Name: 유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 배우세요 유동 세포 계측법을 이용하여 인간 호중구에서 NF kappa B와 같은 핵 인자 활성화를 정량적으로 감지하는 방법을. 이 기술은 면역 세포의 신호 전달 경로 연구에 필수적인 도구입니다.

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저자는 그녀의 기술 지원을 위해 낸시 모라 감사드립니다. 이 작품은 Consejo Nacional 드 Ciencia Y Tecnologia, 멕시코에서 연구 보조금 48,573-M과 168,098 의해 보조금 IN212308 및 IN205311-2 Direccion에서 일반 드 Asuntos 델 개인 Academico, Universidad Nacional Autonoma 드 멕시코, 멕시코에 의한 자금을 지원했다.

1. 인간의 피에서 호중구의 절연 (PMN) <ol><li> 항응고제로 헤파린 (10 U / ML)로 약 20 ML 인간의 피를 사용하십시오. 피 venopuncture으로 성인 건강 자원 봉사자로부터 수집되었다. UNAM - 모든 실험은 Instituto 드 Investigaciones Biomédicas의 생명 윤리위원회의 승인하에 수행되었다. </li><li> 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 PBS에서 6% dextran T500의 2 ML을 넣고 혈액의 10 ML를 추가합니다. 반전 지하철로 두 세 번 혼합하고 적혈구 침강을 할 수 있도록 45 분에 앉아 보자. </li><li> 신선한 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브의 5 ML Ficoll-Paque두고. </li><li> sedimented 적혈구 위에 형성 백혈구 풍부한 플라즈마을 가지고, 신중하게 두 번째 층을 형성 Ficoll-Paque 상단에 피펫. 두 단계가 있는지 확인합니다. </li><li> 4 ° C.에 20 분에 516 XG에 원심 분리기 원심 분리 한 후, 플라즈마 및 Ficoll-Paque의 계면에서 mononuclear 세포의 층이 있습니다. NEutrophils는 튜브의 하단에 있습니다. </li><li> 표면에 뜨는을 제거, 선반 위에 튜브를 활용하여 세포 펠렛을 아프게하고, 감기의 10 ML (4 ° C) PBS 참고 추가하여 세포를 resuspend :. 최대 pipetting하여 세포를 Resuspending이 너무이기 때문에 다운이 권장하지 않습니다를 세포에 손상. </li><li> 4 ° C.에서 5 분 동안 290 XG에서 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송 </li><li> 이전처럼 세포 펠렛을 부숴 10 감기 ML (4 ° C) 적혈구를 lyse 할 수 hypotonic 솔루션 (0.2 % NaCl, 1 % BSA, 20 MM Hepes, 산도 = 7.4).을 추가 정확히 1 분 손으로 부드럽게 관을 회전하여 섞는다. </li><li> 10 감기 ML (4 ° C) hypertonic 솔루션 (1.6 % NaCl, 1 % BSA, 20 MM HEPES, pH를 = 7.4), 믹스와 hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다 (일반적으로&gt; 95 %는 PMN합니다.)을 추가 참고 : 셀을 계산하는 동안 얼음에 세포 현탁액으로 관을하세요. </li><li> 이전처럼 원심 분리기와 10 PMN을 resuspend추위 7 셀 / ML (4 ° C) PBS. 얼음 계속. 참고 : 호중구는 4에서 가능한 및 기능 유지 8-6에 대한 시간에 대한 ° C. </li></ol> 2. PMN 활성화 <ol><li> 100 PMN의 정지 μl (1 × 10 7 셀 / ML) 1.5 ML Eppendorf 튜브에. 놔 참고 : 샘플 튜브가 최소 중복으로 수행해야합니다. 대개 부정적인 컨트롤은 만 사용 항체, 및 보조 항체를 포함해야합니다. </li><li> 10 μg / ML에서 해당 항 인테그린 또는 안티 FC 수용체 단클론 항체 (적인 mAb)를 추가하고 15 분에 얼음에 품다. </li><li> 한 감기 ML (4 ° C) PBS, microcentrifuge에서 1,743 XG (4,500 RPM)에서 centrifuging하고 표면에 뜨는을 aspirating.을 추가하여 PMN을 씻으십시오 </li><li> 랙에 대한 관의 하단을 클릭하여 세포 펠렛을 부숴, 1 ML 차가운 PBS를 추가하고 두 번 이전 단계에서와 같이을 씻는다. 참고 :이 언 바운드 항체를 제거 씻는다. </li><li> 동일한에 Resuspend의 PMN (에따뜻한의 itial) 볼륨 (37 ° C) PBS는 F의 60 μg / ML (AB &#39;) 2 염소 안티 - 마우스 IgG를 포함하는. 참고 : 보조 안티 마우스 IgG 항체가 첫 번째 반 수용체 항체에 바인딩되며, 수용체의 crosslinking가 발생합니다. </li><li> 관심 핵 요인에 따라 1-20 분에 대해 37 ° C에서 알을 품다. NF-κB 보통 15 분을 위해, 그리고 보통 엘크-1 5 분에. 