유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법

본 실험에서는 유세포 분석법을 사용하여, 인간 말초혈액에서 분리 및 정제한 호중구의 면역 표지된 핵 내 핵단백질을 검출하고 정량화합니다. 덱스트린을 사용하여 적혈구를 제거한 후, 혈장의 밀도 구배 원심분리를 수행합니다. 그 다음, 수용체 항체를 사용하여 인테그린 또는 FC 수용체를 통해 정제된 호중구를 자극합니다.

핵을 분리하고 관심 대상인 NU 핵 인자에 대한 특이적 항체를 이용하여 면역 표지를 위해 샘플을 고정하십시오. 예를 들어, NF kappa B의 경우, 핵 인자 활성화의 미세한 변화를 검출하기 위해 유세포 분석기로 핵을 최종 분석합니다. 중성구의 인테그린을 통한 자극이 전사 인자 N of kappa B의 핵 내 농도 증가로 이어진다는 결과가 도출됩니다. 핵 인자 활성화를 유도하는 신호 전달 경로는 일반적으로 일차 세포에서 리포터 유전자 분석법이나 전기영동 이동성 변화 분석법을 통해 연구됩니다.

종종 이러한 방법들은 적합하지 않은 경우가 많습니다. 유세포 분석법(Flow cytometry)은 분리된 핵 내 핵 단백질의 신속한 검출과 정량을 가능하게 합니다. 건강한 성인 지원자로부터 갓 채취한 혈액 10 milliliters를 준비하여 시작하십시오.

6% dextrin T 500 용액 2 mL를 15 mL 원추형 원심분리 튜브에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 혈액 10 mL를 첨가하고 튜브를 두세 번 뒤집어 섞은 후, 새로운 15 mL 원추형 원심분리 튜브에서 중력에 의해 적혈구가 침강하도록 45분 동안 둡니다. FI fial pack 5 mL를 넣습니다.

침전된 적혈구 위에 형성된 백혈구 풍부 혈장(leukocyte rich plasma)을 수확합니다. 이를 피알 팩(fial pack) 위에 조심스럽게 층을 쌓아 두 개의 상을 형성한 후, 4°C에서 516 Gs로 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 튜브를 랙에 쳐서 세포 펠렛을 떼어냅니다.

그 다음 세포를 10 milliliters의 차가운 PBS에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 50 milliliter 원심분리관에 옮기고 4°C에서 290 Gs로 5분 동안 원심분리합니다. 이전과 동일하게 세포 펠렛을 풀어준 후, 적혈구를 용해시키기 위해 10 milliliters의 차가운 저장액을 첨가합니다.

튜브를 1분 동안 부드럽게 회전시켜 섞어줍니다. 다음으로, 차가운 고장성 용액 혼합물 10 milliliters를 첨가하고 얼음 위에 보관합니다. 이제 원심분리를 통해 호중구를 침전시킨 후 세포 수를 측정합니다.

PMN을 10⁷ cells/mL 농도로 부유시킵니다. 차가운 PBS 내의 세포를 얼음 위에 보관하십시오. PMN 부유액 100 µL를 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 분주합니다.

그런 다음 해당 단클론 항체를 10 µg/mL 농도로 첨가하고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 세포를 세척하려면 차가운 PBS 1 mL를 넣고 원심분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 부드럽게 풀어준 뒤 PBS로 두 번 더 세척합니다.

결합하지 않은 항체를 제거하기 위해, 세척된 PMN을 60 µg/mL의 goat anti-mouse IgG가 함유된 따뜻한 PBS를 사용하여 초기 부피와 동일하게 재현탁하고, 관심 있는 nuclear factor에 따라 37 °C에서 1~20분 동안 배양합니다. 이제 차가운 PBS 1 mL를 추가합니다. 원심분리를 통해 세포를 펠릿화한 후, 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 드라이아이스-에탄올 배스(bath)에 즉시 냉동합니다. 각 샘플에 대해, 튜브를 드라이아이스-에탄올 배스에서 꺼내어 깨끗이 닦고 재현탁합니다.

