마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원발 섬과 액시나르 세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병 PPDMA의 발병 기전에서 세포내 소통을 연구하는 데 유용한 도구를 제공하였습니다. 현재 쥐로부터 1차 섬을 분리하는 방법은 주로 담관 관식 관에 의존합니다. 이 기술은 담관의 정확한 위치 지정과 관식 삽입을 요구하며, 이후 췌장 실질체 콜라겐제 P 용액의 생체 내 관류가 필요합니다.

전문 교육 없이는 수행하기 매우 어렵고, 효과적이고 효율적인 췌장 관류를 달성하는 것은 도전적입니다. 이 영상은 관류 경험이 없는 연구자들에게 적합한 1차 마운트 섬을 간단하고 빠르게 분리하는 방법을 막고 있습니다. 이 방법은 또한 일차 췌장 액세포를 동시에 획득하여 고품질 섬과 액수액 세포를 충분히 생산할 수 있게 합니다.

연구자들이 병리학적·생리학적 맥락 내에서 실험을 수행할 수 있게 하여, 섬과 선반세포 간의 상호작용 메커니즘을 심층적으로 분석할 수 있게 합니다. 췌장 섬과 췌장 액세포 PAC의 분리. 행크의 균형 소금 용액과 콜라겐제 P 용액을 12웰 플레이트에 추가하고, 50밀리리터 원심분리관에 콜라겐제 P 용액 3밀리리터를 추가하여 이후 소화합니다.

수술 전에 1.25% 트리브로모에탄올로 마취한 후 안락사를 시행합니다. 복부에 V자형 절개를 하여 쥐의 복강을 열어주세요. 왼쪽 건강염려증 부위에 있는 짙은 붉은색 림프구 기관은 비장이고, 비장에 부착된 흰색 기관은 췌장입니다.

위 아래쪽과 췌십이지장 접합부를 따라 췌장을 둔하게 해리합니다. 분리된 췌장 조직을 행크의 균형 잡힌 소금 용액으로 세척하고 잔여된 장간막 부착물, 비장, 췌장 주변 지방 조직을 제거하세요. 사전 처리된 췌장을 12웰 플레이트에 2밀리리터 콜라겐제 P 용액을 미리 첨가한 상태로 옮깁니다.

왼손으로 핀셋으로 췌장을 고정하고, 오른손으로 1밀리리터 주사기로 콜라겐제 P 용액을 췌장 실질에 주입하여 췌장 조직이 투명하고 부유종이 생길 때까지 주입하세요. 췌장을 외과용 가위로 조직 조각으로 1에서 2밀리미터로 빠르게 잘라내세요. 1밀리리터 피펫 팁의 원위부 1에서 1.5센티미터를 잘라 구멍을 확장하고, 이 수정된 팁을 사용해 2밀리리터의 콜라겐제 P 용액과 함께 췌장 조직 조각을 3밀리리터 콜라겐제 P 용액이 미리 적재된 50밀리리터 원심분리관으로 옮깁니다.

원심분리기를 37도 수조에 12분간 보관하고, 이 기간 동안 5분에서 6분마다 부드럽게 흔들어 주세요. 콜라겐제 P 용액의 소화 효과를 종료하기 위해 RPMI 1640 완전 배지 10밀리리터를 추가하세요. 5밀리리터 파스퇴르 피펫으로 펠릿을 15에서 20회 위아래로 반복 자극하여 뚜렷한 큰 조직 덩어리가 남지 않을 때까지 반복하세요.

RPMI 1640 완전 미디엄 10밀리리터를 추가하세요. 그 다음 180 g 원심분리기를 4도 섭씨에서 2분간 가열합니다. 상청액은 버리고, 20밀리리터의 RPMI 1640 완전 매체로 펠릿을 재현탁하세요.

서스펜션을 40메시 체로 걸러내세요. 그 다음 180 g 원심분리기를 4도 섭씨에서 2분간 가열합니다. 상정액을 부드럽게 버리세요.

펠릿을 다시 현탁시키기 위해 20밀리리터의 피콜 용액을 추가하세요. 그 후 천천히 RPMI 1640 완전 미디엄 15밀리리터를 추가하세요. 이 시점에서 투명한 액체 인터페이스를 관찰할 수 있습니다.

640 곱 G로 25도 섭씨에서 20분간 부드럽게 원심분리합니다. 원심분리관을 조심스럽게 제거하고, 5밀리리터 파스퇴르 피펫으로 상단 적색 배지 층을 흡취하세요. 그 후 액체층 경계면에서 액체 함유 섬을 조심스럽게 흡취하여 새로운 50밀리리터 원심분리관으로 옮깁니다.