참고 : 37에서 셀을 잠복기가 4시에 개최 할 수 없습니다 ° C 유도 수용체 crosslinking, ° C. </li><li> 한 ML 차가운 PBS를 추가하고 microcentrifuge에서 1,743 XG에서 3 분 원심 분리기. </li><li> 표면에 뜨는 제거 </li><li> dry-ice/ethanol 욕조에서 즉시 PMN 10 분 동안 거기를 유지 멈춰 봐. </li></ol> 3. 핵의 절연 및 고정 <ol><li> 100 μl 추위에 Resuspend 냉동 PMN 펠릿 (4 ° C) hypotonic 버퍼 (10 MM의 HEPES, 10 MM KCl, 1.5 MM MgCl 2, 1 ㎜ 갓 부가 DL-dithiothreitol [DTT], 산도 = 7.9). 그것은 하나 dry-ice/ethanol 욕조 하나의 튜브를 꺼내하고, hypotonic 버퍼를 추가하기 전에 관의 바닥을 청소 닦아 것이 좋습니다. </li><li> 얼음에 장소, 그리고 trypan 파랑과 핵 정지의 나누어지는 얼룩에 의해 핵의 무결성을 확인합니다. 핵은 원형과 파란색 봐. 그대로 PMN는 물들, 그리고 세포 파편이 불규칙 모양의 푸른 색 입자로 표시되지 않습니다. 참고 : 핵 서스펜션은 많은 손상 셀이나 먼지가 포함 된 경우는 준비를 버리고 다른 샘플과 절차를 반복하는 것이 좋습니다. </li><li> 감기 객실 내 10 분에 microcentrifuge에 775 XG (3,000 RPM)에서 핵을 원심 분리기. 이 포인트 핵에서 매우 약한 및 엑스트라 케어 샘플은 추위와 과도한 힘에 centrifuging하지 유지에서 촬영해야합니다. </li><li> 아주 조심 pipetting하여 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 핵 문제를 해결하기 위해 PBS에 찬 4 % paraformaldehyde 100 μl를 추가합니다. 참고 : 펠렛은 매우을 상실합니다D 버퍼를 추가하면 핵을 resuspend에 충분하다. 아래로 Pipetting하며 피해야한다. </li><li> 20 분에 얼음에 품다. </li><li> Immunolabel의 유동 세포 계측법을위한 핵 또는 4에서 최대 24 시간까지 위해를 유지 ° C. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 분석을위한 핵의 Immunolabeling <ol><li> 1 분에 microcentrifuge에서 1,743 XG (4,500 RPM)에서 핵을 원심 분리기, 매우 부드러운 pipetting하여 표면에 뜨는 제거합니다. </li><li> 100 감기 μl (4 ° C) 0.1 % 트리톤 X-100, 핵을 permeabilize하기 위해 PBS에 4 % paraformaldehyde.을 추가 10 분 동안 얼음에 품다. </li><li> 원심 분리기는 microcentrifuge에서 1,743 XG에서 핵을 permeabilized 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거합니다. 이 시점에서 핵 알약은 튜브의 하단에 잘 부착하지 않습니다. 이 펠릿을 떨어 도착하면 다시 원심 분리기하는 것이 좋습니다. </li><li> 특이 현상 바인딩 사이트를 차단하고 20 분에 얼음을 품다하기 위해 PBS에 찬 4% 태아 소 혈청 (FBS) 500 μl에 Resuspend 핵. 원심 분리기1743의 핵은 microcentrifuge에서 3 분 동안 XG 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 4퍼센트 FBS와 2.5 μg / 관심의 핵 요소에 대한적인 mAb의 ML을 포함하는 차가운 PBS 100 μl에 핵을 Resuspend. 20 분에 얼음에 품다. 참고 : 대개 부정적인 컨트롤은 안티 핵 인자 항체를 포함 FITC-라벨 차 항체 만합니다. </li><li> 4퍼센트 FBS와 3 분에 1,743 XG에서 centrifuging과 차가운 PBS 500 μl를 두 번 씻으십시오. </li><li> 4퍼센트 FBS 및 10 μg / 해당 FITC-라벨 차 항체의 ML을 포함하는 차가운 PBS 100 μl에, 아주 조심 resuspend 핵을 표면에 뜨는을 제거하고, 20 분에 얼음에 품다. </li><li> 이전 단계에서와 같이 4퍼센트 FBS와 차가운 PBS 500 μl를 두 번 핵을 씻으십시오. </li><li> PBS의 추운 4 % paraformaldehyde 400 μl에 핵을 Resuspend. 참고 : 핵은 샘플이 오염없이 며칠 동안 저장 될 수 있도록 paraformaldehyde에 배치됩니다혈청의 면전에서 발생할 수있는 문제. </li><li> 최대 3 일에 4에 유동 세포 계측법이나 어둠 속에서 매장 ° C에서 즉시 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 또는 이와 유사한 장치, 흐름 cytometer 같은 FACScan (프랭클린 호수, NJ Becton 디킨슨)에 immunolabeled 핵을 분석합니다. </li><li> 196에서 로그 스케일에서 SSC, 그리고 점 플롯의 게이트 핵, 10-1에서 로그 스케일로 FSC :에 수집 설정을 조정합니다. </li><li> 샘플 당 만 핵을 습득. </li><li> 400 로그 스케일로 설정 FL-1 채널 (506 nm 정도)를 통해 FITC-스테인드 핵의 형광을 분석합니다. </li></ol>

