Name: 췌장의 베타 세포가 인슐린 분비에 영향을 미치는 세포 외 단백질 상호 작용의 배양 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 배우세요 췌장 베타 세포의 인슐린 분비에 미치는 세포 외 단백질 상호 작용을 HEK293 세포와의 공배양을 통해 연구하는 방법을. 이 기법은 베타 세포 건강을 해치지 않고 단백질 기능을 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 건강 보조금 R01DK080971 및 청소년 당뇨병 연구 재단 보조금 37-2009-44의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 UCSD 소아 당뇨병 연구 센터 (PDRC)로부터받은 지원도 주셔서 감사합니다.

1. HEK293 레이어의 형질 전환 <ol><li> 50 ML FBS 5 ML 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 5 ML 100X L-글루타민 용액 500 μL 암포 테리 신 : DMEM의 500 ML 병 (4.5 g / ML 포도당과 페놀 레드와 글루타민이없는)에 추가하여 HEK293 세포 매체를 준비합니다 B. </li><li> 물론 당 HEK293 매체의 0.5 ML를 사용하여 24 - 웰 플레이트에 HEK293 세포 밖으로 접시. 세포가 플레이트의 하단에 균등하게 분산되어 있는지 확인합니다. </li><li> HEK293 세포 플라스미드 lipofectamine과 프로토콜에 따라 관심의 단백질 (포유류 발현 벡터에 삽입) 및 lipofectamine과 2000 년 2 μl를 코딩의 0.8 μg으로 자랄 100 %, 형질에 도달합니다. 우리는 포유 동물 세포에서 발현을 위해 설계 pcDNA 3.3 백본을 사용하기로했다. </li><li> 선택적으로, 배양 6 시간 후, 교환 형질 미디어 정상 HEK293 미디어 lipofectamine과 프로토콜 설명했다. </li><li> 형질 전환 prote의 식을 계산하려면에 형질 전환 조직 문화 우물의 하위 집합을 표현 단백질의 면역 형광 검출 또는 표준 기술을 사용하여 단백질 발현의 서양 얼룩 분석에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. HEK293 세포의 선택적 고정은 형질 전환 단백질을 표현 형질 HEK293 세포는 부드럽게 HEK293 세포 (예를 들어, 아래의 단계 3.9) 거주 또는 (또한 토론 참조) 한 번에 여러 가지 실험 플레이트 사전에 효율적으로 준비 할 수 있도록에 유해 할 수 있습니다 미디어에서 배양을 촉진하기 위해 고정 할 수 있습니다. <ol><li> HEK293 세포에있는 단백질의 발현의 시간 과정을 결정하기 위해 파일럿 연구를 실시한다. </li><li> HEK293 세포 층을 형질 후, 표현의 높은 수준과 관련된 포스트 형질 시점에서 세포에서 미디어를 대기음. 이 첫 번째 24 시간 내에서 발생하는 경우, 형질 전환 후 24 시간 전까지 대기음하지 않습니다. </li><li> HE 세척부드럽게 D-PBS와 K293 세포는 500 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가하고 30 분 동안 RT에서 품어. (4 % PFA 솔루션을 만들려면 1X PBS에서 16 % 용액으로 시작하고 1X PBS로 1:4 희석). </li><li> 멸균 PBS를 사용, 가볍게 4 ℃에서 PBS O / N에있는 세포에게 3 번과 부화를 씻어 </li><li> 세포에게 멸균 PBS로 3 회 세척 한 후 PBS를 추가하고 4시에 떠나 ° C까지 필요 (최대 저장 시간은 발현 단백질에 따라 다를 수 있습니다. 우리는 관찰 된 효과에 큰 변화없이 이주에 대한 neuroligin의 아형을 표현 형질 HEK293 세포를 저장 인슐린 분비). </li></ol> 3. HEK293 세포와 INS-1 베타 세포의 공동 배양 <ol><li> (포도당과 페놀 레드와 글루타민없이) 500 ML RPMI 1640에 추가하여 INS-1 미디어를 준비 : 50 ML FBS 5 ML 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ML 100X L-글루타민 용액, 5 ML 나트륨 피루 베이트, 500 μL 암포 테리 신 B, 500 μL 베타 - 머 캅토 에탄올 (이 메디 거의 동일합니다음 일반적으로 베타 - 머 캅토 에탄올의 추가)을 제외한 주요 섬 문화에 사용됩니다. </li><li> (또는 다른 비 효소 세포 제거) 세포 스트리퍼를 사용하여 수확 INS-1 T75 문화 플라스크의 바닥 떨어져 자랄 약 70-80%에서 세포. 