 농도; 달성 하기 NKM 버퍼에 희석 샘플을 수영의 샘플 농도 낮은 경우에, 1000 x g 5 분에서 최대 수영 후 얻은 상쾌한 원심는 상쾌한의 0.5 mL을 제거 하 고 다시 정자를 계산.</li>
	<li>DAPI (작업 솔루션)의 17 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
	<li>5 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>펠 릿, 100 µ L의 NKM 버퍼 추가 합니다.</li>
	<li>FITC-PSA의 50 µ L, JC-1의 2 µ L, PI (작업 솔루션)의 3 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
	<li>5 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>펠 릿, 하 NKM 버퍼의 40 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 resuspend.</li>
	<li>유리 슬라이드, 얼룩 및 coverslip 10 µ L의 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>
트리플 필터, 디지털 카메라를 갖춘 epifluorescence 현미경 검사 법 (사용 40 x 목표)에 의해 즉시 시각화 하 고 별도로 각 필터에 대 한 이미지를 캡처하십시오. 참고: 시각 필터 순서 아무 의미가 있다.<ol>
<li>358 nm에서 여기 및 방출 461에 DAPI 채널에서 시각화 nm.</li>
		<li>515-565 nm에 방출 450-490 nm에서 여기와 녹색 단위체에 대 한 FITC 채널에서 시각화.</li>
		<li>여기 488 nm 및 590에서 방출 빨간 집계에 대 한 PI 채널에서 시각화 nm.</li>
		<li>JC-1 시각화 559 nm, 574-627 nm;의 범위에 방출에서 여기 빨간 집계 488 nm와 500-535 nm의 범위에 방출에서 여기 JC-1 녹색 단위체.</li>
	</ol>
</li>
	<li>카메라 소프트웨어의 "병합" 옵션을 사용 하 여 JPG/JPEG 형식의 필터에서 받은 3 개의 이미지를 병합 합니다.</li>
	<li>"페인트" 도구는 병합 된 이미지를 열고 계산된 정 충을 브러시 옵션을 사용 하 여.</li>
	<li>
각 프로브에서 방출 하는 형광에 따라 정 충을 분류:
	<ol>
<li>일반적 평가 슬라이드 당 적어도 200 정 충-모든 셀 표시 블루 (DAPI).</li>
		<li>생존 능력 평가 죽은 세포를 계산 하 여 나타나는 보라색 (PI [레드] + [블루] DAPI)와 죽은 세포 (죽은 세포/총 계산 셀 x 100)의 비율을 계산.</li>
		<li>형광 (FITC-PSA) 얼룩의 패턴을 사용 하 여 acrosome 상태를 평가 합니다. (손상, 손상 또는 반작용 acrosome 셀/총 계산 셀 x 100) 다양 한 패턴의 비율을 계산 합니다. 참고: 손상 된 acrosomal 막이 나타납니다 완전히 스테인드, 녹색 acrosome 뚜껑; 반작용된 acrosomal 막이 보여줍니다 잔여 녹색 적도 또는 위 얼룩; 그대로 acrosomal 멤브레인 포함 된 셀 acrosomal 영역의 어떤 녹색 얼룩 전시 하지 것입니다.</li>
		<li>ΔΨm 레드 스테인드 midpiece 전시, 높은 ΔΨm와 정 충 그리고 녹색 얼룩이 midpiece 전시 하는 낮은 ΔΨm와 정 충을 구분 하 여 평가 합니다. 레드와 그린 midpieces 별도로 세 고 그들의 비율을 (빨강/녹색).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 기술 #2: 평가 준비-사용 키트와 Cytometry 정자 세포 막
참고: 원형질 막 무결성, 미토 콘 드리 아 막 잠재력과 acrosomal 막 무결성 평가 준비-사용 흐름 cytometry 키트에 각 잘 동결 건조 된 형광으로 수행 되었다. 절차는 몇 가지 수정 제조 업체에 따라 수행 되었다.
<ol><li>
원형질 막 무결성 평가
	<ol>
<li>생존 및 농도 키트 (PI, SYbr14)의 패키지에서 우물의 원하는 수, 작업 자료 유연한 뚜껑 덮개에 그들을 전송 (빛에서 보호).</li>
		<li>잘 당 cytometry 버퍼 솔루션의 199 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>57 x 106/mL (57000 셀 잘 당)에서 균질 정액의 1 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 균질.</li>
		<li>검은 뚜껑 접시 커버.</li>
		<li>빛에서 보호 하는 37 ° C에서 10 분 동안 품 어.</li>
		<li>설정 '생존'과 교류 cytometer 통해 샘플을 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미토 콘 드리 아 막 잠재력
