Name: 현지화 된 조직 병리학 적 분석을위한 망막 보철물로 이식 된 가공 눈을위한 기술 : 파트 망막 끌어 올릴 2 망막 임플란트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 배우세요 망막 보철물 주변 안구 조직의 조직병리학적 분석 기법을 에폭시 수지 임베딩과 연삭을 통해. 이 방법은 금속 성분이 포함된 이식물의 생체적합성 평가에 필수적입니다.

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Nicole Vella (Macquarie University); Alexia Saunder(Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI)는 실험 지원; 동물 치료를 위한 RVEEH(Royal Victorian Eye and Ear Hospital) 생물학 연구 센터 직원; 수의학 조언에 대한 Sue Pierce (RVEEH); 앤서니 버키트(Anthony Burkitt) (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn(BVA) 및 BVA 직원에게 관리 지원을 제공합니다. 
이 연구는 호주 연구 위원회(Australian Research Council, ARC)의 지원을 받아 Bionic Vision Australia(BVA)에 대한 Bionic Vision Science and Technology 보조금의 SRI(Special Research Initiative)를 받았습니다. Bionics Institute는 빅토리아 주정부로부터 운영 인프라 지원을 받고 있으며 Bertalli Family Trust 및 J T Reid Charitable Trust의 지원도 인정합니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
이 원고의 Bionic Vision Australia Consortia 저자는 (a-z)입니다. 
페넬로페 J. 알렌, 오웬 번스, 케이트 E. 폭스, 쿠마라벨루 가네산, 데이비드 J. 가렛, 해미시 메핀, 조엘 빌라로보스, 조나단 여.