각각의 플라스크에 48 우물 대략 충분한 세포를 제공합니다. </li><li> INS-1과 HEK 미디어 50 / 50 혼합에 resuspend을 1,200 rpm에서 3 분을 위해 원심 분리기에서 세포를 스핀 다운 후. INS-1 세포의 70~80% 합류 플라스크를 들어, 혼합 매체의 약 25 ML에 resuspend을. </li><li> 오히려 라이브 HEK293 세포보다 파라 포름 알데히드에서 수정 된 HEK293 세포를 사용하는 경우, 100 %보다는 혼합 매체보다 INS-1 미디어 INS-1 세포를 resuspend을. </li><li> 10 ㎖ 피펫 사용하여 균일 한 세포 현탁액을 만들기 위해 펠렛의 세포를 이동시키다. </li><li> HEK293 세포에서 미디어를 제거하는 대기음. </li><li> P1000 피펫을 사용하여 부드럽게 O는 측면을 따라 HEK 세포 층에 INS-1 세포 현탁액 500 μl를 추가F도. 매 6 우물 후, 균일 한 세포 현탁액을 보장하기 위해 다시 INS-1 세포를 resuspend을 위해 10 ㎖ 피펫을 사용합니다. 배양 셋업의 전체 구조는 그림 1에 묘사되어있다. </li><li> 실험 프로토콜에 따라 24-48 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 이상 48 시간의 배양 기간이 필요한 경우, HEK293 세포를 해결하기 위해 절에서는 위의 2에서 선택적 단계를 사용하십시오. </li><li> 기본 해리 짐승이나 인간의 섬을 사용하면 [예 조브 11-15로 앞서 프로토콜을 참조]가 5 ML 펜 / strep의 5와 같은 RPMI 같은 적절한 미디어가 ML L-과잉, 0.5 ML 암포 테리 신-B가 대신 사용되도록 INS-1 미디어. 하나 때문에 잠재적으로 필요 섬의 많은 수의 연습, 24 웰 플레이트에 해리 섬 세포를 사용할 수 있지만, 그것은 고려가 48 잘 플레이트 (물론 당 적은 수의 췌도 세포를 필요로)로 스케일링 아래로 주어진 것이 좋습니다. 48 잘 접시에, dissocia의 가치가 약 100 섬을 추가시작 플레이트 당 테드 세포. 해리의 효능과 사용 방법에 따라 적은 섬이 필요할 수 있습니다. </li></ol> 4. 포도당은 인슐린 분비를 자극 <ol><li> 1 시간의 최소 KRB 2.5 mM의 포도당 (크렙스 - 링거 중탄산염 버퍼) 250 μL의 세포를 Preinc​​ubate. , preinc​​ubate 배양 배지를 제거하고 즉시 KRB로 교체합니다. 이 교환은 환경에 산소 INS-1 세포의 노출을 최소화하기 위해 한 번에 제대로 하나를 수행해야합니다. 서로가 낮은 (2.5 ㎜) 포도당 KRB를 피펫 한 손으로 흡입. </li><li> 2.5 mm 또는 시간에 잘 KRB 버퍼 하나에 20 mM의 포도당도 250 μL에 교환 배양 전 KRB. </li><li> 특정 실험에 적합한 경우와 같은 100 μM의 IBMX 같은 추가 분비는보다 강력한 자극 인슐린 분비 반응을 생산하기 위해 추가 할 수 있습니다. 특히 해리 기본 췌장 베타 세포의 증가 포도당 농도 아론에 제대로 반응하는전자, 그래서 IBMX 다른 분비의 여기에 특히 첨가 16,17을 고려하여야한다. </li><li> 배양 1 시간 후, 미디어 튜브의 microfuge 5 분 1,500 XG에 스핀을 전송할 수 있습니다. </li><li> 상층 액 200 μl를 제거하고 인슐린 RIA 또는 ELISA로 분석이 사용합니다. </li><li> 세포 해물을 준비하려면 (1.0 % IGEPALCA-630 또는 Nonidet P-40, 0.5 %의 나트륨 deoxycholate, 0.1 % SDS, 50 MM 트리스, 산도 8.0 150 mM의 NaCl을), 단백 분해 효소 억제제가에 RIPA 세포 용해 완충액 100 μl를 추가 바로 4에서 미디어와 부화를 제거 ° C를 20 분 후 접시. </li><li> 10,000 XG에 15 분 동안 해물을 회전 인슐린 RIA 또는 ELISA로 분석 상층 액 50 μl를 제거합니다. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

