Name: 인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 배우세요 인간 배아줄기세포를 췌장 인슐린 생산 세포로 분화시키는 다단계 프로토콜을. 내피 세포 공동 배양이 세포 성숙을 촉진하여 당뇨병 연구에 활용됩니다.

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우리는 116,520 DP2와 ORAU 랄프 포웨 주니어 학부 향상 수상 NIH 새로운 혁신 상을로부터 지원을 인정합니다.

1. 세포 유지 보수 <ol><li> 미디어가 매일 변화와 H1의 hESC (WiCell)는 mTeSR1 미디어 hESC 자격 matrigel 코팅 우물을 유지했다. F12을 : 웰스는 DMEM의 25 ML에 hESC의 matrigel 300 μl를 추가하여 준비 묽은 matrigel 솔루션에 의해 덮여 있었다. 이 matrigel 솔루션 1 ML은 여섯 잘 접시의 각 음에 추가하거나, 400 μl는 12 잘 접시의 각도에 추가하고 실온에서 1 시간 코트에 허용되었다. 전지는 기계들이 1 일, 직경 1.5mm에 도달 한 번 식민지를 위해서 힘든하여 1시 4분의 분할 비율에 passaged되었다. </li><li> RHMVEC은 (VEC 기술) 미디어가 매일 변화 MCDB-131 미디어에서 유지되었다. 80 % 합류가 1시 3분의 분할 비율에 도달한 후에는 세포 trypsinization에 의해 분할되었다. 단락 3과 7 사이의 내피 세포가이 연구에 사용되었다. </li></ol> 2. 증권 솔루션의 작성 <ol><li> Activin은이 무균 P에서 50 μg / ML로 재구성되었다BS는 소 혈청 알부민은 0.1 %를 포함. 솔루션은 -20 ° C.에 aliquoted 및 보관되었다 </li><li> EGF는 멸균 10 밀리미터 초산 500 μg / ML로 재구성되었다. 솔루션은 -20 ° C.에 aliquoted 및 보관되었다 </li><li> 인슐린은 물 10 ML의 0.1 ML 빙초산가 추가로 준비 acidified H 2 O (산도 ≤ 2), 추가로 10 밀리그램 / ML로 재구성되었다. </li><li> DAPT 18 밀리그램 / ML에서 DMSO로 재구성되었다. F12는 aliquoted 및 -20 ° C.에 저장된 : 그것은 더욱 DMEM에 300 μm의 농도로 희석되었다 </li><li> KAAD-Cyclopamine는 5mg/ml에서 DMSO로 재구성되었다. F12는 aliquoted 및 -20 ° C.에 저장된 : 그것은 더욱 DMEM 2 μm의 농도로 희석되었다 </li><li> 모든 트랜스 retinoic 산성은 95 % 에탄올에서 2.7 밀리그램 / ML로 재구성되었다. , F12 aliquoted 및 -80 ° C.에 저장된 : 그것은 더욱 DMEM에 2mM 농도로 희석되었다 </li></ol> 3. 최종 Endoderm (DE) 및 췌장 시조 (PP) 유도 <ol><li> H 한 번ESC의 식민지는 1, 직경 1.5mm 사이에 도달, DE 유도는 DMEM을 추가하여 수행되었다 : F12은 B27, 0.2 % BSA, 4 일 동안 1 μm의의 Wortmannin (주 0 주 4) 미디어 100 NG / ML Activin로 보충 매일 변경합니다. </li><li> DE 유도가 완료가 된 후에, 췌장 전구 유도는 DMEM으로 미디어를 변경하여 의도한 : F12는 24 시간 동안 0.2 μm의 농도 (일 4 일 5)에서 B27, 0.2 % BSA 및 KAAD-Cyclopamine으로 보충. </li><li> 24 시간 이내에 미디어는 DMEM으로 변경되었습니다 : F12 같이 보충 B27, 0.2 % BSA, 미디어가 매일 변화가있는 3 일간 0.2 μm의 농도 및 2 μm의 농도에서 모든 트랜스 retinoic 산 (주 5 일 8)에서 KAAD-Cyclopamine . </li></ol> 4. 