참고 : 모든 절차가 로얄 빅토리아 눈과 귀 병원의 동물 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다 (RVEEH AEC # 10-199AB). 대상은 국민 건강과 (2013)과 &quot;동물 학대 방지법&quot;의학 연구위원회 (Medical Research Council)의 &quot;관리 및 과학적인 목적을위한 동물의 사용을위한 연습의 호주 코드&quot;에 따라 처리 된 (및 개정 1986). 모든 외과 적, 전기 생리 학적 및 임상 평가 절차는 마취 하에서 수행하고, 모든 노력이 고통을 최소화 하였다. 1. 핵의 제거 및 고정 참고 : 존재하는 경우, 장치 케이블 또는 유리체 절제술 포트 주위에 추가 돌보는은 관련 원고 (16)에 자세히 설명 탈핵 및 고정 절차를 따르십시오. 간단히 말해서,이 포함됩니다 : <ol><li> 로 transcardially 차가운 중립 buffe 다음에 따뜻한 식염수 주제를 관류빨간색 포르말린. </li><li> 랜드 마크 역할을하는 안구에 봉합을 묶어. </li><li> 케이블 장치 및 부착 패치 / 탭을 유지, 눈 (16)을 명백히하다. </li><li> 36 시간 - 18 데이비슨의 솔루션에 눈을 포스트 - 수정. </li><li> 8 시간 - 6 50 % 에탄올로 전송합니다. </li><li> 해부까지 70 % 에탄올 냉장 (4 ℃)에 전송합니다. </li></ol> 2. 전극 제거 및 해부. 주 : 모든 망막 임플란트는 동일한 폼 팩터를 가질 것이지만, 일반적으로 전극 어레이 및 유연성 순응성 담체 물질의 일부​​ 형태가있을 것이다. 망막 식은되는 장치는 금속 압정 함께 이러한 유지 어레이 및 눈의 뒷면을 관통하는 구멍을 점착 기능. <ol><li> 임플란트는 망막에 고정되는 점을 시각화. <ol><li> 15도 블레이드를 사용하여 원주 트랜스 각막 절개를 그리고 특급하기 위해 각막 뚜껑을 제거기본 조리개와 렌즈 OSE. </li><li> 15도 블레이드를 사용하여, 망막 임플란트 시츄 금속 압정 후방 챔버를 노출시키는 렌즈의 소 대상의 섬유 및 토토 disinsert 렌즈를 제거한다. </li></ol></li><li> 임플란트와 연구 수행에 따라 추가 해부하기 전에 외부 구성 요소를 제거합니다. 참고 : 본 예에서, 평가중인 망막 배열 등각 실리콘 캐리어 내에 수용 프로토 밀폐형 다이아몬드 전극 및 전자 패키지 구성되었다 (집 제조 20 참조). <ol><li> 여기에 조심스럽게 메스와 미세 절개하여 다이아몬드 전극 패키지의 압축을 풉니 다. 망막 압정과 백금 배선의 잔해 (그림 2)와 함께 임플란트의 실리콘 몸을 둡니다. 임베디드 어레이 / 하우징 내사 장치 설계의 일부가 아닌 경우,이 단계 (2.2)를 생략. </li></ol></li><li> 주의하여원하는 방향으로 택 및 주변 조직을 포함하는 샘플을 해부. 공막, 맥락막과 망막을 포함한 눈의 뒤쪽에서 전체 두께 스트립을 잘라 미세 해부 가위를 사용합니다. 압정에 인접한 모든 망막 층을 보여 택의 종단면을 제공하는 샘플을 보자 (그림 2) 참고 : 샘플 원하는 방향으로 원하는 특정 결과에 따라 다를 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 광학 디스크가 시료 내에 포함되어야한다 광학 디스크에 손상 압정 근방을 조사하고자. </li></ol> 3. 탈수, 임베드, 설치, 연삭, 염색, 및 이미징 <ol><li> 진보적 인 에탄올 단계에서 삼일을 통해 샘플을 탈수 : <ol><li> 회 2 시간 동안 70 % 에탄올에서 샘플 탈수. </li><li> O / N 두 차례 2 시간 동안 80 %의 에탄올의 샘플을 탈수. </li><li> 2 시간의 TWIC 90 % 에탄올에 샘플을 탈수전자. </li><li> O / N 배에서 2 시간 후, 100 % 에탄올에 샘플을 탈수. </li></ol></li><li> 회 2 시간 동안 100 % 아세톤 샘플 탈수. <ol><li> 아세톤에서 시료를 제거하고 실온에서 그 공기가 건조 등의 광학 현미경으로 관찰한다. 에폭시에 샘플을 전송은 / 축소를 곱슬 곱슬 시작 직전 (3.4 단계를 참조하십시오). 참고 : 붕괴 세포 수축의 부드러운 조직 결과에서 액체를 제거. 조직 컬링 / 축소가 발생했을 때의 감사 경험으로 개발되고있다. </li></ol></li><li> 제조업체의 지시에 따라 의료용 에폭시 수지를 준비합니다. 수지를 경화하려면 1 시간 또는 실온에서 24 시간 동안 중 55 ° C를 사용합니다. 기포 제거에 대한 ~ 50 밀리바에서 ~ 5 분 동안 진공 챔버에서 발생. 끓여 에폭시 혼합물의 원인이됩니다 과도한 진공으로 수동으로 진공을 조절하고 가스 제거를 효과적으로 발생하지 않습니다 참고 : 단계 3.2와 동시에 단계 3.3을 수행합니다. </li><li> SAMP 퍼가기명확한 에폭시 수지 르. 적절한 밀폐 용기에 가스가 제거 된 에폭시의 안구 조직을 담그고 O를 떠나 / N RT에서 치료. </li><li> 크기 조정 및 경화 된 에폭시 블록을 재-삽입하여 원하는 방향 (그림 2)에서 샘플을 포함 할주의하십시오. (-도 3a 노란색 컵) 점착성의 장축은 금형의 아래쪽에 평행하게 배향되도록, 안구 조직을 포함하는 크기가 조정 블록을 다시 임베드. </li><li> 연삭 시편 홀더에 수지를 탑재하고 샘플 갈기 - 탄화 규소 종이 사용 (230 수동 연삭, 물과 함께 250 RPM)를 (800 격자로 시작하는,도 3C 및 3E). </li><li> 염색의 경우, 3 톨루이딘 블루 염색에지면을 찍어 - 5 분, 또는 얼룩이 개발 될 때까지 (그림 3 층). </li><li> 수돗물 (그림 3G)로 씻어. </li><li> 이미지 고전력 해부 범위와 표본의 바닥면의 세포층을 나타낼망막 (그림 3H). 공기 계면에서 에폭시 회절을 부드럽게 시험편 상기 에폭시의 상면에 증류수 방울을 적용한다. 샘플을 조명하는 광섬유 &#39;거위&#39;광원을 사용합니다. </li><li> 샘플의 미리 설정된 두께 연마하여 각각의 시간 (시편 홀더의 최소 정확하고 재현성있는 분쇄 증가가 20 μm의 경우), 3.9 - 반복 3.6 단계를 반복합니다. </li></ol>

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저자는 공개할 것이 없습니다. Irfan Durmo는 Cochlear Ltd.의 직원입니다.