여기에 설명 된 배양 방법은 특정 베타 세포 표면 막 단백질의 생리적 중요성을 확인하는 효과적인 방법을 제공합니다, 특히 자신의 세포 도메인으로. 세포 표면에 대한이자의 단백질을 표시하는 HEK293 세포와 접촉 배양 베타 세포 또는 인슐린 종 세포 (예 : 여기에 사용 된 INS-1 세포)에 의해 실험을 직접 방해하지 않고 세포 단백질 - 단백질 상호 작용의 효과를 결정하기 위하여 디자인 될 수있다 세포의 세포 내 환경. 관심의 단백질이 HEK293 세포에 의해 표현되기 때문에, 형질 전환 단백질의 세포 내 도메인에 의해 중재 될 수 β-세포 기능에 대한 영향은 없을 것입니다 따라서 세포 상호 작용의 효과 분석을 복잡하게하지 않을 것입니다. 인슐린 분비에 미치는 영향은 쉽게 HEK293 세포를 동시 배양 베타 세포에서 분비를 비교하여 확인할 수 있습니다제어 HEK293 세포와 접촉 동시 배양 베타 세포에서 분비 관심의 단백질을 표현. 제어 HEK293 세포는 모의 형질 전환...

우리는 여기에서 특정 막 단백질의 세포 외 도메인이 인슐린 분비에 영향을 미치는 방법 연구를 촉진하는 방법을 설명합니다. 췌장 베타 세포의 표면에 단백질 (또는 다른 분자)와 관심의 단백질의 상호 작용의 방법 프로브는 효과. 방법은 베타 세포 또는 다른 이웃 세포 ​​(예 : 내피 세포, 신경 세포, 췌장 알파 세포)에 의해 표현 세포 표면 단백질 transcellular 상호 작용 (즉, 인접한 표면에 상호 작용 파트너와의 상호 작용을 통해 통해 베타 세포 기능에 영향을 어떻게 조사 할 수 있습니다 베타 세포). 세포의 세포막은 세포 외 환경에 교량 역할을 구조적, 기능적 단백질의 복잡한 배열을 포함하고 있습니다. transcellular 연결의 형성에 의해 또는 플라스틱 신호 이벤트의 개시에 의해, 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 조정할 수 있습니다이웃 세포의 기능. 췌장 베타 세포는 췌장 내에서 함께 클러스터링과 포도당 항상성 1을 유지하기 위해 조정 방식으로 작동합니다. 로 세포 EphA-ephrinA과 포도당 자극 인슐린 분비의 조절에 neuroligin-2 상호 작용의 중요성에 의해, 예를 들어, 공개, 그것은 점점 더 분명 해지고있다 그 인접의 표면에 단백질 사이에서 발생하는 세포 상호 작용의 지식 증가 베타 세포는 인슐린 분비, 베타 세포 기능의 성숙과 1-3 포도당 항상성의 유지 완전한 이해를 얻기위한 중요성 될 것입니다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 특정 횡단하거나 세포 표면과 연관된 단백질을 포함 transcellular 상호 작용의 베타 세포의 기능에 미치는 영향의 조사를 가능하게하는 것입니다. 다른 식 구조로 형질 HEK293 세포, B에 대한 효과와 공동 배양 (co-culture)의 베타 세포에 의해다른 세포 표면 단백질 또는 돌연변이 변종 ETA 세포의 기능은 그 효율적으로 탐색 할 수 있습니다. 이 베타 세포 자체를 형질하지 않고도 수행 할 수 있습니다. 배양 된 베타 세포 또는 생체 내에서 최저 녹아웃 또는 발현 연구에 의해 특정 transcellular 상호 작용의 역할의 해명은 잠재적으로 분석을 혼동 수있는 방법으로 베타 세포의 건강 및 / 또는 기능에 영향을 미치는 베타 세포의 mRNA와 단백질 발현을 직접 섭동을 필요로 특정 세포 상호 작용의 효과. 이들은 또한 타겟 단백질의 세포 내 도메인 수준을 변경하고, 추가, transcellular 상호 작용의 효과를 구별 할 수 또는 동일한 셀에있는 단백질 사이의 상호 작용에 의해 영향을 허용하지 않는 접근한다. 여기에 베타 세포의 인슐린 분비 능력 및 응답의 특정 transcellular 상호 작용의 효과를 결정하기위한 방법은 DESCR입니다IBED. 이 방법은 INS-1 세포를 4로 인슐린을 분비하는 베타 세포 라인에 그리고 해리 기본 짐승이나 인간의 베타 세포에 적용 할 수 있습니다. 그것은 HEK293 (또는 COS) 세포 레이어에 표현 된 특정 신경 세포의 단백질 배양 신경 세포의 노출을 발견 신경 생물 학자에 의해 개발 된 배양 모델을 기반으로 해당 드라이브의 시냅스 형성 5,6 단백질을 확인할 수 있습니다. 시냅스의 분비 기계 사이의 베타 세포의 평행선을 감안할 때, 우리는 베타 세포 기능과 기능 성숙 유사 transcellular 상호 작용 7-9에 의해 구동 될 수 있다는 추론. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해, 우리는 베타 세포가 그 10의 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 레이어에 동시 배양되는 문서에 설명 된 시스템을 개발했다. 