췌장 성숙 <ol><li> PP 유도 후 모든 그룹은 DMEM으로 구성된 성숙 미디어로 변경되었습니다 F12 2 D를 위해 B27, 0.2 % BSA, 10 밀리미터 니코틴, 25 μg / ML 인슐린, 30 NM 나이 SEO 세 및 50 μg / ML 트랜스페린로 보충매체와 ays은 (주 8 주 10) 매일 변경합니다. </li><li> 성숙 미디어 2 일 후에 최종 성숙 단계는 병렬 비교를 위해 여러 가지 조건을 사용하여 수행됩니다. 은 (i) 제어와 같은 내피 세포없이, 오직 공동의 문화 미디어를 사용하여 그리고 (iii) RHMVEC 세포와 접촉 공동 문화를 사용하여 노치 억제제 DAPT (2)를 사용하여 차별화는 다음 조건 하에서 유도되었다. 전지는 미디어가 매일 변화와 함께 (주 10 주 17) 주일 동안 DAPT 또는 공동의 문화 매체에 유지되었다. <ol><li> DAPT 미디어는 30 μm의 제품 DAPT으로 성숙 미디어를 보완하여 작성됐다. 이 그룹에있는 세포는 6 일 (주 11 주 17)에 대해 처음 24 시간 동안 MCDB131를 완료하기 위해 노출하고 DAPT 미디어에 노출되었다. </li><li> 공동 문화 미디어와 MCDB-131 미디어를 보완하여 준비되었다 B27, 0.2 % BSA, 10 밀리미터 니코틴, 10 NG / ML EGF, 1 μg / ML의 하이드로코티손, 10 밀리그램 EndoGro, 90 μg / ML의 헤파린. 미디어 제어 조건의 경우 차별 세포가 노출되었다미디어 육일 (주 11 주 17) (없음 내피 세포)에 대한 공동의 문화 미디어로 변경되었습니다 그 이후 24 시간 동안 MCDB-131 완전한 매체 (일 10 일 11)에. </li><li> 연락처 공동 배양 조건의 경우 백만 RHMVEC은 첨부 파일을 허용하도록 24 시간 동안 완전한 MCDB-131 미디어의 차별화 세포 (VEC 기술) (주 10 주 11)에 추가되었습니다. 24 시간 미디어 매체 6 일 (주 11 주 17)에 대해 공동의 문화 미디어로 변경되었습니다 후 매일 변경합니다. </li></ol></li></ol> 5. qRT-PCR 분석 <ol><li> 분화의 각 단계 (; 췌장 전구, endoderm 성숙 섬)의 끝에 lysed되었으며 RNA는 제조 업체의 지침에 따라 NucleoSpin RNA II 추출 키트를 사용하여 추출되었습니다. </li><li> RNA 품질 SmartSpec 플러스 분광 광도계를 사용하여 RNA의 양을 정함 다음, 260 nm의 및 280 nm의에서 RNA의 흡광도를 선택하여 분석되었다. </li><li> 역방향 전사는 ImProm II 리버스 전사 K를 사용하여 수행되었다그것은 제조 업체의 지시에 따라. 모든 반응은 RNA의 100 NG로 수행되었다. </li><li> qRT-PCR은 제조 업체의 지시에 따라 Mx3005P QPCR 시스템 (애질런트)와 브릴리언트 II SYBR 녹색 QPCR 마스터 믹스를 사용하여 수행되었다. 사용된 primers는 표 1에 나열됩니다. 초기화 단계 50에서 수행된 10 분 동안 95 ° C이어서 2 분을 ° C에서. 50 증폭주기는 다음과 같이 수행되었다 : 95 ° 30 초 C 54 ° 30 초 1 분 72 ° C에 대한 C #. </li><li> undifferentiated 세포 이상의 타겟 mRNA의 표현의 공간 변경 사항은 다음과 같은 수식을 사용하여 중부 표준시 값으로부터 계산되었다 : ΔCT (마커 I) = 중부 표준시 (마커 I) - 중부 표준시 (GAPDH) Δ ΔCT (마커 I) = ΔCT (마커 I) (샘플) - ΔCT (마커 I) (Undifferentiated 세포) 상대 표현 (마커 I) = 2-ΔΔCT(마커 I) </li></ol> 6. Immunocytochemistry <ol><li> 분화의 각 단계 (; 췌장 전구, endoderm 성숙 섬)의 끝에서 전지는 상온에서 15 분 동안 4 % 포름 알데히드에서 수정되었습니다. </li><li> 