표준 조직 학적 기법으로 인해 금속, 유리 또는 다이아몬드 블레이드 이러한 개체를 절단의 제한 현장에서 하드 금속 임플란트를 처리 할 수 없습니다. 우리 컴패니언 용지 (16)에서는 개질 전체 눈 고정술의 사용은 인공적 망막 박리를 낮출 수있는 것으로 나타났다. 현재 원고에서, 연삭 설립 및 현장에서 21 ~ 23 망막 보철에 대한 수정 된 인공 와우 이식을 시각화 기술을 연마. 망막에 전극 배열을 확보하는 데 사용되는 티타늄 압정은, epiretinally, 주변의 눈 조직과 함께 에폭시에 포함되었다. 이 수지 블록이어서 금속 압정에 바로 인접 조직 형태를 공개하기 위해 적절히 방향이 점진적 접지 / 연마 하였다. 다양한 깊이에서 블록의 광택 표면의 이미지는 강력한 해부 현미경으로 촬영되었다. 비쥬얼과 evaluat :이 기술은 유용하다망막 임플란트에 인접한 조직 반응을 보내고; 임플란트의 이식과 관련된 수술 외상을 평가하는 단계; 경질 금속 성분에 생물학적 반응을 결정하는 단계; 임플란트 및 망막의 표면 사이의 거리를 측정한다. 이 기술은 눈의 망막 또는 다른 하드 압정 (예, 금속) 개체에 인접한 영역의 동일계 시각화에 대한 미래의 안전성 시험에서 유용 할 것이다. 이 epiretinally 망막에 압정으로 고정 보철물의 전임상 안전성 평가에 직접 응용 프로그램을 가지고있다. 또한 서브 망막 위치에 임플란트 접촉 영역에서 망막 조직 손상을 평가하기에 유용 할 수있다. 기술이 제대로 수행되었는지 확인하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 각 단계에서, 망막은 눈의 외부 층에 부착 된 상태로 유지한다. 총 인공적 망막 박리가 발생했을 경우는 인도어 수도고정에 문제를 먹었다. 샘플 및 매립 블록의 연삭면 직교에 가까워 야 망막을 차단 최종 수지에 다시 지향 경우; 이 경사 절단을 최소화 할 수 있습니다. 그것은 (예 : 망막 압정으로) 객체를 통과하는 데 필요한 (공지의 스텝 사이즈) 증분 연삭 단계 번호가 개체의 크기와 상관 따라서 확인하는 것이 유용하다. 이 기술은 여러 방식으로 최적화 될 수있다. 연삭 공정과 관련된 에폭시 블록의 표면에 미세한 흠집이 점진적으로 연마 급 감소 될 수있다. 본 연구를 위해, 우리는 800, 1000, 1200, 2400 및 4000 등급 실리콘 카바이드 종이를 사용했다. 다이아몬드 페이스트는 표면 마무리를 향상시키기 위해 사용될 수있다. 미세한 표면이 더 높은 품질의 이미지를 제공하지만 추가 연마 시간의 비용. 이 기술의 결과를 개선하기위한 또 다른 중요한 고려 사항은 OPTI의 선택과 품질CS 및 조명 이미지 캡처에 사용. 기타 기본적인 조직학 얼룩 - 특히 얼룩 Nissl, 톨루이딘 블루 대신에 사용될 수 있지만, 더 최적화를 필요로 할 수있다. 일부 얼룩이 수지뿐만 아니라 조직 (예, 에오신), 따라서 얕은 광택제 배경 변색을 제거하는 염색 후에 요구 될 수 얼룩 것이다. 전문 얼룩, 형광 염료 및 면역 조직 화학 염색은 시도되지되었지만 매우 특정한 결과가 요구되지 않는 한, 각각의 연삭 단계에서 이러한 얼룩을 수행하는 데 필요한 시간은 금지 될 가능성이있다. 그러나, 매립 단계 (단계 3.4) (24) 전에 전체 조직을 염색하는 것이 가능할 수있다. 이 기술의 주요 제한은 따라서, 연삭 및 연마의 각 단계에서의 배율 다양한에서 많은 (아마도 중복) 이미지를 캡처하기 위해 신중한, 관심 영역이 얻어 접지되면,이를 검색 할 수 없다는 것이다. 그것은이다또한 중요한 각 연삭 깊이 조정을 위해 작은 단위를 사용합니다. 이 기술의 다른 제한은 그 조직 유리 슬라이드 상에 장착되고 표준 (송신) 광학 현미경으로 볼에 비해 광학 해상도의 배율. 프로토 타입 및 신규 한 임플란트 장치의 안전성을 측정하기위한 목적으로, 병리학 적 평가는 주요 관심사이다. 이 기술은 망막 점착성과 관련된 임상 적 손상을 관찰하기위한 효율적인 방법을 제공한다. 실제로, 갈기, 폴란드어를 수집하고 (한 번 포함) 지정된 표본을 촬영하는 데 필요한 전체 시간으로이 섹션에 파라핀 블록 또는 동결 절편을 걸리는 시간 비교입니다. 망막 임플란트의 범위 밖의 애플리케이션으로 확장 될 수있는 본 기술에 대한 가능성이있다. 이 기법은 주입 추출 feasib없는 하드 임플란트에 인접한 조직을 평가하기에 적합제작 또는 인터페이스에 손상을 것입니다. 예를 들어,이 기술은 약물 전달을위한 일부 깊은 뇌 또는 말초 신경 전극, 캐 뉼러로 종래의 조직 학적 기법을 절단 할 수없는 금속 (예, 백금, 니티놀, 등)에서 만든 임플란트를 평가하기 위해 확장 될 수있는, 혈관 스텐트 또는 정형 외과 보철.

