현지화 된 조직 병리학 적 분석을위한 망막 보철물로 이식 된 가공 눈을위한 기술 : 파트 망막 끌어 올릴 2 망막 임플란트

단단한 금속 성분이 포함된 망막 보철물은 전통적인 조직학적 처리 과정과 호환되지 않습니다. 본 영상에서는 금속 T-바로 망막상 표면에 고정된 망막 임플란트와 직접 인접한 안구의 건강 상태를 평가하는 기술을 설명합니다. 이를 위해 우선 동반 영상에 설명된 프로토콜에 따라 안구를 핵 형성 및 고정시킨 후, 임플란트와 망막 T-바를 포함하는 조직 샘플을 절제합니다. 두 번째 단계는 조직 샘플을 점진적으로 탈수시킨 다음, 2단계 매립 과정을 통해 원하는 방향으로 에폭시 수지에 매립하는 것입니다. 다음으로, 최종 수지 블록을 특수 홀더에 장착하고 임플란트와 주변 안구 조직의 횡단면이 원하는 높이에서 노출될 때까지 점진적으로 연마합니다.

마지막 단계는 노출된 조직을 표면 염색한 후, 고배율 해부 현미경으로 촬영 및 사진 촬영을 하여 이식된 보형물 인접 부위의 세포 구조를 시각화하는 것입니다. 이러한 단계들은 필요에 따라 여러 번 반복합니다. 최종적으로, 제자리에 있는 이식물을 포함하여 조직 샘플을 가로지르는 일련의 단면 영상들이 수집되며, 이는 장치나 수술 설계의 개선뿐만 아니라 특정 보형물의 안전성을 평가하는 데 활용될 수 있습니다.

전통적인 칼날 기반의 조직 절편 제작법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 금속 성분을 포함하여 심장에 삽입된 물체를 시술 중에 제자리에 유지할 수 있어, 임플란트와 조직 사이의 인터페이스를 시각화할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 삽입된 망막 보철물에 인접한 섬세한 안구 조직의 구조적 무결성을 평가하는 것과 같이 망막 보철물 분야의 핵심적인 질문들에 답을 줄 수 있습니다. 함께 제공되는 JoVE 비디오에 설명된 대로 안구를 적출하고 고정한 후, 임플란트와 그것이 안구 외부에 고정된 지점을 시각화하십시오.

15도 칼날을 사용하여 각막에 원주형 절개창을 만들고 각막 캡을 제거하여 안구 내부를 노출시킵니다. 이 망막상 임플란트 수술 절차의 일부인 수정체 제거 유리체 절제술을 통해 수정체가 이미 제거되었음에 유의하십시오.

그 다음, 홍채와 렌즈의 잔여 Z-섬유를 절개하여 망막상 임플란트와 금속 T자가 제자리에 위치한 후방실을 노출시킵니다. 임플란트의 종류와 수행 중인 연구에 따라, 추가 절개 전에 불필요한 구성 요소를 제거하십시오. 본 예시에서 평가 대상인 망막상 어레이는 컨포멀 실리콘 캐리어 내에 수용된 프로토타입 밀폐형 다이아몬드 전극 및 전자 장치 패키지로 구성됩니다.

택(tack)과 주변 조직이 포함된 샘플을 원하는 방향으로 조심스럽게 절개합니다. 미세 절개 가위를 사용하여 공막, 맥락막 및 망막을 포함하여 안구 뒷부분에서 전층 스트립을 절단합니다. 여기에서 메스를 이용한 미세 절개로 다이아몬드 전극 패키지를 조심스럽게 추출합니다.

망막 턱(retinal tack)과 백금 배선의 잔해와 함께 임플란트의 실리콘 본체를 그대로 둡니다. 턱에 인접한 모든 망막 층이 보이는 턱의 종단면 샘플을 채취하십시오. 그 후 샘플을 70% Ethanol로 되돌립니다.

점진적인 에탄올 농도 단계에 따라 3일 동안 시료를 탈수합니다. 먼저, 70% ethanol에서 2시간씩 2회 시료를 탈수합니다. 다음으로, 80% ethanol에서 2시간씩 2회 탈수하고, 다음 날 90% Ethanol에서 2시간씩 2회 탈수하며 하룻밤 동안 둡니다. 이어서 100% ethanol에서 2시간씩 2회 탈수한 후, 하룻밤 동안 둡니다.