고정 세포는 트리톤 X-100 (TX) 15 분 동안 0.25 %를 사용 permeabilized되었다. </li><li> 비 특정 염색법은 30 분 동안 TX 0.05 %에서 10 % 당나귀 혈청에서 부화에 의해 차단되었습니다. </li><li> 일차 항체 배양은 4에서 하룻밤을 수행한 권장 항체 희석 (표 1 참조)에서 버퍼를 차단에서 ° C #. </li><li> 셀은 5 분 동안 0.05 %, 텍사스 세 번 함께 씻겨 있었다. </li><li> 차 항체 보육는 버퍼를 차단에 희석 적절한 항체와 어두운 실내 온도에 하나의 시간 동안 수행되었다. </li><li> 셀은 5 분 동안 0.05 %, 텍사스 세 번 함께 씻겨 있었다. </li><li> 핵 염색법은 PBS에서 1:1000 희석에 얼룩 Hoescht과 부화에 의해 수행되었다PBS로 3 세차장 뒤에는 15 분. </li><li> 고정 및 스테인드 세포 올림푸스 IX81 거꾸로 현미경과 Metamorph 이미징 소프트웨어를 사용하여 몇 군데 있었다. </li></ol> 7. 대표 결과 드 마커 Sox17, Cxcr4 및 Foxa2위한 qRT-PCR 분석에 의해 확인 및 그림 2에 그림과 같이 Sox17 위해 immunostaining로 Activin의 추가는 4 일 동안 undifferentiated hESC에 Wortmannin 확실한 endoderm을 유도합니다. cyclopamine 및 retinoic 산성의 추가 후 췌장 전구 세포로 분화가 췌장 전구 마커와 그림 3 그림과 같이 Pdx1 위해 Immunostaining의 qRT-PCR에 의해 확인되었다. 분화의 마지막 단계에서는 강력히 hESC 파생된 췌장 전구 세포에서 인슐린 표현의 upregulation을 유도 RHMVEC 세포와 공동 문화를 문의하십시오. 공동 문화 매개 차별의 효율성을 공동으로 분석되었다DAPT를 사용하여 컨트롤 상태와 mparing. 그것이 현재 췌장 성숙을 달성하는 데 가장 널리 사용되는 방법 중 하나이기 때문에 DAPT는 긍정적인 제어로 사용되었다. 공동 문화 내피 세포의 지원 요인에 의해 보완 수정된 미디어에서 수행된 이후, 추가적인 컨트롤은 차별화에 대한 미디어의 영향을 확인하는 내피 세포의 부재에서 미디어로 수행되었다. 이 분석의 세부 내용은 그림 4에 표시됩니다. <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" /> 그림 1. 인슐린 표현 세포로 hESC의 차별 화를위한 다단 프로토콜. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" /> 그림 2. 인간 배아 줄기 세포의 확실한 endoderm 유도. 그리고 Wortmannin 4 일동안 Activin에 노출 hESC 세포의 대표 드 마커) qRT-PCR 분석. 결과 AR<html> e는 undifferentiated hESC에 대하여 정규화. B) Sox17 염색법 (녹색) 및 DAPI는 (파란색) Sox17의 핵 표현을 보여줍니다. 스케일 바 : 50 μm의. <img alt="그림 3." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" /> endoderm 세포를 파생 배아 줄기 세포의 그림 3. 췌장 전구 유도. DE 유도 후 4 일동안 cyclopamine 및 retinoic 산성에 노출된 hESC 파생된 endoderm 세포를 초기에 췌장 마커) qRT-PCR 분석. 결과 undifferentiated hESC에 대하여 정규화. B) Pdx1 염색법 (보라색) 및 DAPI는 (파란색) Pdx1의 핵 표현을 보여줍니다. 스케일 바 : 50 μm의. &quot;&gt; <img alt="4 그림." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" /> 그림 4. 