인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

이 프로토콜은 이전에 개발된 프로토콜보다 더 나은 수율로 인슐린 생산 세포에 대한 효과적인 접근 방식으로 인간 배아 줄기 세포의 다단계 분화를 제시합니다. 그런 다음 췌장 전구 유도를 촉진하기 위해 세포 토파민 A와 레티노산을 노출시킵니다. 다음으로 췌장 전구 세포의 인슐린 발현 세포로의 성숙을 매개하기 위해 내피 세포와 공동 배양합니다.

C-펩타이드의 발현과 인슐린 상향 조절을 입증하기 위해 면역형광 현미경 및 QPCR에 의한 기능 분석을 진행합니다. not과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 인슐린의 상향 조절이 더 높을 뿐만 아니라 세포를 발현하는 cpep의 수율이 더 높다는 것입니다. H: 1개의 인간 배아 줄기 세포 콜로니는 12에 12 세포에 직경이 1 내지 1.5 밀리미터 사이이다.

그 동안 D-M-E-M-F 12 매체에 희석된 HESC 마트리겔의 웰당 1밀리리터의 웰 플레이트는 HSC에서 매체를 흡인하고 mts를 교체합니다. 그런 다음 긁어서 세포를 수확하십시오. 15 밀리리터 크로니클 튜브에 추가하고 새로운 MTR 1을 추가 한 다음 12 웰 플레이트의 이전에 matrigel 코팅 된 웰에 1 대 4의 분할 비율로 플레이트를 추가합니다.

일단 증식하면 세포의 직경이 1-1.5mm에 이릅니다. 분화는 활성을 함유하는 결정적인 내배엽 유도 배지와 PI three K 억제제를 추가함으로써 시작됩니다. 4일 동안 사마귀 마닌 양식.

매일 미디어를 보충합니다. 0.2 micromolar KAAD, cycl 도파민을 함유한 완전한 D-M-E-M-F 12에서 24시간 동안 먼저 배양하여 췌장 전구 유도를 진행합니다. 다음으로, 0.2 마이크로몰의 KAAD Cycl 도파민과 2 마이크로몰의 모든 트랜스 레티노산을 포함하는 완전한 D-M-E-M-F 12로 배지를 교환하여 3일 동안 배지 일일 배양을 보충합니다.

분열 전 노치 억제제 DAPT에서 ESC 유래 췌장 전구 세포의 생체 내 성숙을 위한 양성 대조군으로 최종 성숙 단계를 수행하기 전 2일 동안 성숙 배지에 있는 세포. 현미경으로 내피 세포를 검사한 다음 트립 아니스를 사용하여 세포를 접촉성 공동 배양 조건에 대해 계수합니다. 100만 개의 쥐 심장 미세혈관 내피 세포를 완전한 MCDB 1 31 배지의 분화 세포에 추가합니다.

또한 내피 세포와만 함께 공동 배양 배지의 대조 배양을 준비합니다. 모든 치료 조건을 6일 동안 인큐베이터에 넣고 배지를 교체합니다. 매일 분화 과정의 각 단계가 끝날 때 시료 세포를 수집합니다.

엔도 댐, 췌장 전구 및 성숙한 구멍 추출물 RNA는 제조업체의 지침에 따라 추출 키트에 핵 스핀 E-R-R-N-A를 사용합니다. Smart Spec plus 분광 광도계 및 석영 수의사를 사용하여 260나노미터 대 280나노미터의 흡광도 비율로 RNA 품질을 결정할 수 있습니다. 또한 샘플당 100나노그램의 RNA 템플릿으로 샘플 농도를 계산합니다.

즉석 역전사 키트를 사용하여 RT 반응을 수행합니다. thermocycler에 하중 반응을 표시한 프라이머를 사용하여 QPCR 설정을 진행하고 QPCR 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 CT 값을 사용하여 각 분화 단계가 끝날 때 미분화 세포에 대한 타겟 mRNA 발현의 fold 변화를 계산합니다.

실온에서 15분 동안 4%포름알데히드에 세포를 고정합니다. 그런 다음 0.25% Triton X 100을 10분 동안 투여하여 비특이적 염색을 차단합니다. 0.05%TX에 10%당나귀 세럼을 30분 동안 첨가합니다.

다음으로, 차단 버퍼에 1차 항체를 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 0.05% Triton X로 5분 동안 샘플을 세척합니다. 그런 다음 차단에 희석된 2차 항체를 추가하고 완충액을 첨가한 후 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

0.05%x씩 5분 세척을 3회 수행하여 말 염색에서 핵을 1에서 1000까지 유지합니다. PBS에서 희석을 5분 동안 배양한 다음 PBS로 3회 세척합니다. 도립 현미경 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 고정 세포와 염색 세포의 이미지를 획득합니다.

일 동안 미분화 인간 배아 줄기 세포에 사마귀 및 사마귀 마닌의 활성을 첨가하면 최종 내배엽이 유도됩니다. Q-R-T-P-C-R 분석은 예상되는 최종 내배엽 마커의 존재를 확인했습니다. SOX 17, CXCR 4, Fox A 2.

녹색의 SOX 17에 대한 면역 염색은 여기에서 파란색 DPI 염색 핵과의 공동 국소화를 보여줍니다. cyclo, amine 및 rettino acid를 첨가한 후 췌장 전구 세포로의 분화는 췌장 전구 마커의 Q-R-T-P-C-R 및 PDX one에 대한 면역 염색에 의해 확인되었습니다. 분화의 마지막 단계에서, 쥐의 심장 미세혈관 내피 세포와의 접촉 공동 배양은 HESC 유래 췌장 전구 세포에서 인슐린 발현의 상향 조절을 강력하게 유도했습니다.

AC LDL이 RHM VEC로 표시된 L co 배양은 ECS가 플레이트에 부착된 영역을 보여줍니다. 빈 공간이 있는 경우 예상대로 차별화 ESC와 직접 접촉하는 다른 RHM VEC를 찾을 수 있습니다. RHM VEC의 면역 염색에서는 검출 가능한 인슐린 발현이 나타나지 않습니다.

또한 펩타이드 염색은 개발 후 공동 배양 방법을 사용하여 분화된 세포에 유용한 마커입니다. 이 기술을 통해 줄기세포 분화 과정에서 세포 세포의 상호 작용을 조사할 수 있었으며, 이는 분명히 성숙한 표현형의 기능을 증가시킵니다.