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<li>Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%CE%B3RIIA+and+Fc%CE%B3RIIIB+mediate+nuclear+factor+activation+through+separate+signaling+pathways+in+human+neuthophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils.</a> J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).</li>
</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

여기에 설명 된 정화 방법은 짧은 시간에 95 % (현미경 관찰에 의해 평가)보다 큰 결함이있는 unstimulated 호중구의 분리 (PMN)를 할 수 있습니다. 후자가 완전히 lysed되지 않은 경우 때때로 호중구는 적혈구에 의해 오염 될 수 있습니다. 적혈구와 PMN 쉽게 유동 세포 계측법에 의해 서로 다른 세포 집단으로 구별 할 수 있기 때문에 이것은 보통, 기술에 영향을주지 않습니다. 절연 PMN 그런 다음 특정 단클론 항체와 crosslinking 특정 수용체​​에 의해 자극 될 수 있습니다. 사실, PMN은 또한 약리 방법이나 다양한 기판 또는 다른 셀에 부착하여 자극 할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 세포가 실질적으로 관련 생물학적 자극에 의​​해 활성화 된 후 PMN 핵의 핵 요인의 변화로 이어질 신호 경로를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. PMN이 자극되면이 문서에 설명 된 방법은 신속하고 effici이 가능immunofluorescence 및 유동 ...