색소 성 망막염 (RP)는 신경 활동으로, 광자의 형태로, 광 열 변환 할 책임이 망막의 최 외층에있는 광 수용체 세포의 광범위한 손실을 일으키는 유전 질환이다. 중요한 것은, RP 환자는 일반적으로 여전히 작동 그들의 망막의 다른 층에 잔류 신경 세포가있다. 망막 보철물 시각적 통로 1,2- 활성화와 전기 자극이 신경 세포 생존을 대상으로 환자에게 어떤 시각을 복원 할 수있다. 임상 시험에서 지각 결과는 초기 결과를 약속 보여 최근 일부 장치는 상업적 목적으로 승인되었습니다. subretinally 5, 6 및 suprachoroidally 7,8 epiretinally 3,4 : 현재 세 가지 주요 해부학 임상 망막 보철이 배치되어있는 위치가있다. 다른 장치는 다른 재료를 활용하여 자신의 양식은 사용자 정의됩니다그들은 주입되는 위치. 하지만, 그들 모두는 전기 펄스와 망막 뉴런의 잔류를 활성화하여 시각적 지각 표상을 만든다. 어떤 의료 보철물 때문에 초기 배치의 영향이나 기계적 이후 지속적인 힘 주변 조직 손상시킬 수있는 가능성이있다. 망막 이식 보철물 같은 자극의 경우에서, 전기 파라미터는 안전 한계 내에 있어야 추가적인 고려 사항이있다. 환자의 안전이 가장 중요하므로 장치는 엄격하게 임상은 9-15 설정에 진출하기 전에 임상 연구에서 테스트해야합니다. 우리 컴패니언 글에서는 맥락막 상강 공간 (16) 내에 위치 임플란트 주변의 눈 국소 조직 병리학을 평가하기위한 방법을 설명했다. 본 논문에서는 (FE를 임상에서 epiretinally 망막 식은 전극 어레이를 둘러싸는 눈 조직 시각화 기법을 서술라인) 모델 (그림 1). 망막 위치는 시각적 보철물을 찾기위한 가장 일반적으로 이용되는 위치이다. 여기에 위치한 전극 어레이는 전형적으로 17-20 눈의 모든 층을 관통하는 금속 압정 망막에 부착된다. 앞서 본 원고에 기재된 기술로, 정확하게 망막 즉시 압정을 둘러싼 다른 조직을 평가하기 어려웠다. 중성 포르말린을 사용하여 표준 눈을 고정으로 인해 택의 고정 점에 대한 망막과 공막의 차동 운동에 인공적인 망막 손상의 결과. 따라서 택 및 망막 배열로 인해 발생한 실제 손해를 정확하게 관찰 할 수 없습니다. 금속 물체가 용이하게 기존의 조직 학적 장치로 절단 할 수 없으므로 또한, 눈 조직 절편 것은 시츄 망막 압정 수행 될 수 없었다; 조직 학적 처리도되기 전에 택을 제거이것은 또한 인공적인 망막 손상에지도로 바람직하지 않은. 본 연구의 목적은 두 가지였다 : 택 및 망막 임플란트 배열로 인한 손상이 안정적으로 평가 될 수 있도록 1) 망막 박리의 유물을 줄이기 위해; 2) 삭제하지 않고 압정에 인접한 망막 구조를 시각화. 인공적 망막 박리를 감소시키고, (컴패니언 제 16의 설명 참조) 한 목적을 달성하기 위해, 새로운 고정술들이 이용 하였다. 이 목적을 달성하기 위해, 우리는 연삭, 원래 인공 와우 전극 21-23 원위치 관찰에 대한 기술 개발을, 연마, 임베딩 변성. 인공적 망막 손상을 최소화하고, 따라서 망막 택 및 배열로 인한 잠재적 인 손상의 정확한 평가를 허용하면서,이 원고에 기재된 방법은 반응계 내에서 가용 접 주변 망막의 가시화를 허용 인접.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Chem-Supply</td><td>AA008</td><td>Propanone BHD 의료용</td></tr><tr><td>Epo-Tek 301 에폭시</td><td>에폭시 기술</td><td>파트 A 1675-54-3 파트 B 9046-10-0</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 70-75% v/v</td><td>Merck PTY LTD</td><td>4.10261</td><td>알코올</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merck PTY LTD</td><td>90143</td><td>알코올</td></tr><tr><td>톨루이딘 블루 O</td><td>시그마-알드리치</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민 테트라아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TegraPol 연삭/연마기</td><td>Struers</td><td>TegraPol-25</td><td></td></tr><tr><td>AccuStop 표본 홀더</td><td>Struers</td><td>Accustop</td><td></td></tr><tr><td>광 현미경</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Leica</td><td>2.0x Planapo 대물</td><td></td></tr><tr><td>디지털 현미경 카메라</td><td>Leica</td><td>DFC-420C</td><td></td></tr><tr><td>현미경 소프트웨어</td><td>Leica&nbsp;</td><td>애플리케이션 제품군 v4.1.0</td><td></td></tr></tbody></table>