이 시스템은 세포 단백질 - 단백질 상호 작용을 조작하는 동안 베타 세포의 세포질을 그대로 유지 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>pcDNA 3.3 벡터/백본</td><td>Invitrogen</td><td>K830001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>18324012</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech</td><td>45001-312</td><td></td></tr><tr><td>펜/연쇄상구균 솔루션</td><td>Mediatech</td><td>45001-652-1</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Mediatech</td><td>45001-808-1/30</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Mediatech</td><td>45001-404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Mediatech</td><td>45001-434</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 Pyruvate</td><td>Mediatech</td><td>45001-710-1</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211; 탄올</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>세포 스트리퍼</td><td>Mediatech</td><td>45000-668</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>BD</td><td>1368065</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>50980487</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Mediatech</td><td>45001-130</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>시그마</td><td>I5879-100MG</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 용해 버퍼</td><td>시그마</td><td>R0278</td><td></td></tr></tbody></table>

췌장의 베타 세포가 인슐린 분비에 영향을 미치는 세포 외 단백질 상호 작용의 배양 분석

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

세포 표면 단백질 사이의 상호 작용은 이웃 세포의 기능을 조정하는 데 도움이. 췌장 베타 세포는 췌장 내에서 함께 클러스터링과 포도당 항상성을 유지하기 위해 조정 방식으로 작동합니다. 그것은 인접 베타 세포의 표면에있는 막 단백질 사이의 상호 작용이 베타 세포 기능의 중요한 결정 요인임을 점점 더 분명 해지고있다. 배양 된 베타 세포 또는 생체 내에서 최저 녹아웃 또는 발현 연구에 의해 특정 transcellular 상호 작용의 역할의 해명은 잠재적 효과 분석을 혼동 수있는 방법으로 베타 세포의 건강 및 / 또는 기능에 영향을 미치는 발현 및 단백질 발현의 직접 섭동을 필요로 특정 상호 작용. 이러한 방법은 타겟 단백질의 세포 내 도메인 수준을 변경하고 표시 할 같은 세포막에서 단백질 사이의 상호 작용에 의한 영향을 방지 할 수 있습니다transcellular 상호 작용의 영향에서 tinguished. 여기에 베타 세포의 인슐린 분비 능력 및 응답의 특정 transcellular 상호 작용의 효과를 결정하기위한 방법이 제공됩니다. 이 방법은 INS-1 세포와 같은 베타 세포 라인에 그리고 해리 차 베타 세포에 적용 할 수 있습니다. 그것은 HEK293 (또는 COS) 시냅스 형성을 구동하기위한 중요한 세포층 확인 된 단백질의 발현 특정 신경 세포의 단백질 배양 신경 세포의 노출을 발견 신경 생물 학자에 의해 개발 된 배양 모델을 기반으로합니다. 시냅스의 베타 세포의 분비 기계 사이의 평행선을 감안할 때, 우리는 베타 세포 기능의 성숙 유사 transcellular 상호 작용에 의해 구동 될 수 있다는 추론. 우리는 베타 세포가 관심의 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 레이어에 배양 시스템을 개발했다. 이 모델에서 베타 세포의 세포질은 그대로되어 세포 단백질 - 단백질 자원 활용하면서NS는 조작된다. 우리는 주로 포도당 자극 인슐린 분비의 연구에 여기에 초점을하지만, 다른 프로세스를 분석 할 수 있으며, 예를 들면, 유전자 발현의 변화로 immunoblotting을 또는 qPCR에 의해 결정됩니다.