췌장 성숙 단계) qRT-PCR의 hESC의 췌장 호르몬 분석 DAPT을 사용하여 췌장 성숙 후, 공동 문화 또는 공동 문화 미디어 (제어)에게 문의하십시오. 결과 undifferentiated hESC에 대하여 정규화. P는 학생 T-시험에 의해 얻은 값. Dil-AC-LDL로 분류 RHMVEC (적색)와 B) 공동 문화가 빈 공간 (위)가있는 경우 내장 컴퓨터 시스템은 플레이트에 연결 영역을 보여주고, 다른 RHMVEC은 차별 ESC (아래)와 직접 접촉에서 찾을 수 있습니다. 공동 배양 방법을 사용하여 차별화된 세포를위한 C) C-펩타이드 (녹색) 염색법. 스케일 바 : 12.5 μm의 (위)와 50 μm의 (아래) D) RHMVEC의 Immunostaining은 RHMVEC에는 인슐린 표현을 보여줍니다 않습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 마커 </td><td> Primer1 (5 &#39;3&#39;) &lt;/ TD&gt; <td> Primer2 (5 &#39;3&#39;) </td><td> 심판 </td></tr><tr><td> SOX17 </td><td> CTCTGCCTCCTCCACGAA </td><td> CAGAATCCAGACCTGCACAA </td><td> 12 </td></tr><tr><td> CXCR4 </td><td> CACCGCATCTGGAGAACCA </td><td> GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT </td><td> 4 </td></tr><tr><td> FOXA2 </td><td> GGAGCGGTGAAGATGGAA </td><td> TACGTGTTCATGCCGTTCAT </td><td> 12 </td></tr><tr><td> PDX1 </td><td> AAGTCTACCAAAGCTCACGCG </td><td> GTAGGCGCCGCCTGC </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PTF1 </td><td> CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG </td><td> GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC </td><td> 12 </td></tr><tr><td> HLXB9 </td><td> CACCGCGGGCATGATC </td><td> ACTTCCCCAGGAGGTTCGA </td><td> 4 </td></tr><tr><td> HNF6 </td><td> TGTGGAAGTGGCTGCAGGA </td><td> TGTGAAGACCAACCTGGGCT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PAX6 </td><td> CGAATTCTGCAGGTGTCCAA </td><td> ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NKX6.1 </td><td> AGACCCACTTTTTCCGGACA </td><td> CCAACGAATAGGCCAAACGA </td><td> 5 </td></tr><tr><td> ISL1 </td><td> GATCTATGTCACCTCGCAAGG </td><td> TACAACCACCATTTCACTG </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 글루카곤 </td><td> AGGCAGACCCACTCAGTGA </td><td> AACAATGGCGACCTCTTCTG </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> AAGAGGCCATCAAGCAGATCA </td><td> CAGGAGGCGCATCCACA </td><td> 12 </td></tr></tbody></table> 표 1. Primers는 qPCR 반응을 위해 사용됩니다.