현지화 된 조직 병리학 적 분석을위한 망막 보철물로 이식 된 가공 눈을위한 기술 : 파트 망막 끌어 올릴 2 망막 임플란트

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

특정 형태의 실명을 치료하기 위한 망막 보철물은 현재 시장에 출시되고 있는 상용 장치와 함께 전 세계의 임상 시험에서 주목을 받고 있습니다. 이러한 장치의 안전성을 평가하기 위해서는 전임상 연구에서 신뢰할 수 있는 기술이 필요합니다. 그러나 일부 망막 임플란트에 사용되는 경질 금속 성분은 특히 주변 조직의 섬세한 특성을 고려할 때 전통적인 조직학적 과정과 호환되지 않습니다. 여기에서는 금속 압정으로 망막에 고정한 망막 임플란트에 바로 인접한 눈의 건강을 평가하는 기술에 대해 설명합니다.
망막 보철물은 눈 조직과 접촉하는 전극 배열을 특징으로 합니다. 이식에 가장 일반적으로 사용되는 위치는 망막외단 위치(눈의 후방)로, 여기서 임플란트는 눈의 모든 층을 관통하는 금속 압정으로 망막에 고정됩니다. 이전 방법은 전통적인 조직학적 기술이 금속 물체를 절단할 수 없었기 때문에 압정으로 근위 안구 조직을 평가할 수 없었습니다. 결과적으로, 압정 삽입으로 인한 국소 손상이 있는 경우 이를 평가하기가 어려웠습니다.
따라서 우리는 망막 압정과 임플란트 주변의 조직을 시각화하는 기술을 개발했습니다. 우리는 눈의 부드럽고 섬세한 조직을 위해 인공와우 주변의 단단한 뼈 조직을 처리하고 시각화하는 데 사용되는 확립된 기술을 수정했습니다. 우리는 샘플의 구조를 안정화하고 보호하기 위해 임플란트와 망막 압정을 포함한 고정된 안구 조직을 에폭시 수지에 배치하고 내장했습니다. 그런 다음 내장된 샘플을 분쇄하고, 연마하고, 염색하고, 샘플을 통해 증분 깊이에서 다양한 배율로 이미지화했습니다. 이 기술을 통해 금속 압정에 인접한 안구 조직 무결성 및 세포 구조에 대한 신뢰할 수 있는 평가를 수행할 수 있었습니다.