방법을 사용하여 여기에 설명 된, 우리는 인슐린 분비 단백질 neuroligin의 다른 변형의 효과를 시험했다. 이 베타 세포 기능 10 neuroligin-2의 효과를 조사하는 우리의 게시 된 작품을 보완한다. 그림 2 예를 들어, 여기에 언급 neuroligin 이소을 표현 형질 HEK293 세포 coculturing의 INS-1 베타 세포에서 얻은 결과를 보여 NL- X. 이 실험은 NL-X는 인슐린 분비를 증가시키는 transcellular 상호 작용에 종사하는 가설을 테스트하도록 설계되었습니다. 그림 2A, 그것은 NL-X의 발현이 기저 증가와 동시 배양 INS-1 세포에 의해 인슐린 분비를 자극 함을 알 수있다. HEK293 세포를 형질의 접근 방식은 그래서 그들은 NL-X를 표현하는 것을 우리는 그것이 세포 도메인 동시 배양 INS-1 세포, 즉 제공과 접촉 할 수 있으므로 HEK293 세포 표면에 표시되는 영역이며 것을 알 수 있습니...

Transcellular 단백질 상호 작용은 췌장 베타 세포 기능의 중요한 결정 요인이다. 여기에 자세한 방법을 적응 특정 막 단백질은 인슐린 분비에 영향을 미치는 방법을 조사 시냅스 - 용의 배양 모델에서. 형질 HEK293 세포는 그 단백질을 표현, 베타 세포는 형질 전환하거나 직접 교란 할 필요가 없습니다.