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

췌장 개발 과정, 차별 췌장 세포는 대동맥의 내피 세포와 근접 거리에 있습니다, 또한, 췌장 islets은 혈당과 섬 호르몬의 신속한 교환을 촉진하기 위해 밀도가 높은 vascularized 있습니다. 이러한 사실을 감안할 때, 그것은 내피 세포가 췌장 organogenesis의 과정에서 중요한 역할을하는 놀라운 일이 아닙니다. 췌장 개발하는 동안 내피 세포의 중요성이 점점 더 높이 평가되는 반면 배아 세포의 시험 관내 분화의에서의 역할은 덜 조사하고 있습니다. 우리의 이전 보고서에서 우리는 마우스 배아의 줄기 세포 13 췌장 성숙에 대한 내피 세포의 긍정적인 역할을 설립했습니다. 현재의 연구에서 우리는 인간 배아 줄기 세포를 차별에 내피 세포 신호 전달의 효과를 조사. 다수의 내피 세포가이 프로토콜에 사용했다고하는 모든 유사한 전반적인 효과 althou 결과분화의 효율성 변화와 GH. 현재 보고서에서는 쥐의 심장 microvascular ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 농도 </td></tr><tr><td> mTeSR1 (보충제 포함) </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESC 자격 matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354,277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM : F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td> Invitrogen </td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 (완료) </td><td> VEC 기술 </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> 를 Activin </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/ml </td></tr><tr><td> Wortmannin </td><td> Invitrogen </td><td> W3144 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C4116 </td><td> 0.2μM </td></tr><tr><td> 모든 거래 Retinoic 산성 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> R2625 </td><td> 2μM </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D5942 </td><td> 30μM </td></tr><tr><td> 니코틴 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> N0636 </td><td> 10 MM </td></tr><tr><td> 나트륨 Selenite </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S5261 </td><td> 30 NM </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I1882 </td><td> 25 μg / ML </td></tr><tr><td> 트랜스페린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T8158 </td><td> 50 μg / ML </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td> 10ng/ml </td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VEC 기술 </td><td> ENDOGRO </td><td> 10mg </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td> 하이드로코티손 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H0888 </td><td> 1μg/ml </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey Nagel </td><td> 740,955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm II의 역방향 전송 시스템 </td><td> Promega </td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td> 똑똑 II SYBR 녹색 QPCR 마스터 믹스 </td><td> Straragene </td><td> 600,548 </td><td></td></tr><tr><td> Sox17 염소 polyclonal IgG </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC-17355 </td><td> 500분의 1 </td></tr><tr><td> PDX1 염소 polyclonal IgG </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC-14662 </td><td> 500분의 1 </td></tr><tr><td> polyclonal C-펩타이드의 토끼 </td><td> 세포 시그널링 </td><td> 4593 </td><td> 500분의 1 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 488 당나귀 안티 - 토끼 IgG </td><td> Invitrogen </td><td> -21206 </td><td> 1,000분의 1 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 647 당나귀 안티 산양 IgG </td><td> Invitrogen </td><td> -21447 </td><td> 1,000분의 1 </td></tr></tbody></table> 표 2. 시약 및 키트.