냉동된 PMN 펠렛을 100 µL의 차가운 저장액에 부유시킵니다. 모든 시료를 얼음에 두어 핵의 무결성을 모니터링합니다. 핵 부유액의 일부를 trypan blue로 염색합니다.

핵 현탁액에 온전한 세포나 파편이 많이 포함되어 있는 경우, 해당 조제물을 폐기하고 다른 샘플로 절차를 다시 시작하는 것이 좋습니다. 원심분리를 통해 핵을 펠렛화한 후, 상층액을 매우 조심스럽게 제거하고 100 µL의 차가운 4% Paraform aldehyde 용액으로 핵을 고정시킨 뒤 얼음 위에서 배양합니다. 핵을 펠렛화한 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 100 µL의 차가운 투과 버퍼(permeation buffer)를 가한 뒤 샘플을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.

그 다음 원심분리를 통해 투과성 핵을 회수합니다. 이 시점에서 핵 펠렛은 튜브 바닥에 잘 부착되지 않습니다. 다시 한번 원심분리하는 것을 권장합니다.

펠릿이 느슨해질 경우, 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 핵을 4% fetal bovine serum이 포함된 차가운 PBS 500 µL에 현탁하고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 핵을 펠릿화한 다음, 4% FBS와 2.5 µg/mL의 관심 핵 인자 대상 단클론 항체가 포함된 차가운 PBS 100 µL에 핵을 재현탁합니다. 샘플을 얼음 위에서 20분 동안 배양한 후, 4% FBS가 포함된 차가운 PBS 500 µL로 샘플을 두 번 세척합니다. 그 후 4% FBS와 10 µg/mL의 해당 FZ 표지 2차 항체가 포함된 차가운 PBS 100 µL에 핵을 현탁하고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 두 번의 세척 후, 핵을 4% Paraformaldehyde가 포함된 차가운 PBS 400 µL에 재현탁합니다.

FACScan 또는 이와 유사한 장치와 같은 유세포 분석기를 사용하여 면역 표지된 핵을 분석합니다. 획득 설정에서 FSC는 로그 스케일의 10⁻¹로, SSC는 로그 스케일의 196으로 조정하고 dot plot에서 핵을 게이팅합니다. 샘플당 10,000개의 핵을 획득합니다.

그 다음, log scale 400으로 설정된 FL one 채널을 통해 fitsy 염색된 핵의 형광을 분석합니다. 이 PMN 정제 방법은 일반적으로 95% 이상의 순도를 가진 비자극 호중구를 제공하며, PMN 핵은 높은 수율로 분리됩니다. 분리된 핵은 자극 시 유세포 분석기의 dot plot에서 온전한 PMN과는 다른 집단으로 쉽게 식별될 수 있습니다. beta one integrin을 교차 결합시키면 NF kappa B가 핵으로 전사되며, 이러한 핵 내 NF kappa B의 증가는 형광 강도의 증가로 검출됩니다.

마찬가지로, $\beta$2 integrin의 교차 결합(cross-linking)을 통한 PMN 자극 또한 형광 증가에서 나타나듯 NF $\kappa$B 활성화를 유도합니다. 이 방법의 민감도는 핵 인자 수치의 미세한 변화까지 검출할 수 있게 하는데, 이는 fibronectin과 같은 세포외 기질 단백질에 결합하는 $\beta$1 integrin이 다른 세포의 접착 분자에 결합하는 $\beta$2 integrin보다 더 강한 NF $\kappa$B 활성화를 유도한다는 사실에서 입증됩니다. 이 방법은 다양한 형광색소를 사용할 수 있고 여러 세포 유형에서 핵을 분리할 수 있어 매우 유연하며, 다양한 세포 유형의 핵 내 단백질 수치 변화를 포함하는 신호 전달 연구에 이 간단하고 경제적인 접근 방식을 활용할 수 있습니다.