	<ol>
<li>미토 콘 드리 아 활동 키트 (JC-1)의 패키지에서 우물의 원하는 수, 작업 자료 유연한 뚜껑 덮개에 그들을 전송 (빛에서 보호).</li>
		<li>잘 당 절대 에탄올의 10 µ L을 추가 하 고 잘 내 현재 분말 resuspend 플라스틱.</li>
		<li>잘 당 PBS의 190 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 균질.</li>
		<li>57 x 106/mL (잘 당 50000 세포)에서 균질 정액의 0.75 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 균질.</li>
		<li>검은 뚜껑 접시 커버.</li>
		<li>빛에서 보호 하는 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>교류 cytometer 설정 ʽmitochondrial 활동을 통해 샘플을 실행 '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acrosomal 막 무결성 참고: FITC-PSA 얼룩 (기술 #1 참조) 3 acrosome 카테고리 (그대로 acrosome, 반작용된 acrosome 및 손상된 acrosome)의 평가 수 있습니다. 교류 cytometer 생존 및 acrosome 무결성 키트 (PI와 FITC-PNA)를 사용 하는 정 충이 3 개의 종류로 구분 됩니다.<ol>
<li>생존 & acrosome 무결성 키트 패키지에서 우물의 원하는 수, 작업 자료 유연한 뚜껑 덮개에 그들을 전송 (빛에서 보호).</li>
		<li>잘 당 cytometry 버퍼 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>57 x 106/mL (40, 000 셀 잘 당)에서 균질 정액의 0.7 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 균질.</li>
		<li>검은 뚜껑 접시 커버.</li>
		<li>빛에서 보호 하는 37 ° C에서 45 분 동안 품 어.</li>
		<li>샘플 설정 ʽInCyte와 교류 cytometer 통해 실행 '.</li>
		<li>형광 강도 따라 3 개의 마커 영역을 게이팅 하 여 결과 히스토그램 분석, 잔류 스테인드 acrosome (R2)의 일부와 세포 낮은 fluorescing 그대로, 흠 없는 acrosome (R1)를 무시할 수, 낮은 fluorescing 셀 대표 및 교란된 acrosome (R3)와 매우 fluorescing 셀. 참고: 3 개 지역 (R1, R2, R3)을 만들기 위해 악기 사용자 가이드의 "파일 다른 모듈을 사용 하 여 인수 분석" 섹션을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 기술 #3: 평가 형광 프로브 및 Cytometry 사용 하 여 정자 세포 막의
참고: Annexin V의 사용 apoptosis를 평가 하 고 apoptotic 정자 (apoptotic 인덱스)의 비율을 계산 PI 형광 수와 결합.
<ol><li>Annexin V 바인딩 버퍼 재고 솔루션 (annexin V 바인딩 버퍼 20 살 균 증류수의 9.5 mL 재고 솔루션 x의 희석 µ 500 L) x 20 x 1을 준비 합니다.</li>
	<li>1.7 섹션에 설명 된 대로 Neubauer hemocytometer를 사용 하 여 정자 수를 견적 한다.</li>
	<li>Annexin V 바인딩 버퍼와 300 x g 에서 원심 분리기는 10 분 x 1의 1 mL에 106 정 충을 씻어.</li>
	<li>완전히는 상쾌한 발음.</li>
	<li>Annexin V 바인딩 버퍼 x 1의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>FITC 활용 annexin V의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>잘 혼합 하 고 실 온에서 어둠 속에서 15 분 동안 품 어.</li>
	<li>10 분에 대 한 300 x g 에서 1 x annexin V 바인딩 버퍼 106 세포와 원심 분리기의 1 mL을 추가 하 여 정 충을 씻어.</li>
	<li>완전히는 상쾌한 발음.</li>
	<li>1 x annexin V 바인딩 버퍼 106 총 셀 당 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>교류 cytometer 분석 직전 1 µ g/mL PI를 추가 합니다.</li>
	<li>ʽInCyte에 설정 흐름 cytometer 통해 샘플을 실행 '.</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 충돌 다는 것을 선언 합니다.