인간 배아의 내피 세포 공동 배양 mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

배아 줄기 세포 (ESC)는 두 가지 주요 특징이있다 : 그들은 무기한 따라서 여러 lineages으로 차별화하는 잠재력을 가지고, undifferentiated 상태로 체외에서 증식들이 pluripotent가 될 수 있습니다. 이러한 속성은 세포 기반 치료 및 재생 치료에 응용 1 ESCs 매우 매력적합니다. 그러나 실현하기위한 잠재력을 위해 전지 발굴 작업입니다 성숙하고 기능적인 phenotypes,로 구분해야합니다. 세포 분화를 유도에서 유망한 접근 방법은 밀접하게 관련 체외 환경에서 organogenesis의 경로를 모방하는 것입니다. 췌장 개발은 간, 췌장 등 여러 장기,로 개발할 수 endoderm,로 시작하는 구체적인 단계 2에서 발생하는 것으로 알려져 있습니다. Endoderm 유도는 여러 가지 성장 요인 4-7과 함께 3 Activin의 추가를 통해 결절 통로의 변조에 의해 달성될 수 </&gt;를 한모금. 최종 endoderm 세포 그러면 cyclopamine 8 이외에 의해 체외로 얻을 수있는 소닉 고슴도치 억제의 억제에 의해 췌장 약속을 받고있다. 췌장 성숙은 노치 신호 전달의 억제 등 여러 병렬 이벤트에 의해 매개되며 췌장 progenitors의 집합 3-dimentional 클러스터로, vascularization의 유도, 몇 이름을 지정합니다. 지금까지 가장 성공적인 ESC 파생 췌장 전구 세포의 체외의 성숙에 의해 DAPT의 보완 9 신호를 노치의 억제를 통해 달성되었습니다. 성공 있지만, 기능 제한이있는 성숙한 표현형의 낮은 수확량이 발생합니다. 덜 연구 영역은 점점 더 인 - 생체내 췌장 섬의 성숙 10,11에 중요한 기여 요인으로 평가되고 췌장 성숙에 신호 내피 세포의 효과입니다. 현재의 연구는 endothel 같은 효과를 탐구ial 세포는 섬 같은 세포를 생산하는 인슐린으로 인간의 Esc를 파생 췌장 전구 세포의 성숙에 신호. 우리가 인간 ESCs 처음 PI3K 경로의 억제와 함께를 Activin하여 endoderm 향해 유도되는 다단 감독 차별 프로토콜을보고합니다. endoderm 세포의 췌장 사양 Retinoic 산성의 추가에 의해 retinoid 유도와 함께 Cyclopamine에 의한 음파 고슴도치 신호의 억제에 의해 이루어진다. 성숙의 마지막 단계는 공동 문화 구성에 의해 달성될 내피 세포 신호에 의해 유도된다. 여러 내피 세포가 공동 문화에 테스트한 동안 본 우리는 주로 분석의 용이성을 위해, 쥐 심장 microvascular 내피 세포 (RHMVEC)와 함께 우리의 데이터를 제시.

현재의 연구는 인간 배아 줄기 세포를 췌장 분화를 유도으로 이동 차별화 접근 방식에 대해 설명합니다. 큰 의미 중 인슐린을 표현하는 세포로 췌장 progenitors을 얻은​​ 인간 배아 줄기 세포를 찾는 것이 내피 세포 공동 배양 mediates의 성숙입니다.

인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

배아줄기세포(ESC)는 두 가지 주요 특징을 가지고 있습니다. 첫째, 분화되지 않은 상태로 체외에서 무한히 증식할 수 있으며, 둘째로...