호중구는 말초 혈 1의 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 염증과 감염 호중구 동안 그들은 방어 2의 첫 번째 줄의 역할을 어디에 해당 사이트에 표시 할 수있는 최초의 세포입니다. 호중구는 phagocytosis, 반응성 산소 종의 생산, degranulation의 lytic 효소의 출시, 그리고 4,5 염증성 크린 시토 킨의 생산 등 여러 가지 항균 메커니즘 3 가지고 있습니다. 호중구는 빠른 속도로 다양한 세포 표면 수용체에서 신호를 통해 작동하게 수명이 짧은 세포입니다. 호중구는 자신의 짧은 수명으로 인해 터미널 셀을 고려하여 염증 과정을 여섯 동안 활성화하지 않는 한 그들은 apoptosis를 받아야하기 때문에, 그것은 그들은 또한 특정 유전자의 전사 수준을 변경하여 자신의 표현형을 수정할 수 있도록 지금 명확되어 있지만. 크린 시토 킨 5 apoptosis 7,8의 억제의 생산은 두있다,mportant 활성화에 의존적 세포 기능은 호중구의 전사 수준에서 조절. 원자력 요소 κB (NF-κB)는 시토 킨 생산 (4)의 전사 조절과 세포 생존과 다양한 세포 유형에 apoptosis 9-11의 규정에 참여하고 있습니다. 핵 인자 활성화로 이어질 신호 경로는 일반적으로 기자 유전자 assays 또는 전기 영동 이동의 assays (EMSA)에 의한 연구하고 있습니다. 호중구는 수명이 짧은 세포이기 때문에 호중구 transfection에 대한 효율적인 기술이 없으므로 다만,이 셀에 transcriptionally 규제 응답의 연구는, 기자 유전자 assays을 수행 할 수 없습니다. EMSA의 assays는 핵 인자 활성화 12,13을 둘러 호중구에 사용 된, 그 방사성 물질의 사용을 포함하기 때문에 그러나,이 방법은 복잡하고 비용이 있습니다. Nucleofection는 successfu 사용되었습니다 또 다른 방법입니다베드로 단핵 세포 14 transfect합니다. 따라서, 적어도 이론적으로는, 핵 인자 정품 인증 (낮은 효율에도 불구하고) transfection에 의해 호중구에서 감지 될 수 있습니다. 그러나,이 기술은 더 비싼 시간이 오래 걸릴뿐 아니라 아마도 덜 정량 것이다. immunostained 세포의 현미경 분석도 핵에 핵 요소를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 사실, 우리는 핵이 방법 15로 NF-κB의 translocation를 발견했습니다. 불행하게도,이 기술은 또한 시간이 많이 걸리는 덜 양적, 그리고 관찰자의 편견에 따라 달라질 수 있습니다. 여기, 우리는 유동 세포 계측법에 의한 분리 및 immunolabeled 핵의 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제시한다. 우리는 인간의 말초 혈액에서 호중구를 분리하는 기술을 설명, (F, 안티 - 수용체 항체와 integrins 또는 FC 수용체를 통해 이러한 세포를 자극 분리하고 immunolabel의 핵 및 유동 세포 계측법에 의해 핵을 분석igure 1). 방법이 성공적으로 NF-κB 15 호중구 핵의 엘크-1 16 핵 요소를 검색하는 데 사용되었습니다. 이 방법의 감도는 핵의 핵 요소 수준의 작은 변화를 감지 할 수 있습니다. 이 방법은 다른 세포 유형에서 핵에서 전사 인자의 수준을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Heparin </td><td>PiSA (멕시코)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)</td><td>T1-Dextran T500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Pharmacia</td><td>17-0320-01</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 </td><td>시그마</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성</td><td>시그마</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마</td><td>A2153</td><td>콘 분획 V</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘 무수 </td><td>시그마</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DL- 디티오트레이톨 (DTT) </td><td>시그마</td><td>D9163</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 (0.4 % 용액)</td><td>시그마</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100 </td><td>시그마</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>단클론 항체 IV.3</td><td>Medarex (Annandale, NJ)</td><td>025-1</td><td>인간 특이적 항-FcRII (CD32) </td></tr><tr><td>단클론 항체 3G8</td><td>Medarex (Annandale, NJ)</td><td>028-2</td><td>인간 특이적 항-FcRIII (CD16) </td></tr><tr><td>단클론 항체 TS2/16</td><td>Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)</td><td>Martin Hemler 박사가 기증한</td><td>인간 특이적 항-항체-&#946; 1 integrin (CD29)</td></tr> <tr><td>Monoclonal antibody IB4</td><td>University of California, San Francisco</td><td>Eric J. Brown 박사가 기증</td><td>한 인간 특이적 항 -&# 946; 2 integrin (CD18)</td></tr><tr><td>F(ab')2 염소 anti-mouse IgG </td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55468</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated F(ab')2 염소 anti-mouse IgG</td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55522</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated F(ab')2 염소 anti-rabbit IgG</td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55665</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NF-&#954; B p50</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td><td>sc-114</td><td>토끼 다클론 항체</td></tr><tr><td>Anti-NF-&#954; B p65</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td><td>sc-109</td><td>Rabbit polyclonal antibody</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</</td></tr><tr><td>strong>15-ml 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50-ml 원심분리기 Corning</td><td></td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, Sorvall 탁상용</td><td>듀퐁 기기</td><td>RT 6000D</td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Corning</td><td>340</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 피펫 P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 피펫 P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 피펫 P-1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>수조 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>2IS-M</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5414C</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)</td><td>FACScalibur</td><td></td></tr></tbody></table>