정착 프로토콜은 실질적으로 인공적 망막 박리 (16)의 박리를 저감. 에폭시 블록 내의 시험편의 방향은 두 단계로 설명 매립 공정을 이용하여 지속적으로 유지시켰다. 증분 연마 과정은 최적의 결과를 달성하기 위해 손재주의 중간 수준을 요구하지만, 증가 해상도 미세 제어를 제공하는 조정 시험편 홀더의 도움을했다. 모든 경우에 (N = 5) 점착성이있는 분쇄 하였다 / 바람직하고 일관된 결과로 연마. 침에 인접한 망막은 확인할 수 있었다 적절 스테인드. 등급 P # 800의 탄화 규소 종이 에폭시 수지 블록의 표면을 연마하는 것은 매립 조직 세포 거대 영상에 충분 하였다. 높은 등급의 종이, 또는 다이아몬드 슬러리를 원하는 경우, 상기 임의의 주어진 깊이로 표면을 연마하는 데 사용될 수있다. 해부 현미경과 광학 섬유 &#39;거위&#39;LIGHt 소스는 접지 블록과 내장 조직 샘플의 표면을 이미징하기에 적합한 것으로 밝혀졌다. 광원의 위치는 현미경을 통해 최상의 조명 및 콘트라스트를 준 위치 및 각도를 찾기 위해 시행 착오에 의해 변화시켰다. 블록의 표면에 증류수 방울을 추가 샘플 위에 에폭시 공기 계면에서의 광로 회절 및 / 또는 매끄러운 왜곡을 감소시키기에 유용 하였다. 도표 4는 티탄 망막에 바로 인접 시각화 망막 조직의 예시적인 이미지를 도시 이 기술을 사용 압정. 비 인공적인 망막 박리 및 폴딩 실리콘 (그림 4A)의 양쪽에 볼 수 있습니다. 압정 샤프트는 실리콘에 포함 보이고, 압정의 머리는 망막과 공막에 침투하고있다. 실리콘 (도 4C)의 흠 망막 양쪽에서 인공적인 비 - 망막 박리가있다. 이 기술은 거기는,이 경우에, 그 보여 주었다E 인해 비스듬한 각도로 삽입 일측 망막 택 및 압축에 인접 망막 무질서하다. 제공되는 이미지는 단순히 기술이 아니라 일반적으로 점착성이 손상 조직 병리학 대표의 성공의 그림 유의하십시오. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> 망막의 전극 배열도 1 요구함. (A) 뒤쪽 공막, 맥락막 및 망막 변성 (감광체 결여)의 확대 단면도를 눈의 개략도. 전극 배열. epiretinally 부착, 파란색으로 묘사 망막 전극 배열의 (B) 컴퓨터 지원 - 도면이다. , 집적 회로 ( &#39;칩&#39;) 및 전극 패키지; B, 티타늄 망막 압정; C, 의료용 실리콘 하우징; D, 납 종료 지점. 패널은 원래, 일러스트에서 수정슈퍼맨 비전 호주, 저작권 베스 크로체의 제공 의례에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> 그림 2. 전극 제거 및 눈의 해부. 현장에서 망막 압정 탈핵 고양이 눈의 높은 동적 범위 매크로 사진. (A) 데이비슨의 정착과 포스트 고정 망막 구조 (16) 보존하기 위해 탈핵 눈 해부했다. 전극 어레이 패키지는 실리콘 캐리어로부터 제거하고 나머지 임플란트 압정 (화살표)과 실리콘 바디와 (점선 사각형 윤곽 전극 어레이의 원래 위치를 나타낸다). (B)의 눈은 인접한 종단면으로 해부했다 압정(점선). 압정이 아이 컵 (화살표)의 후벽에 포함 된 상태로 유지, 공막에 의해 주로 안정화. 제거 된 전극 어레이 아래를 함유하는 망막 부 표준 조직학 처리부 (16) (왼쪽 부분)를 위해 준비하는 동안 압정을 함유하는 조직 절편은, 수지 매립하고 연마 (우측 부분)에 대해 제조 하였다. 0.5 mm 단위와 눈금자가 각 패널의 하단에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> 그림 3. 에폭시 매립 및 택 망막 조직의 연삭. 내장 된 에폭시의 사진 정렬 조직 샘플, 연삭, 염색 및 택 망막 조직의 영상. (A) 전술<html> k 개의 샘플을 에폭시 수지에 매립 블록 하였다. 금형을 사용하여, 시료 길이 평면 몰드의 저면에 평행하도록 배향되었다. 연마 용 (B)는 압정 형 샘플을 함유 경화 에폭시 블록. (C) 에폭시 블록 연삭 시험편 홀더에 장착시키고, 준비 . (D) 샘플은 1 조직이므로 이미지화 섹션 망막 세포층과 점착성의 종축을 포함 배향 하였다. (E) 샘플을 회전식 분쇄기 탄화 규소 용지를 사용하여 접지했다. (F)를지면의 블록은 망막 층을 식별 할 수 톨루이딘 블루로 염색했다. (G) 블록이 초과 얼룩을 제거하기 위해 수돗물에 헹구었다. (H) 푸른 스테인드 망막 층과 점성이 높은 전원이 공급되는 해부 범위를 사용하여 몇 군데 있었다 톨루이딘. 광고 / 52348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; 택과 망막의 그림 4. 높은 및 낮은 전력 이미지. 여러 지점에서 연삭 가공 이미지 동안은 압정 (별표)의 종단면 ( &#39;S&#39;공막을 눈 관통과 종료를 보여주는 해부 범위에서 측정 한 것 ), 실리콘 (해시) 및 스테인드 톨루이딘 블루와 흠없는 망막 ( &#39;R&#39;)를 인접. 이러한 예 이미지 만 본 시각화 기술을 보여주기 위해, 그리고 모든 망막 임플란트 또는 압정 삽입 조직 학적 결과를 대표하지 않습니다. 백금 배선의 접지 잔재 패널 AD에 ( &#39;W&#39;) 볼 수 있습니다. (A) 낮은 전력, 망막과 공막을 관통 택의 흠없는 이미지. (B) 망막 박리의 높은 전원이 공급되는 이미지와 흠없는 망막 인접한에게 폴딩 압정 형 샤프트의 중심에서 이미지 A. (C) 저전력 이미지 실리콘 캐리어. <str옹&gt; (D) 별도의 샘플에서 이미지 C. (E)의 압정의 중심의 고성능 이미지, 아니 실리콘 캐리어, 택 칼자루 아래 톨루이딘 블루 스테인드 망막의 높은 전원이 공급되는 이미지가 직전에 도시된다 . 압정 축 (F) 일반 톨루이딘 블루 염색 망막 구조를 연삭 (GCL : 망막 신경절 세포 층; INL : 내부 핵 층; ONL : 외부 핵 층; PR : 감광체; T : 고양이 휘판)는 같은 연마 기술을 사용하여 시각 . 각 패널의 스케일 바는 다음과 같습니다 A와 C = 2mm; B 및 D = 500 μm의; E = 200 μm의; F 100 μm의 =.

여기에서는 금속 망막 점착 및 망막 보철물에 직접 인접한 안구 조직을 시각화하기 위한 조직학적 기술에 대해 설명합니다.