본 프로토콜은 기존에 개발된 프로토콜보다 높은 수율로 인슐린 생성 세포를 얻기 위한 효과적인 방법으로서 인간 배아 줄기 세포의 다단계 분화 과정을 제시합니다. 먼저 active in a 및 PI three K 억제제를 사용하여 definitive endoderm을 유도합니다. 그런 다음, 췌장 전구세포 유도를 촉진하기 위해 세포를 topamine A 및 레티노산에 노출시킵니다. 마지막으로, 췌장 전구세포가 인슐린 발현 세포로 성숙하도록 혈관 내피 세포와 공동 배양합니다.면역형광 현미경 분석 및 QPCR을 통한 기능 분석을 진행하여 C-peptide의 발현과 인슐린의 상향 조절을 입증하십시오. 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 발현 세포 배양 시 인슐린의 더 높은 상향 조절과 더 많은 양의 cpep 수율을 얻을 수 있다는 점입니다. 인간 배아줄기세포 콜로니를 직경 1에서 1.5mm 크기로 배양하여 세포를 CO 12로 처리하십시오.그동안 12-well plate의 각 웰에 D-M-E-M-F 12 배지로 희석한 HESC matrigel을 1 mL씩 분주합니다. 그 후 HSCs에서 배지를 흡입하여 제거하고 mTR-1으로 교체합니다. 이어서 스크래핑(scraping) 방식으로 세포를 수확합니다. 수확한 세포를 15 mL 원심분리 튜브에 옮기고 신선한 mTR-1을 첨가한 다음, 이전에 matrigel을 코팅한 12-well plate의 웰에 1:4 분할 비율로 플레이팅합니다.증식 중인 세포의 직경이 1~1.5mm에 도달하면, activin A와 PI3K 억제제인 wortmannin이 포함된 확정 내배엽 유도 배지를 첨가하여 분화를 시작합니다. 4일 동안 배양합니다.배지를 매일 보충합니다. 먼저 0.2 µM KAAD, cycl dopamine이 포함된 완전 D-M-E-M-F 12에서 24시간 동안 배양하여 췌장 전구세포 유도를 진행합니다. 그다음, 배지를 0.2 µM KAAD Cycl dopamine과 2 µM all trans retinoic acid가 포함된 완전 D-M-E-M-F 12로 교체하고, 배지를 매일 보충하며 3일 동안 배양합니다.분할 전 notch 억제제 DAPT를 처리한 ESC 유래 췌장 전구세포의 in vivo 성숙에 대한 양성 대조군으로서, 최종 성숙 단계를 수행하기 전 이틀 동안 성숙 배지에서 세포를 배양합니다. 현미경으로 혈관 내피세포를 관찰한 후, 접촉 공동 배양 조건을 위해 세포를 트립신 처리하고 수를 측정합니다. complete MCDB 1 31 배지로 분화 중인 세포에 1 million 개의 쥐 심장 미세혈관 내피세포를 첨가합니다.또한 혈관 내피세포만 포함된 공동 배양 배지를 사용하여 대조군 배양액을 준비합니다. 모든 처리 조건을 인큐베이터에 넣고 배지를 교체하며 6일 동안 배양합니다. 분화 과정의 각 단계가 끝날 때마다 매일 샘플 세포를 수집합니다.제조사의 지침에 따라 nucleus spin E-R-R-N-A 추출 키트를 사용하여 Endo dam, 췌장 전구세포 및 성숙한 eyelet 추출 RNA를 추출합니다. smart spec plus 분광광도계와 쿼츠 큐벳을 사용하여 260 nm 대비 280 nm의 흡광도 비율로 RNA 품질을 결정합니다. 또한 샘플당 100 ng의 RNA 템플릿을 사용하여 샘플 농도를 계산합니다.impromptu reverse transcription kit를 사용하여 RT 반응을 수행합니다. 표시된 프라이머를 사용하여 QPCR 설정을 진행하고, 반응액을 thermocycler에 로드한 후 QPCR 프로그램을 실행합니다. 그 후 CT 값을 이용하여 각 분화 단계의 끝에서 미분화 세포 대비 표적 mRNA 발현의 fold change를 계산합니다.세포를 4% formaldehyde에 넣고 상온에서 15분 동안 고정합니다. 그 후 비특이적 염색을 차단하기 위해 0.25% Triton X 100으로 10분 동안 투과화시킵니다. 0.05% TX에 10% donkey serum을 첨가하여 30분 동안 처리합니다.다음으로, 블로킹 버퍼에 희석한 1차 항체를 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 0.05% Triton X로 시료를 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 블로킹 버퍼에 희석한 2차 항체를 첨가하고 암실 상태의 상온에서 1시간 동안 배양합니다.0.05%x로 5분씩 세 번 세척한 후, PBS에 1:1000으로 희석한 horse stain으로 핵을 5분간 염색합니다. 이어서 PBS로 세 번 세척합니다. 도립 현미경과 이미징 소프트웨어를 사용하여 고정 및 염색된 세포의 이미지를 획득합니다.미분화 인간 배아 줄기세포에 activin A와 wnt3a를 4일 동안 처리하면 definitive endoderm이 유도됩니다. qRT-PCR 분석을 통해 예상되는 definitive endoderm 마커인 SOX 17, CXCR 4 및 Fox A 2의 발현이 확인되었습니다.초록색으로 나타난 SOX 17의 면역 염색 결과는 여기서 파란색 DPI로 염색된 핵과 공국소화됨을 보여줍니다. cyclo, amine 및 rettino acid 첨가 후 췌장 전구세포로의 분화는 췌장 전구세포 마커의 Q-R-T-P-C-R 및 PDX one에 대한 면역 염색을 통해 확인되었습니다. 분화의 최종 단계에서, 쥐 심장 미세혈관 내피세포와의 접촉 공동 배양은 HESC 유래 췌장 전구세포에서 인슐린 발현의 강력한 상향 조절을 유도하였습니다.AC LDL로 표지된 RHM VEC와 L의 공동 배양 시 ECS가 플레이트에 부착된 영역이 관찰됩니다. 빈 공간이 있는 경우, 예상대로 분화 중인 ESC와 직접 접촉하고 있는 다른 RHM VEC를 확인할 수 있습니다. RHM VEC의 면역 염색 결과, 인슐린 발현은 검출되지 않았습니다.Eptide 염색은 공동 배양법 개발 이후, 이 방법을 사용하여 분화된 세포를 확인하는 유용한 마커로도 활용됩니다. 이 기술을 통해 줄기세포 분화 과정에서의 세포 간 상호작용을 조사할 수 있었으며, 이는 성숙한 표현형의 기능성을 분명하게 향상시키는 것으로 나타났습니다.