유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

호중구는 말초 혈에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 이러한 세포 따라서 미생물을 침해에 대한 방어의 첫 번째 줄되고, 염증 및 감염의 사이트에 게재 처음입니다. 호중구는 phagocytosis, lytic 효소의 출시, 그리고 반응성 산소 종의 생산과 같은 중요한 항균 기능을 가지고 있습니다. 다음과 같은 중요한 방어 기능뿐만 아니라, 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등의 감염에 대한 응답으로 다른 작업을 수행 할 수 있습니다. 크린 시토 킨은 감염을 선명하게 할 수 다른 백혈구를 모집하고, apoptosis의 억제는 호중구는 감염의 사이트에 더 오래 살 수 있습니다. 이 함수는 스크립트 수준의 규제를받습니다. 호중구는 수명이 짧은 세포이기 때문에 더 effi가 없기 때문에 그러나, 이러한 세포의 transcriptionally 규제 응답의 연구는 종래의 리포터 유전자 방법으로 수행 할 수 없습니다호중구 transfection에 대한 cient 기술. 여기, 우리는 유동 세포 계측법에 의한 분리 및 immunolabeled 핵의 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제시한다. 우리는 인간의 말초 혈액에서 순수 호중구를 분리하는 기술을 설명, 안티 - 수용체 항체와 함께이 세포를 자극 분리하고 immunolabel의 핵 및 유동 세포 계측법에 의해 핵을 분석 할 수 있습니다. 방법이 성공적으로 호중구 및 다른 세포 유형에서 핵으로 NF-κB와 엘크-1 핵 요소를 검색하는 데 사용되었습니다. 따라서,이 방법은 세포 유형의 다양한 절연 핵에서 전사 인자의 활성을 분석하기위한 옵션을 나타냅니다.

정화 방법은 여기에 설명하는 것이 95 % (그림 1A)보다 큰 결함으로 unstimulated 호중구 (PMN)를 제공합니다. 절연 PMN 그런 다음 특정 단클론 항체와 crosslinking 특정 수용체​​에 의해 자극 될 수 있습니다. 우리는 FC 수용체와 integrins (그림 1B)를 통해 PMN을 자극했다. 일단 자극, PMN은 lysed하고 핵은 높은 수율로 분리되어 있습니다. 핵은 그러한 특정 항체와 핵 요소 κB (NF-κB), (그림 1B) 등의 특정 핵 요소에 대한 immunolabeled 있습니다. 핵은 쉽게 점 플롯 (그림 2A)로 흐름 cytometer에 그대로 PMN에서 다른 인구로 인식 할 수 있습니다. 쉬고있는 PMN에서 NF-κB의 기저 수준은 세포 핵 (그림 2B)에서 찾을 수있다. cros...

호중구는 혈액에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등 transcriptionally 규제 기능을 가지고 있습니다. 이 기능은 절연 핵에 유동 세포 계측법에 의해 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수 있습니다 여기에 제시된 방법으로 공부 할 수 있습니다