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

단단한 금속 성분이 포함된 망막 보철물은 전통적인 조직학적 처리 과정과 호환되지 않습니다. 본 영상에서는 금속 T-바로 망막상 표면에 고정된 망막 임플란트와 직접 인접한 안구의 건강 상태를 평가하는 기술을 설명합니다. 이를 위해 우선 동반 영상에 설명된 프로토콜에 따라 안구를 핵 형성 및 고정시킨 후, 임플란트와 망막 T-바를 포함하는 조직 샘플을 절제합니다. 두 번째 단계는 조직 샘플을 점진적으로 탈수시킨 다음, 2단계 매립 과정을 통해 원하는 방향으로 에폭시 수지에 매립하는 것입니다. 다음으로, 최종 수지 블록을 특수 홀더에 장착하고 임플란트와 주변 안구 조직의 횡단면이 원하는 높이에서 노출될 때까지 점진적으로 연마합니다.마지막 단계는 노출된 조직을 표면 염색한 후, 고배율 해부 현미경으로 촬영 및 사진 촬영을 하여 이식된 보형물 인접 부위의 세포 구조를 시각화하는 것입니다. 이러한 단계들은 필요에 따라 여러 번 반복합니다. 최종적으로, 제자리에 있는 이식물을 포함하여 조직 샘플을 가로지르는 일련의 단면 영상들이 수집되며, 이는 장치나 수술 설계의 개선뿐만 아니라 특정 보형물의 안전성을 평가하는 데 활용될 수 있습니다.전통적인 칼날 기반의 조직 절편 제작법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 금속 성분을 포함하여 심장에 삽입된 물체를 시술 중에 제자리에 유지할 수 있어, 임플란트와 조직 사이의 인터페이스를 시각화할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 삽입된 망막 보철물에 인접한 섬세한 안구 조직의 구조적 무결성을 평가하는 것과 같이 망막 보철물 분야의 핵심적인 질문들에 답을 줄 수 있습니다. 함께 제공되는 JoVE 비디오에 설명된 대로 안구를 적출하고 고정한 후, 임플란트와 그것이 안구 외부에 고정된 지점을 시각화하십시오.15도 칼날을 사용하여 각막에 원주형 절개창을 만들고 각막 캡을 제거하여 안구 내부를 노출시킵니다. 이 망막상 임플란트 수술 절차의 일부인 수정체 제거 유리체 절제술을 통해 수정체가 이미 제거되었음에 유의하십시오.그 다음, 홍채와 렌즈의 잔여 Z-섬유를 절개하여 망막상 임플란트와 금속 T자가 제자리에 위치한 후방실을 노출시킵니다. 임플란트의 종류와 수행 중인 연구에 따라, 추가 절개 전에 불필요한 구성 요소를 제거하십시오. 본 예시에서 평가 대상인 망막상 어레이는 컨포멀 실리콘 캐리어 내에 수용된 프로토타입 밀폐형 다이아몬드 전극 및 전자 장치 패키지로 구성됩니다.택(tack)과 주변 조직이 포함된 샘플을 원하는 방향으로 조심스럽게 절개합니다. 미세 절개 가위를 사용하여 공막, 맥락막 및 망막을 포함하여 안구 뒷부분에서 전층 스트립을 절단합니다. 여기에서 메스를 이용한 미세 절개로 다이아몬드 전극 패키지를 조심스럽게 추출합니다.망막 턱(retinal tack)과 백금 배선의 잔해와 함께 임플란트의 실리콘 본체를 그대로 둡니다. 턱에 인접한 모든 망막 층이 보이는 턱의 종단면 샘플을 채취하십시오. 그 후 샘플을 70% Ethanol로 되돌립니다.점진적인 에탄올 농도 단계에 따라 3일 동안 시료를 탈수합니다. 먼저, 70% ethanol에서 2시간씩 2회 시료를 탈수합니다. 다음으로, 80% ethanol에서 2시간씩 2회 탈수하고, 다음 날 90% Ethanol에서 2시간씩 2회 탈수하며 하룻밤 동안 둡니다. 이어서 100% ethanol에서 2시간씩 2회 탈수한 후, 하룻밤 동안 둡니다.마지막으로, 100% acetone으로 2시간씩 2회 샘플을 탈수합니다. 샘플을 acetone에서 꺼내어 실온에서 자연 건조시키며 광학 현미경으로 관찰합니다. 연조직에서 액체가 제거되면 세포가 붕괴하고 수축하게 됩니다.시료가 말리기 시작하거나 붕괴되기 직전에 에폭시로 옮깁니다. 조직의 말림과 붕괴가 일어나는 시점을 판단하는 능력은 경험을 통해 습득됩니다. 시료를 투명 에폭시 수지에 매립하려면, 적절한 밀폐 용기에 담긴 액상 에폭시에 안구 조직을 침전시키십시오.진공 챔버에서 에폭시의 기포를 조심스럽게 제거한 후, 실온에서 하룻밤 동안 방치하여 경화시킵니다. 밴드쏘(bandsaw)와 리드(reed)를 사용하여 경화된 에폭시와 시료의 크기를 조정함으로써 시료가 원하는 방향으로 매립되도록 주의하십시오. 안구 조직이 포함된 크기가 조정된 블록을 새로 액상화한 에폭시에 넣어, 핀의 장축이 몰드 바닥과 평행하도록 배치합니다. 순간접착제를 소량 사용하여 크기가 조정된 시료를 시료 홀더 바닥에 고정합니다.시료 홀더에 액상 에폭시를 채우고 이전과 같이 탈기한 후 하룻밤 동안 경화시킵니다. 그다음 수지를 연마용 시료 홀더에 장착하고, 물을 흘려보내며 실리콘 카바이드 페이퍼를 사용하여 230~250 RPM에서 시료를 수동으로 연마합니다. 염색을 위해 연마된 표면을 토인 블루(toine blue) 염색약에 3~5분 동안 또는 염색이 될 때까지 담급니다.수돗물로 샘플을 헹군 후, 고배율 해부현미경으로 시편의 연마된 표면을 촬영하십시오. 망막의 세포층을 시각화하려면, 시편 바로 위의 에폭시 상단 표면에 증류수 한 방울을 떨어뜨리십시오. 이는 공기와 에폭시 계면에서의 회절 현상을 완화하기 위함입니다.광섬유 구즈넥 광원을 사용하여 시료를 조사합니다. 미리 설정된 두께만큼 시료를 연마할 때마다 연마 및 이미징 단계를 반복합니다. 시료 홀더의 정밀하고 재현 가능한 최소 연마 증분은 20 microns입니다.이 과정은 임플란트와 주변 안구 조직을 가로지르는 단면이 원하는 높이에서 노출될 때까지 점진적으로 반복됩니다. 여기 연마 과정의 여러 시점에서 티타늄 망막 T 직후에 시각화된 망막 조직의 예시 이미지들이 있습니다. 이미지들은 실리콘과 톨루이딘 블루로 염색된 망막 및 염색되지 않은 망막에 인접하여 안구를 관통하고 공막을 통해 나오는 택(tack)의 종단면을 보여줍니다.실리콘 양측에서 인위적이지 않은 망막 박리와 주름이 저배율 및 고배율 모두에서 관찰될 수 있습니다. 택(tack)의 샤프트가 실리콘에 매립된 것이 보이며, 택의 헤드는 망막과 공막을 관통한 상태입니다. 여기서 저배율과 고배율 모두에서 관찰되는 실리콘 양측의 염색되지 않은 망막에 인위적이지 않은 망막 박리가 있음이 분명하게 나타납니다.해당 사례는 택(tack) 인근의 망막 조직 해체와 사선 삽입 각도로 인해 한쪽 망막이 압착된 모습을 보여주었습니다. 이 절차를 수행할 때는 결과물인 연마면이 원하는 평면과 일치하도록 시료를 주의 깊게 매몰, 방향 설정 및 고정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 연마된 시료는 추후 복구가 불가능하므로 각 연마 단계마다 여러 장의 사진을 촬영하여 수집해야 합니다.이 방법은 망막 보철물의 조직학적 분석에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 뇌 심부 임플란트, 혈관 스텐트 또는 정형외과적 보철물과 같이 단단한 이식 부품을 사용하는 다른 시스템의 장치-조직 인터페이스를 시각화하는 데에도 적용될 수 있습니다.