정자의 수정 가능성의 품질을 반영 하는 여러 요인에 따라 달라 집니다. 정 충의 높은 농도 매우 점진적으로 운동 정 충의 높은 비율에 게 높은-품질 정액을 고려 될 수도 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그러한 평가를 고려 하지 않는 다른 세포 및 기능 매개 변수. ' 벤치 맨 ' microcapillary 교류 cytometer 사용 하 여 이전17 다른 사람에 의해 표시 하 고 시연 여기 (기술 #3) 형광 프로브를 사용 하 여 다양 한 정자의 평가에 쉽게 적용할 수 있습니다. 예를 들어 정자 acrosome 무결성은 매우 성공적인 자연 수정의 발생에 대 한 중요 한와 acrosomal 상태의 정확한 평가 보증 하는 따라서. 이러한 평가 acrosome 상태 형광 (FITC PSA, FITC-PNA, 즉, 기술 #1, 앞에서 설명한 대로) 얼룩의 패턴을 사용 하 여 분류 하 여 쉽게 수행할 수 있습니다1,<sup clas...

정자 세포 막의 기능과 무결성 정자 생존 및 수정 가능성를 나타내는 요인 중 몇 가지 있습니다. 원형질 막 세포 삼 투 평형1유지 세포내와 세포 외 구획 사이 방 벽 역할을 합니다. 원형질 막 무결성에 손상을 유도 스트레스 항상성 손상, 생존 능력 및 수정 능력을 감소 되 고 증가 세포 죽음. 예를 들어, cryopreservation 온도 변화 및 삼투성 스트레스2결과로 그것의 원형질 막에 손상에 인해 정자 생존 능력을 감소 시킨다. 우리는 이전 그 정자 생존1,3 감소 불 정자 농약 아트 가진, 그것의 주요 대사 산물 diaminochlorotriazine 등 mycotoxin 아플 라 톡 신 B1, 식중독 오염 물질의 낮은 농도에 노출 보고 . 이 손상 된 원형질 막 세포의 DNA에는 PI와 함께에서 DAPI와 이중 가닥 DNA 라벨 의해 결정 되었다.
Acrosome 반응 (AR) 외부 acrosome 막 및 acrosomal 효소4,5의 출시에 따른 overlying 원형질 막의 융해를 포함 한다. 이들은 zona pellucida 침투 및 추가 oocyte6정자의 병합을 위해 필수적인 행사입니다. 따라서, acrosomal 막 무결성의 평가 정액 질 및 남성 불 임7,,89평가 하는 유용한 매개 변수를 구성 합니다. 여러 형광 기법 acrosome 무결성, PNA FITC FITC PSA8,10의 확인을 위해 적당 하다. FITC PSA 얼룩1,3의 패턴을 사용 하 여 우리의 이전 연구에서 우리는 그대로 acrosome (i)에 대 한 정확한 정의 제공 (ii) acrosome 막 손상 하 고 (iii) acrosome 반응. 현재 보고서에서 우리 정자 전용 cytometry를 사용 하 여 acrosome 상태를 평가 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 그 결과 비교.
Mitochondria은 다기능 세포에, ATP 합성, 반응성 산소 종 생산, 칼슘 신호 및 apoptosis에 관여. 생리 장애, 남성 및 여성 불 임을 포함 한 변경 된 미토 콘 드리 아 기능11와 연결 됩니다. 정자의 미토 콘 드리 아는 midpiece에서 배열 되 고 정자 운동 성12에서 중요 한 역할. 그것은 잘 높은 미토 콘 드리 아 막 잠재력 (ΔΨm)은 정상적인 운동 성 및 높은 수정 용량13와 연결을 허용 합니다. 대조적으로, 낮은 ΔΨm 반응성 산소 종의 높은 수준에 연결 하 고 수정 속도14감소. 그럼에도 불구 하 고, 다양 한 환경 화합물, 예를 들면 내 분 비 분리기, 수 세포 스트레스를 유발 하 고 ΔΨm, hyperpolarization1,3, 그리고 결국, 자유 래 디 칼의 생산 증가에 일시적인 증가를 끌 apoptosis15. 형광 프로브 5, 5' 6, 6'-tetra-클로-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine 요오드 화물 (JC-1) 예를 들어 정자 ΔΨm1,3에 식중독 독 소의 효과 조사 가능.
표준 spermiograms, 생리 및 형태학 매개 변수에 따라 충분히 정액 질을 예측 하는 좋지 않다. 더 정확한 방법은 정자의 품질을 보장 하기 위해 필요 합니다. 여기, 우리는 정자 세포 막의 평가에 따라 정자의 품질을 결정 하기 위해 두 가지 가능한 방법 제공: 형광 현미경 검사 법, 우리의 연구1,3 에 설명 된 특정 형광 프로브와 동시 콰 얼룩 그리고 고급 정자 전용 cytometry, 최근 활용 우리의 실험실과 다른 사람에 의해 이미 사용 되 고16,,1718.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MOPS [3-N-모르필리노 프로판술폰산]</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Neubauer 독일</td><td></td><td>혈구계</td></tr><tr><td>DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>형광 프로브</td></tr><tr><td>PI (프로피듐 요오드화물)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>형광 프로브</td></tr><tr><td>FITC-PSA (플루오레세인 이소티오시아네이트 공액 Pisum sativum agglutinin)</td> <td>Sigma</td><td>L0770</td><td>형광 프로브</td></tr><tr><td>JC-1 (5,5',6,6'-테트라-클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸릴 카르보시아닌 요오드화물)</td><td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td><td>ENZ52304</td><td>형광 프로브</td></tr><tr><td>Annexin V FITC MACS에 접합,</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-060</td><td>형광 프로브</td></tr><tr><td>Annexin V 결합 완충액 20x 스톡 용액</td><td>MACS, Miltenyi Biotec</td><td>130-092-820</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td></td><td>inverted fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Nis Elements</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Nikon DXM1200F</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td></td><td>디지털 카메라</td></tr><tr><td>Guava EasyCyte Plus</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, France</td><td></td><td>microcapillary sperm flow cytometer</td></tr><tr><td>CytoSoft</td><td>Guava Technologies Inc., 미국 캘리포니아주 헤이워드; IMV Technologies</td><td></td><td>소프트웨어</td>에서 배포</tr><tr><td>세포 분석을 위한 완충 솔루션</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, France</td><td>023862</td><td>완충액</td></tr><tr><td>생존도 및 농축 키트</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, France</td><td>024708</td><td>생존력 평가를 위한 키트</td></tr><tr><td>미토콘드리아 활성 키트</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, France</td><td>024864</td><td>미토콘드리아 활성을 위한 키트 평가</td></tr><tr><td>Viability & acrosome integrity kit</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, France</td><td>025293</td><td>키트 acrosome 무결성 평가</td></tr><tr><td>JMP-13</td><td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>소 정자</td> <td>"SION", 인공 수정 및 건조를 위한 이스라엘 회사, Hafetz-Haim, Israel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