RPMI 1640 완전 미디엄 20밀리리터를 추가하세요. 180 G 원심분리기를 4도 섭씨에서 2분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다. 펠릿을 RPMI 1640 완전 매체 20밀리리터로 재현탁하세요.

180 G 원심분리기를 4도 섭씨에서 2분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다. 펠릿을 10밀리리터의 RPMI 1640 완전 매체로 재현탁하세요. 그리고 60밀리 세포 배양 접시로 옮겨.

역형 생물 현미경 100배 배율 아래에서 20마이크로리터 피펫을 사용해 수동으로 섬을 골라냅니다. 선택한 아일릿을 24웰 배양판에 500마이크로리터의 RPMI 1640 완전 배지를 미리 적재한 배양판으로 옮깁니다. Ficoll 해의 층을 버립니다.

펠릿을 10밀리리터의 DMEM 완전 매체로 재현탁하세요. 100마이크로미터 셀 체로 걸으세요. 180 G 원심분리기를 4도 섭씨에서 2분 동안 사용하세요.

그리고 상정액은 버려. 펠릿을 10밀리리터의 DMEM 완전 매체로 재현탁하세요. 180 g 원심분리기를 4도 섭씨에서 2분간 원심분리하고 상청액을 버립니다.

그 후 5밀리리터의 DMEM 완전 배지를 넣어 펠릿을 재현탁하여 후속 실험을 수행합니다. 피콜 용액 밀도 구배 원심분리 후, 투명하고 무색 액체층과 매질 사이의 경계 근처에서 관바닥에 퇴적물로 구성된 팩이 관찰되었습니다. 작은 섬들은 보통 둥근 타원형, 황금빛 갈색이며, 쥐당 안정적인 수확량은 120 ± 5개(그림 A와 그림 B)였다. 갓 분리된 PAC는 구형이며 군집되어 있었다.

아시나르 세포는 더 어두운 끝단과 눈에 띄는 자이모겐 과립을 가지고 있었으며, 마우스당 수율은 1.6에서 1.95에 10의 제곱 제곱 배 배를 곱하는 비율이었습니다. 그림 C 및 그림 D. 섬과 아시나르 세포 클라세인 PI 염색은 대부분의 세포가 녹색 칼세인에 살아 있고, 적색 PI는 소수, 죽은 세포임을 보여줍니다. 그림 A. 이미지 J 기반 정량 분석 결과, 분리된 소세포와 아시나르 세포의 생존율은 97.52 ± 0.16%, 96.55 플러스 또는 또는 각각 -0.95%, 그림 B. 췌장 선반 세포를 분리하여 기저 아밀라아제가 0.79 ± 0.01 단위/밀리리터로 나타났습니다. 10 나노 몰라, 20 나노 몰라, 50 나노 몰라 세룰레인으로 자극한 후, 아밀라아제 활성은 각각 1.45 ±0.03 단위/밀리리터, 1.65 ±0.05 단위/밀리리터, 1.39 ±0.02 단위였습니다. 일원 ANOVA 결과, 모든 카에룰린 그룹은 대조군과 유의하게 다른 아밀라아제 활성을 보였으며, 모두 P 값이 0.001 미만이었습니다.

또한, 20 나노몰 그룹은 10 나노몰 그룹과 크게 다르며, P 값이 0.001 미만, 그림 A. 5.6밀몰라 포도당으로 자극했을 때 인슐린 분비에서 0.27 ±0.04 나노그램/밀리리터, 22 밀리몰 포도당으로 자극 시 0.94 ±0.04 나노그램/밀리리터/시간, GSI는 3.44에 해당하며, 그림 B. 본 연구는 복잡한 생체 내 관류 없이 원발 마우스 섬과 췌장 선반세포를 동시에 분리하는 방법을 확립했습니다. 긴 기술적 장벽 덕분에 이 방법은 조작이 용이하며, 마우스당 120개의 ±5개의 아시나스 아시나르 아일렛과 1.6에서 1.95 곱하기 10제곱 7제곱 아시나르 세포를 얻으며, 두 세포 모두 생존율이 96% 이상을 보인다. 분리된 아시너 아일들은 정상적인 포도당 자극 인슐린 분비를 보이고, 아시나르 세포는 카에룰레인 자극에 민감하다. 이는 이 방법으로 얻은 세포가 기능을 온전하게 유지한다는 것을 확인시켜 주어 췌장 외분비 및 내분비 상호작용 연구에 적합함을 의미합니다.

하지만 이 방법은 기본적인 마우스 해부학 지식, 시약 용량 조정, 동시에 처리하는 마우스 수 제한, 검증되지 않은 적용 위험 등으로 제한됩니다. 관류 경험이 부족한 연구자들에게도 신뢰할 수 있는 세포 분리 프로토콜을 제공합니다.