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신문은 인간의 시체 같은 기증자의 안구 세계에서 망막 조직을 내장을 들어낸하는 간단한 소비세 각막에 대한 기술과 설명합니다. 기술은 안구 세계의 다른 조직을 손상시키지 않고 이식, 수술이나 연구 목적을 위해 사용되는 소비세 양질의 조직에 도움이됩니다 여기서 설명했다.

위한 간편한 기법<em&gt; 현장에서</em인간 안구 글로브에서 각막 및 망막 조직의 내장 적출의&gt; 절단

망막 자극기 내의 개별 전극에 바로 인접한 망막 cytoarchitecture를 시각화하는 기술.

현지화 된 조직 병리학 적 분석을 위해 망막 보철물 이식 처리 눈을위한 기법

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

여기에서 우리는 쥐와 생쥐에 RPE 세포 덩어리를 망막하 주입하기 위한 멀티미디어 형식의 커뮤니티 승인 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 망막 변성의 동물 모델에 이식할 때 이식된 RPE 세포의 구조 가능성, 안전성 프로필 및 생존 능력을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

망막 색소 상피 (RPE) 대체 전략 및 유전자 기반 치료는 여러 망막 퇴행성 조건이 고려된다. 임상 번역, 큰 눈 동물 모델은 환자에 적용 할 수있는 수술 기법을 연구해야합니다. 여기에서 우리는 다양하고 비용 효율적인 RPE 이식에 맞 망막 수술 토끼 모델을 제시한다.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

이 연구는 절제 처리 중 망막 무결성을 손상시키는 것을 방지하는 새로운 인간 organotypic 망막 문화 (HORC) 모형을 개발하는 것을 목표로 합니다. 이것은 과대 유리체와 근본적인 망막 안료 상피 코로이드 (RPE-choroid) 및 clera로 망막을 배양해서 달성됩니다.

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

비인간 영장류 (NHP)는 해부학적 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 망막 세포 치료법을 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 원고는 NHP 눈의 망막 색소 상피 세포의 피하 학적 이식 방법과 황반 조작과 관련된 수술 내 합병증을 방지하기위한 전략을 설명합니다.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

기존 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 장비를 수정하면 생체 외 망막전전도에 더 널리 접근할 수 있습니다. 생체 외 광 반응을 기록하고 유지하는 개선된 방법은 건강한 망막, 안과 질환의 동물 모델 및 인간 기증자 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 연구를 용이하게 합니다.

작고 큰 눈의 망막 기능을 연구하기 위해 생체 외 망막 전도의 설정 및 조건 최적화

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

배우세요 망막 보철물 주변 안구 조직의 조직병리학적 분석 기법을 에폭시 수지 임베딩과 연삭을 통해. 이 방법은 금속 성분이 포함된 이식물의 생체적합성 평가에 필수적입니다.

현지화 된 조직 병리학 적 분석을위한 망막 보철물로 이식 된 가공 눈을위한 기술 : 파트 망막 끌어 올릴 2 망막 임플란트

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