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

본 실험에서는 유세포 분석법을 사용하여, 인간 말초혈액에서 분리 및 정제한 호중구의 면역 표지된 핵 내 핵단백질을 검출하고 정량화합니다. 덱스트린을 사용하여 적혈구를 제거한 후, 혈장의 밀도 구배 원심분리를 수행합니다. 그 다음, 수용체 항체를 사용하여 인테그린 또는 FC 수용체를 통해 정제된 호중구를 자극합니다.핵을 분리하고 관심 대상인 NU 핵 인자에 대한 특이적 항체를 이용하여 면역 표지를 위해 샘플을 고정하십시오. 예를 들어, NF kappa B의 경우, 핵 인자 활성화의 미세한 변화를 검출하기 위해 유세포 분석기로 핵을 최종 분석합니다. 중성구의 인테그린을 통한 자극이 전사 인자 N of kappa B의 핵 내 농도 증가로 이어진다는 결과가 도출됩니다. 핵 인자 활성화를 유도하는 신호 전달 경로는 일반적으로 일차 세포에서 리포터 유전자 분석법이나 전기영동 이동성 변화 분석법을 통해 연구됩니다.종종 이러한 방법들은 적합하지 않은 경우가 많습니다. 유세포 분석법(Flow cytometry)은 분리된 핵 내 핵 단백질의 신속한 검출과 정량을 가능하게 합니다. 건강한 성인 지원자로부터 갓 채취한 혈액 10 milliliters를 준비하여 시작하십시오.6% dextrin T 500 용액 2 mL를 15 mL 원추형 원심분리 튜브에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 혈액 10 mL를 첨가하고 튜브를 두세 번 뒤집어 섞은 후, 새로운 15 mL 원추형 원심분리 튜브에서 중력에 의해 적혈구가 침강하도록 45분 동안 둡니다. FI fial pack 5 mL를 넣습니다.침전된 적혈구 위에 형성된 백혈구 풍부 혈장(leukocyte rich plasma)을 수확합니다. 이를 피알 팩(fial pack) 위에 조심스럽게 층을 쌓아 두 개의 상을 형성한 후, 4°C에서 516 Gs로 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 튜브를 랙에 쳐서 세포 펠렛을 떼어냅니다.그 다음 세포를 10 milliliters의 차가운 PBS에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 50 milliliter 원심분리관에 옮기고 4°C에서 290 Gs로 5분 동안 원심분리합니다. 이전과 동일하게 세포 펠렛을 풀어준 후, 적혈구를 용해시키기 위해 10 milliliters의 차가운 저장액을 첨가합니다.튜브를 1분 동안 부드럽게 회전시켜 섞어줍니다. 다음으로, 차가운 고장성 용액 혼합물 10 milliliters를 첨가하고 얼음 위에 보관합니다. 이제 원심분리를 통해 호중구를 침전시킨 후 세포 수를 측정합니다.PMN을 10⁷ cells/mL 농도로 부유시킵니다. 차가운 PBS 내의 세포를 얼음 위에 보관하십시오. PMN 부유액 100 µL를 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 분주합니다.그런 다음 해당 단클론 항체를 10 µg/mL 농도로 첨가하고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 세포를 세척하려면 차가운 PBS 1 mL를 넣고 원심분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 부드럽게 풀어준 뒤 PBS로 두 번 더 세척합니다.결합하지 않은 항체를 제거하기 위해, 세척된 PMN을 60 µg/mL의 goat anti-mouse IgG가 함유된 따뜻한 PBS를 사용하여 초기 부피와 동일하게 재현탁하고, 관심 있는 nuclear factor에 따라 37 °C에서 1~20분 동안 배양합니다. 이제 차가운 PBS 1 mL를 추가합니다. 원심분리를 통해 세포를 펠릿화한 후, 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 드라이아이스-에탄올 배스(bath)에 즉시 냉동합니다. 각 샘플에 대해, 튜브를 드라이아이스-에탄올 배스에서 꺼내어 깨끗이 닦고 재현탁합니다.냉동된 PMN 펠렛을 100 µL의 차가운 저장액에 부유시킵니다. 모든 시료를 얼음에 두어 핵의 무결성을 모니터링합니다. 핵 부유액의 일부를 trypan blue로 염색합니다.핵 현탁액에 온전한 세포나 파편이 많이 포함되어 있는 경우, 해당 조제물을 폐기하고 다른 샘플로 절차를 다시 시작하는 것이 좋습니다. 원심분리를 통해 핵을 펠렛화한 후, 상층액을 매우 조심스럽게 제거하고 100 µL의 차가운 4% Paraform aldehyde 용액으로 핵을 고정시킨 뒤 얼음 위에서 배양합니다. 핵을 펠렛화한 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 100 µL의 차가운 투과 버퍼(permeation buffer)를 가한 뒤 샘플을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.그 다음 원심분리를 통해 투과성 핵을 회수합니다. 이 시점에서 핵 펠렛은 튜브 바닥에 잘 부착되지 않습니다. 다시 한번 원심분리하는 것을 권장합니다.펠릿이 느슨해질 경우, 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 핵을 4% fetal bovine serum이 포함된 차가운 PBS 500 µL에 현탁하고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 핵을 펠릿화한 다음, 4% FBS와 2.5 µg/mL의 관심 핵 인자 대상 단클론 항체가 포함된 차가운 PBS 100 µL에 핵을 재현탁합니다. 샘플을 얼음 위에서 20분 동안 배양한 후, 4% FBS가 포함된 차가운 PBS 500 µL로 샘플을 두 번 세척합니다. 그 후 4% FBS와 10 µg/mL의 해당 FZ 표지 2차 항체가 포함된 차가운 PBS 100 µL에 핵을 현탁하고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 두 번의 세척 후, 핵을 4% Paraformaldehyde가 포함된 차가운 PBS 400 µL에 재현탁합니다.FACScan 또는 이와 유사한 장치와 같은 유세포 분석기를 사용하여 면역 표지된 핵을 분석합니다. 획득 설정에서 FSC는 로그 스케일의 10⁻¹로, SSC는 로그 스케일의 196으로 조정하고 dot plot에서 핵을 게이팅합니다. 샘플당 10,000개의 핵을 획득합니다.그 다음, log scale 400으로 설정된 FL one 채널을 통해 fitsy 염색된 핵의 형광을 분석합니다. 이 PMN 정제 방법은 일반적으로 95% 이상의 순도를 가진 비자극 호중구를 제공하며, PMN 핵은 높은 수율로 분리됩니다. 분리된 핵은 자극 시 유세포 분석기의 dot plot에서 온전한 PMN과는 다른 집단으로 쉽게 식별될 수 있습니다. beta one integrin을 교차 결합시키면 NF kappa B가 핵으로 전사되며, 이러한 핵 내 NF kappa B의 증가는 형광 강도의 증가로 검출됩니다.마찬가지로, $\beta$2 integrin의 교차 결합(cross-linking)을 통한 PMN 자극 또한 형광 증가에서 나타나듯 NF $\kappa$B 활성화를 유도합니다. 이 방법의 민감도는 핵 인자 수치의 미세한 변화까지 검출할 수 있게 하는데, 이는 fibronectin과 같은 세포외 기질 단백질에 결합하는 $\beta$1 integrin이 다른 세포의 접착 분자에 결합하는 $\beta$2 integrin보다 더 강한 NF $\kappa$B 활성화를 유도한다는 사실에서 입증됩니다. 이 방법은 다양한 형광색소를 사용할 수 있고 여러 세포 유형에서 핵을 분리할 수 있어 매우 유연하며, 다양한 세포 유형의 핵 내 단백질 수치 변화를 포함하는 신호 전달 연구에 이 간단하고 경제적인 접근 방식을 활용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