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

본 절차의 전반적인 목적은 특정 transmembrane 단백질의 extracellular domain이 포함된 세포 간 상호작용이 베타 세포 기능, 더 구체적으로는 인슐린 분비에 어떠한 영향을 미치는지 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 포유류 세포주에 관심 단백질을 포함하는 플라스미드를 형질전환시키고, 두 번째 단계에서 베타 세포주를 해당 포유류 세포와 공동 배양합니다.마지막 단계에서는 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)를 평가하기 위해, 서로 다른 포도당 농도의 배지에서 공배양물을 배양합니다. 최종적으로, 배양된 베타 세포가 배지로 분비한 인슐린 수치를 측정하기 위해 인슐린 방사면역측정법(RIA) 또는 ELISA를 사용합니다. 유전자 과발현 및 넉다운과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, mRNA 및 단백질 발현의 섭동을 방지함으로써 베타 세포의 건강이나 기능에 잠재적인 영향을 주어 단백질의 특이적 상호작용 분석을 방해할 수 있는 요인을 제거한다는 점입니다.먼저 HEC 2 93 세포를 24웰 플레이트로 옮기되, 세포가 플레이트 바닥에 고르게 퍼지도록 웰당 0.5 milliliters의 HEC 2 93 배지를 넣습니다. 웰에 형성된 파동과 속도를 맞춰 한 번에 한 축씩 플레이트를 흔들어 줍니다. HEC 2 93 세포가 100%co fluency에 도달하면, 2 microliters의 lipo 2000에 녹인 0.8 micrograms의 표적 단백질 코딩 플라스미드를 배양 세포에 transfection합니다.lipo 프로토콜에 따라, 비효소적 세포 제거제를 사용하여 곧 시연할 공배양의 전반적인 계획이 여기에 묘사되어 있습니다. T 75 배양 플라스크 바닥에서 약 70~80% 밀도의 INS one 세포를 수확하여 이 단계를 시작하십시오. 상온에서 150 Gs로 3분 동안 세포를 원심 분리한 후, P 1000 피펫을 사용하여 펠릿을 1 mL의 절반 INS one 및 절반 배지에 재현탁하십시오.그 다음 10 mL 피펫을 사용하여 혼합 배지 24 mL를 추가로 넣고 세포를 재현탁합니다. HEC 293 세포가 포함된 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 P 1000 피펫을 사용하여 INS 1 세포 현탁액 500 µL를 웰의 벽면을 따라 HEC 세포층 위에 조심스럽게 첨가합니다. 매 6개 웰마다 10 mL 피펫을 사용하여 INS 1 세포를 재현탁합니다.다시 한번 균질한 세포 현탁액을 확보합니다. 이제 실험 프로토콜에 따라 세포를 24~48시간 동안 배양합니다. 원하는 실험 배양 기간이 지난 후, 한 번에 하나의 웰씩, 한 손으로는 공동 배양 배지를 흡입하고 다른 한 손으로는 즉시 Krebs ringer bicarbonate buffer 내의 2.5 millimolar glucose 250 microliters로 배지를 교체합니다.공동 배양물을 1시간 동안 사전 배양한 후, 저농도 포도당 KRB 버퍼를 2.5 mM 또는 20 mM 포도당 250 µL로 교체합니다. 다시 1시간 동안 배양한 후, KRB 버퍼를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 4 °C에서 1500 ×g로 5분간 원심분리합니다. 즉시 단백질 분해 효소 억제제가 포함된 RIPA 세포 용해 버퍼 100 µL를 플레이트에 첨가하고 4 °C에서 20분 동안 배양합니다.원심 분리가 완료되면, 향후 인슐린 방사면역측정법(radio immunoassay) 또는 ELISA 분석을 위해 상층액 200 µL를 취합니다. 마지막으로, 세포 용해물(cell lysate)이 된 시료를 10,000 ×g에서 15분 동안 원심 분리한 후, 인슐린 방사면역측정법 또는 ELISA 분석을 위해 SNAT 50 µL를 취합니다. 여기서는 NLX라고 명명된 뉴롤리긴(neuroligin) 동형 단백질을 발현하도록 형질전환된 HC 2 93 세포와 INS one 베타 세포를 공배양하여 얻은 결과가 제시되어 있습니다.NLX의 발현은 공동 배양된 INS-1 세포의 기저 및 자극 인슐린 분비를 증가시켰습니다. NLX의 세포외 도메인이 INS-1 세포 표면의 다른 단백질 또는 분자와 상호작용하여 INS-1 세포가 더 많은 인슐린을 분비하도록 유도하는 것으로 보입니다. 공동 배양 시스템을 이용한 다른 유형의 분석 결과는 다음 두 그래프에 나타나 있습니다.첫 번째 그래프에서는 NLY에 의해 공배양된 INS1 세포의 인슐린 함량 증가가 나타나 있습니다. 본 실험에서는 세포층에서 RNA를 수집하여 RT-qPCR로 분석하였습니다. NLY와의 공배양을 통해 인슐린 및 PDX1 mRNA 수준이 증가하였습니다.이 절차 이후에 QPCR 또는 정량적 면역조직화학법과 같은 추가 방법을 수행하여, 형질전환된 단백질의 세포 외 상호작용이 세포 구조나 유전자 발현의 변화를 유도할 수 있는지와 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

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Medicine

의학

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배우세요 췌장 베타 세포의 인슐린 분비에 미치는 세포 외 단백질 상호 작용을 HEK293 세포와의 공배양을 통해 연구하는 방법을. 이 기법은 베타 세포 건강을 해치지 않고 단백질 기능을 분석할 수 있습니다.

췌장의 베타 세포가 인슐린 분비에 영향을 미치는 세포 외 단백질 상호 작용의 배양 분석

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