췌장의 베타 세포가 인슐린 분비에 영향을 미치는 세포 외 단백질 상호 작용의 배양 분석

이 절차의 전반적인 목표는 특정 막관통 단백질의 세포외 도메인과 관련된 세포간 상호작용이 베타 세포 기능, 특히 인슐린 분비에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 것입니다. 이는 두 번째 단계에서 관심 단백질을 포함하는 플라스미드가 있는 포유류 세포주인 첫 번째 transection에 의해 수행됩니다. 베타 세포주는 포유류 세포와 공동 배양됩니다.

마지막 단계에서, 포도당 자극 인슐린 분비를 평가할 수 있도록 포도당 농도가 다른 배지에서 공동 배양을 합니다. 궁극적으로, 인슐린 전파 면역 분석 또는 Eliza's는 배양된 베타 세포가 배지로 분비하는 인슐린 수치를 평가하는 데 사용됩니다. 유전자 과발현 및 넉다운(knockdown)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 mRNA 및 단백질 발현의 교란을 피하고 잠재적으로 베타 세포 건강에 영향을 미치거나 단백질의 특정 상호 작용에 대한 분석을 혼동할 수 있는 방식으로 기능하는 것을 방지한다는 것입니다.

먼저 HEC 2 93 세포를 웰당 0.5ml의 HEC 2 93 배지에 있는 24웰 플레이트로 옮겨 세포가 플레이트 바닥에 고르게 퍼져 있도록 합니다. 우물에서 형성된 파동과 동기화된 속도로 한 번에 한 축을 따라 플레이트를 흔듭니다. HEC 2 93 세포가 100% co fluency에 도달하면 2마이크로리터의 lipo 2000에서 관심 단백질에 대한 플라스미드 코딩 0.8마이크로그램으로 배양물을 transfection합니다.

lipo 프로토콜에 따르면, 시연될 공동 배양의 전체 체계는 비효소 세포 제거제를 사용하여 여기에 묘사되어 있습니다. T 75 배양 플라스크의 바닥에서 약 70 - 80%con 플루엔시로 INS one 세포를 수확하여 이 단계를 시작합니다. 실온에서 150Gs로 3분 동안 셀을 회전시킨 후 P 1000 피펫을 사용하여 펠릿을 INS 1/2 1 1 밀리리터로 재현탁합니다.

그런 다음 배지를 사용하여 10 밀리리터 피펫을 사용하여 24 밀리리터의 혼합 배지를 추가로 첨가하고 HEC 2 9 3 셀을 포함하는 24 웰 플레이트의 웰에서 배지를 흡입하여 세포를 현탁시킵니다. 그런 다음 P 1000 피펫을 사용하여 500마이크로리터의 INS 1세포 현탁액을 웰 측면을 따라 육각 세포층에 부드럽게 추가합니다. 6개의 웰마다 10ml 피펫을 사용하여 INS one 세포를 다시 현탁시킵니다.

다시 균질한 세포 현탁액을 보장합니다. 이제 실험 프로토콜에 따라 24-48시간 동안 세포를 배양합니다. 세포가 원하는 실험 기간 동안 배양된 후, 한 번에 하나의 웰에서 한 손으로 공동 배양 배지를 흡인하고 즉시 배지를 Krebs ringer bicarbonate buffer의 2.5 millimolar glucose 250 microlit로 교체합니다.

co 배양을 1시간 동안 사전 배양한 후, 저혈당 KRB 완충액을 2.5 밀리몰 또는 20 밀리몰 포도당 250 마이크로리터로 교환합니다. 한 시간 더 배양한 후 KRB 버퍼를 마이크로 fuge 튜브로 옮기고 튜브가 원심분리기에 있는 동안 1500Gs 및 섭씨 4도에서 5분 동안 버퍼를 회전시킵니다. 즉시 프로테아제 억제제가 포함된 100마이크로리터의 rippa 세포 용해 완충액을 플레이트에 추가하고 플레이트를 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다.

튜브가 회전을 마치면 인슐린 라디오 면역 분석 또는 Eliza로 나중에 분석할 수 있도록 상층액 200마이크로리터를 제거합니다. 마지막으로, 지금 세포 용해물인 무슨을 10, 000 gs에 15 분 동안 회전시키고 그 후에 인슐린 라디오 면역화학적검정 Eliza에 의하여 분석을 위한 SNAT의 50 마이크로리터를 제거하십시오. 여기서, 본 명세서에서는 NLX라고 하는 신경 리겐 동형을 발현하기 위해 형질주입된 HC 2 93 세포와 INS one 베타 세포를 공동 배양하여 얻은 결과를 나타내고 있습니다.

NLX의 발현은 공동 배양된 I NS one 세포에 의한 기저 및 자극 인슐린 분비를 증가시켰습니다. NX 세포외 도메인은 INS 1 세포가 더 많은 인슐린을 분비하도록 하기 위해 I NS 단일 세포 표면의 다른 단백질 또는 분자와 상호 작용해야 합니다. 공동 배양 시스템을 사용한 다른 유형의 분석 결과는 다음 두 그래프에 나와 있습니다.

이 첫 번째 그래프에서는 NLY에 의한 공동 배양된 INS one 세포의 인슐린 함량 증가를 보여줍니다. 이 실험에서는 세포층에서 RNA를 수확하여 R-T-Q-P-C-R로 분석했습니다. NLY와의 공동 배양은 인슐린과 PDX one mRNA 수치를 증가시켰습니다.

이 절차에 따라 QPCR 또는 정량적 면역조직화학과 같은 추가 방법을 수행하여 형질주입된 단백질의 세포외 상호 작용이 세포 구조 또는 유전자 발현의 변화를 유발할 수 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.