High throughput assay는 인간 호중구에서 NET 방출을 정량화할 수 있는 우수한 도구를 함께 제공합니다.

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

간단하고 신뢰할 수있는 방법은 상이한 NK 세포의 서브 세트 내의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산 등의 NK 세포의 기능 세트를 분석하기 위해 여기에 설명된다.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

여기, 선물이 조직학 고정/permeabilized 섹션에서 호 중구의 존재를 감지 하 고 라이브 순화 된 호 중구의 활성화 상태를 평가 하는 프로토콜. 특히, MUB40 펩타이드 lactoferrin neutrophil 및 3 차과 립에 바인딩합니다. Permeabilization 또는 호 중구 활성화 통해과 립 내용의 노출 호 중구의 마킹 할 수 있습니다.

Neutrophil 중재 염증 이벤트 감지에 사용 하기 위해 MUB40 펩 티 드

이 프로토콜 면역 형광 3 차원 confocal 현미경 검사 법에 의해 ex vivo 그물 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감하고 높은 처리량 호 중구 extracellular 함정 (그물) 분석 결과를 설명합니다. 이 프로토콜 네트워크 형성 및 다른 자극 후 저하를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 그리고 잠재적인 NET 타겟 치료를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

배우세요 유동 세포 계측법을 이용하여 인간 호중구에서 NF kappa B와 같은 핵 인자 활성화를 정량적으로 감지하는 방법을. 이 기술은 면역 세포의 신호 전달 경로 연구에 필수적인 도구입니다.

유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법

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