정자 세포 막의 평가 대 한 fluorimetric 기법

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

정자의 품질을 설명 하는 표준 spermiograms 주로 생리 및 시각적 매개 변수, 사정 및 농도, 운동 성 및 진보적인 운동 성, 정자 형태 및 생존 능력 등 기준으로 합니다. 그러나, 이러한 평가은 충분히 정액 질을 예측 하는 좋은입니다. 그의 정자 생존 및 잠재적인 수정 유지 보수 막 무결성 및 세포내 기능에 따라, 이러한 매개 변수 평가 수 가능 정자의 수정 능력의 더 나은 예측 여기, 형광 현미경 검사 법 또는 흐름 cytometry 분석 결합 된 특정 형광 프로브를 사용 하 여 정자의 품질을 평가 하 세 가지 가능한 방법을 설명 합니다. 분석 평가 플라즈마 멤브레인 무결성 4', 6-diamidino-2-phenylindole를 사용 하 여 (DAPI) 및 propidium 요오드 화물 (PI), acrosomal 막 무결성 fluorescein isothiocyanate 활용을 사용 하 여 Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) 및 미토 콘 드 리아 멤브레인 무결성 사용 하 여 5, 5' 6, 6'-tetra-클로-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine 요오드 화물 (JC-1). 이러한 방법의 조합 또한 제공 됩니다. 예를 들어, annexin V의 사용 apoptosis를 평가 하 고 apoptotic 정자 (apoptotic 인덱스)의 비율을 계산 PI 형광 수와 결합. 우리 정자 막 검사에 근거 하는 이러한 방법론은 정자 품질 평가 대 한 매우 유용 합니다 믿습니다.