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생물학

분리하는 프로토콜은, 인간 태아의 췌장 세포에서 파생 된 문화, 이미지 섬 세포 클러스터 (ICCS)를 설명한다. 이 방법은 조직, 문화, 단일 층으로 또는 집계 등의 현탁액 및 확산 마커와 췌장 세포의 운명 결정에 대한 이미지에서 ICCS을 생성하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다.

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

여기에서는 성인 피부 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 변환할 수 있는 새로운 방법을 제시합니다. 이 기술은 후성유전학적 변환을 기반으로 하며, 레트로바이러스 벡터의 사용이나 안정적인 만능 상태의 획득을 포함하지 않습니다. 따라서 중개 의학 응용 분야에 매우 유망합니다.

성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환

여기에서는 시험 관내 NKX6-1 + 췌장 전구 세포에 인간 배아 줄기 세포가 분화하는 4 단째의 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포의 종류에 적용될 수있다.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

이 프로토콜은 생체 외에서췌장 계보로 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 두 가지 다른 유도 프로토콜 사이의 비교를 제시합니다 : 통합 프로토콜 및 비 통합 프로토콜. 통합 프로토콜은 더 많은 인슐린 생산 세포(IPC)를 생성합니다.

시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도

본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

줄기세포를 섬세포로 분화하는 것은 기존의 당뇨병 치료 및 질병 모델링에 대한 대안을 제공합니다. 상용 분화 키트와 이전에 검증된 방법을 결합하여 접시에서 인슐린 분비, 줄기 세포 유래 섬을 생성하는 데 도움이 되는 자세한 줄기 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

이 비디오에서 우리는 우리의 실험실은 정기적으로 트립신과 색채 인간 배아 줄기 세포 라인을 통로 방법을 보여줍니다.

트립신과 Passaging 색채 인간의 배아 줄기 세포 - 라인

배우세요 인간 배아줄기세포를 췌장 인슐린 생산 세포로 분화시키는 다단계 프로토콜을. 내피 세포 공동 배양이 세포 성숙을 촉진하여 당뇨병 연구에 활용됩니다.

인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

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