마지막으로, 100% acetone으로 2시간씩 2회 샘플을 탈수합니다. 샘플을 acetone에서 꺼내어 실온에서 자연 건조시키며 광학 현미경으로 관찰합니다. 연조직에서 액체가 제거되면 세포가 붕괴하고 수축하게 됩니다.

시료가 말리기 시작하거나 붕괴되기 직전에 에폭시로 옮깁니다. 조직의 말림과 붕괴가 일어나는 시점을 판단하는 능력은 경험을 통해 습득됩니다. 시료를 투명 에폭시 수지에 매립하려면, 적절한 밀폐 용기에 담긴 액상 에폭시에 안구 조직을 침전시키십시오.

진공 챔버에서 에폭시의 기포를 조심스럽게 제거한 후, 실온에서 하룻밤 동안 방치하여 경화시킵니다. 밴드쏘(bandsaw)와 리드(reed)를 사용하여 경화된 에폭시와 시료의 크기를 조정함으로써 시료가 원하는 방향으로 매립되도록 주의하십시오. 안구 조직이 포함된 크기가 조정된 블록을 새로 액상화한 에폭시에 넣어, 핀의 장축이 몰드 바닥과 평행하도록 배치합니다. 순간접착제를 소량 사용하여 크기가 조정된 시료를 시료 홀더 바닥에 고정합니다.

시료 홀더에 액상 에폭시를 채우고 이전과 같이 탈기한 후 하룻밤 동안 경화시킵니다. 그다음 수지를 연마용 시료 홀더에 장착하고, 물을 흘려보내며 실리콘 카바이드 페이퍼를 사용하여 230~250 RPM에서 시료를 수동으로 연마합니다. 염색을 위해 연마된 표면을 토인 블루(toine blue) 염색약에 3~5분 동안 또는 염색이 될 때까지 담급니다.

수돗물로 샘플을 헹군 후, 고배율 해부현미경으로 시편의 연마된 표면을 촬영하십시오. 망막의 세포층을 시각화하려면, 시편 바로 위의 에폭시 상단 표면에 증류수 한 방울을 떨어뜨리십시오. 이는 공기와 에폭시 계면에서의 회절 현상을 완화하기 위함입니다.

광섬유 구즈넥 광원을 사용하여 시료를 조사합니다. 미리 설정된 두께만큼 시료를 연마할 때마다 연마 및 이미징 단계를 반복합니다. 시료 홀더의 정밀하고 재현 가능한 최소 연마 증분은 20 microns입니다.

이 과정은 임플란트와 주변 안구 조직을 가로지르는 단면이 원하는 높이에서 노출될 때까지 점진적으로 반복됩니다. 여기 연마 과정의 여러 시점에서 티타늄 망막 T 직후에 시각화된 망막 조직의 예시 이미지들이 있습니다. 이미지들은 실리콘과 톨루이딘 블루로 염색된 망막 및 염색되지 않은 망막에 인접하여 안구를 관통하고 공막을 통해 나오는 택(tack)의 종단면을 보여줍니다.

실리콘 양측에서 인위적이지 않은 망막 박리와 주름이 저배율 및 고배율 모두에서 관찰될 수 있습니다. 택(tack)의 샤프트가 실리콘에 매립된 것이 보이며, 택의 헤드는 망막과 공막을 관통한 상태입니다. 여기서 저배율과 고배율 모두에서 관찰되는 실리콘 양측의 염색되지 않은 망막에 인위적이지 않은 망막 박리가 있음이 분명하게 나타납니다.

해당 사례는 택(tack) 인근의 망막 조직 해체와 사선 삽입 각도로 인해 한쪽 망막이 압착된 모습을 보여주었습니다. 이 절차를 수행할 때는 결과물인 연마면이 원하는 평면과 일치하도록 시료를 주의 깊게 매몰, 방향 설정 및 고정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 연마된 시료는 추후 복구가 불가능하므로 각 연마 단계마다 여러 장의 사진을 촬영하여 수집해야 합니다.

이 방법은 망막 보철물의 조직학적 분석에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 뇌 심부 임플란트, 혈관 스텐트 또는 정형외과적 보철물과 같이 단단한 이식 부품을 사용하는 다른 시스템의 장치-조직 인터페이스를 시각화하는 데에도 적용될 수 있습니다.