그림 1 보여줍니다 동시 fluorimetric 평가 정자 세포 막 (플라스마, acrosomal 및 미토 콘 드리 아)의 PI, DAPI, FITC PSA와 JC-1을 사용합니다. 4 형광 프로브 동시 얼룩을 사용 하 여 정자 세포 막의 평가 허용, 예를 들어 각 카테고리에서 정자의 비율을 평가-라이브 대 죽은; 높은 대 낮은 ΔΨm; 그대로 vs. acrosome 손상-각 정자에 대 한 동시에.
그림 2 는 막 평가 fluorimetric 프로브를 사용 하 여 정자의 결과 제공 합니다. 적어도 80% 운동 정 충을 포함 하는 정액만 실험에 사용 되었다. 적어도 200 셀 불 당 시험 되었다. 막 무결성 측면...

여기, 우리는 spermatozoan 막 무결성, 정자의 수정 능력와 관련 된 세포 기능을 평가 하는 방법론을 제시. 우리 정자 세포 막의 fluorimetric 평가 대 한 세 가지 기술에 설명: 특정 형광 프로브, 형광 현미경 검사 법, 그리고 고급 정자 전용 cytometry 동시 얼룩. 방법론을 결합의 예제도 제공 됩니다.

정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

이러한 절차의 목표는 형광 현미경 검사법 또는 유동 세포 분석과 결합된 특정 형광 프로브를 사용하여 정자 막 무결성을 평가하는 것입니다. 이 기술은 수정 잠재력의 예측 및 정액 견본의 질과 같은 재생산의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정자 수정 잠재력과 연관되는 것으로 알려진 여러 정자 막의 정확한 평가를 가능하게한다는 것입니다.이러한 기술의 의미는 정자 플라즈마및 곡자 막 무결성뿐만 아니라 미토콘드리아 막 전위력에 대한 보다 정확한 평가를 가능하게 하기 때문에 사정 품질의 진단으로 확장됩니다. 이 절차를 시작하려면 실온에서 15 밀리리터 튜브에서 약 1 ~6 밀리리터의 황소 정액을 얻습니다. 6밀리리터의 NKM 버퍼를 37°C에 미리 데워서 정액 1밀리리터에 추가합니다.원심 분리기는 8 분 동안 600 배 g에서. 상신자가 명확해질 때까지 원심 분리를 한두 번 반복합니다. 그 후, 즉시 펠릿 위에 상체의 약 1 센티미터를 떠나, 상체의 대부분을 폐기.조심스럽게 인큐베이터에서 30도 각도로 튜브를 기대어 정자가 수영 할 수 있도록 20 ~ 30 분을 기다립니다. 마이크로 피펫을 사용하여, 조심스럽게 지금 motile 정자를 포함하는 상류체의 나머지 1 밀리리터를 제거하고 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 전송. 사용할 준비가 될 때까지 37 섭씨에서 정자를 유지합니다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 모든 스톡 솔루션을 준비합니다. 다음으로, 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 밀리리터 당 2,500만 개의 정자의 농도로 운동성 정자의 133 마이크로리터를 전송합니다. DAPI 작업 용액17마이크로리터를 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.원심 분리기는 5 분 동안 1, 000 배 g에서. 상체를 버리고 펠릿에 NKM 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로 FITC-PSA 50마이크로리터, JC-1의 마이크로리터 2개, PI 3마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 10분간 배양하세요.원심 분리기는 5 분 동안 1, 000 배 g에서. 상체를 버리고 NKM 버퍼의 40 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 그런 다음 샘플의 마이크로리터 10을 유리 슬라이드로 옮기습니다.샘플을 얼룩지고 커버슬립을 추가합니다. 그 후, 즉시 40X 목표와 텍스트 프로토콜에 설명된 트리플 필터로 피형현미경검사로 샘플을 시각화하기 시작하여 디지털 카메라를 사용하여 각 필터에 대해 별도의 이미지를 캡처합니다. 카메라 소프트웨어의 병합 옵션을 사용하여 필터에서 받은 세 개의 이미지를 병합하여 새 파일을 JPEG 형식으로 저장합니다.병합된 이미지를 페인트 도구와 열고 브러시 옵션을 사용하여 계산된 정자를 표시합니다. 다음으로, 각 프로브에서 방출되는 형광에 기초하여 정자를 분류하여 슬라이드 당 적어도 200 개의 정자를 평가하십시오. 모든 셀은 DAPI에서 파란색으로 표시되어야 합니다.보라색으로 보이는 죽은 세포를 계산하여 생존 가능성을 평가합니다. 그런 다음 형광 염색 패턴을 사용하여 곡어 상태를 평가합니다. 마지막으로, 미토콘드리아 막 전위가 높은 미토콘드리아 막 전위와 정자를 구별하여 미토콘드리아 막 전위성을 평가하여, 녹색 염색 된 중간 조각을 나타내는 낮은 미토콘드리아 막 전위와 정자에서 적색 염색 된 미드피스를 나타낸다.빨간색과 녹색 미드피스를 따로 계산하고 비율을 계산합니다. 플라즈마 멤브레인 무결성 평가를 시작하려면 생존력 및 농도 키트에서 원하는 수의 우물을 섭취하십시오. 우물을 작업 기지로 옮기고 유연한 뚜껑으로 덮어 빛으로부터 보호합니다.각 웰에 세포측정을 위한 버퍼링 된 용액 199 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 밀리리터당 5,700만 개의 세포농도에 균일한 정액 1개를 첨가하고 파이펫팅으로 균질화한다. 뚜껑으로 접시를 덮고 섭씨 37도에서 10분 간 배양합니다.그런 다음 생존 가능성 설정을 사용하여 유동 사이토계를 통해 샘플을 실행합니다. 미토콘드리아 막 전위를 평가하기 시작하려면 미토콘드리아 활성 키트에서 원하는 수의 우물을 꺼내십시오. 작업 기지로 전송합니다.각 웰에 절대 에탄올 10 마이크로리터를 추가하고 파이펫을 사용하여 우물 내에 존재하는 분말을 재보힙을 사용하십시오. 웰당 190마이크로리터의 PBS를 추가하고 파이펫팅으로 균질화합니다. 밀리리터당 5,700만 개의 세포농도에 균질성 정액의 0.75 마이크로리터를 각 우물에 추가하고 파이펫팅으로 균질화한다.뚜껑으로 접시를 덮고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 미토콘드리아 활성 설정을 사용하여 유동 세포계를 통해 샘플을 실행한다. 곡예 막 무결성을 평가하기 시작하려면 생존력과 곡예 무결성 키트에서 원하는 수의 우물을 꺼내십시오.우물을 작업 기지로 옮기고 유연한 뚜껑으로 덮어 빛으로부터 보호합니다. 각 웰에 사이토메트리용 버퍼링 솔루션 200마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 밀리리터당 5,700만 개의 세포농도에 균질성 정액의 0.7 마이크로리터를 각 웰에 추가하고 파이펫팅으로 균질화한다.뚜껑으로 접시를 덮고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 인사이트 설정을 사용하여 흐름 사이토미터를 통해 샘플을 실행합니다. 이 연구에서, 정액 품질다른 기술을 사용 하 여 평가, 그 중 하나는 불소 측정 프로브를 사용 하 여 정자 막을 평가.멤브레인 무결성 측면에서 정자 샘플 품질의 차이를 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 황소 번호 7의 사정은 죽은 세포의 상대적으로 낮은 비율, 의사 반응 곡예를 가진 정자의 낮은 비율, 그리고 황소 번호 1의 사정에 비해 더 높은 미토콘드리아 막 잠재력을 가졌다. 견본은 그 때 생존성 및 미토콘드리아 활동을 위해 평가됩니다.이러한 대표적인 예에 대한 히스토그램은 웅덩이한 정자와 파편 및 문이 닫힌 정자를 나타냅니다. 이 히스토그램은 또한 편광 및 탈편화 미토콘드리아 막에 실행 가능한 죽은 세포및 정자의 분포를 나타냅니다. 곡어 성 무결성은 다음 즉시 사용 키트로 평가하고 흐름 세포측정으로 읽으며, 이 영역을 그대로 염색되지 않은 곡예, 낮은 형광 세포로 무시할 수 있는 낮은 형광 세포를 나타내는 세 가지 마커 영역으로 나누어, 그리고 세포가 중단된 세포와 함께 매우 형광을 가한다.이 절차를 시도하는 동안, 제대로 초기 정자 샘플을 준비하는 것이 중요합니다. 이러한 기술은 정자 품질 평가에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 소, 가금류 및 인간과 같은 다양한 유기체에 적용 될 수 있습니다. 두 기술 사이의 비교, 네 배 염색 및 흐름 세포측정은 생존가능성에 대한 유의한 차이를 나타내지 않았다, 미토콘드리아 막 잠재력, 그리고 두 기술이 일치하는 결과를 생성 것을 밝히는 곡어 무결성.

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Research

연구

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정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법

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