Name: 연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 학습하세요 생쥐 비강에 Streptococcus pneumoniae를 식민지화하고 면역 세포를 추출하는 방법을. 이 기술은 호흡기 감염 연구와 박테리아-면역 상호작용 분석에 활용됩니다.

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저자는 연쇄상 구균 폐렴의임상 긴장의 그의 선물에 대한 펜실베니아 대학의 박사 제프리 와이저에게 감사드립니다. 이 연구는 건강 연구를 위한 캐나다 학회에 의해 투자되었습니다. 이력서는 M. G. DeGroote 펠로우십과 캐나다 흉부 학회의 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 온타리오 폐 협회와 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR)에 의해 투자되었다. 보우디시 실험실에서 일하는 것은 감염증 연구를 위한 마이클 G. DeGroote 센터 및 맥매스터 면역학 연구 센터에 의해 부분적으로 지원됩니다.

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이 연구에서는 연쇄상 구균 폐렴의 임상 분리 균주와 박테리아에 대한 응답으로 nasopharynx에 모집 된 면역 세포의 후속 격리 및 특성화를 사용하여 마우스의 비강 내 식민지화를위한 자세한 방법을 제시했습니다. 우리는 어떻게 세균성 접종이 영양이 풍부한 매체에서 배양되고 처음에 비소하린으로 제한되는 마우스에 있는 식민지 사건을 설치하는 데 사용될 수 있는지 보여주었습니다. 그런 다음 비소하린에 모집되는 면역 세포 유형에 어떻게 반응하는지 기관 노출, 절개 및 칸침바늘을 사용하여 비강 용암을 분리할 수 있는지 를 보여주었습니다. 비강 용암 샘플은 PBS에서 수집되어 그대로 가볍게 부착된 세포를 분리할 수 있습니다. RNA는 보다 단단히 부착된 세포및 주변 상피 점막 층으로부터 RNA 용해 완충제로 구성된 이차 세척을 적용하여 분리될 수 있다. 이들 샘플의 전자는 유동 세포측정 기술을 통해 식민지화의 맥락에서 모집된 특정 세포를 표현하는 데 사용될 수 있으며, 후자는 Q-PCR 분석에 적용될 수 있으며, 이러한 ...

<table><tbody><tr><td>안티 마우스 Ly6C FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553104</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly6G PE</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45.1 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 F4/80 항원 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD11c PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD11b PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD3 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD4 eFluor 605NC</td><td>eBioscience</td><td>93-0041-42</td><td></td></tr><tr><td>인트라메딕틱 폴리에틸렌 튜빙 - PE20</td><td>Becton Dickinson 427406</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD 26 G 3/8 피내 베벨</td><td>Becton Dickinson</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 RLT 용해 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Difco Tryptic soy Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>제세화 양 혈액</td><td>PML 미생물학</td><td>A0404</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV 역전사 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR 마스터 믹스</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td></td></tr></tbody></table>

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

연쇄상 구균 폐렴에 의한 비인두 식민지는 폐 또는 혈류량1에침입하는 전제 조건이다. 이 유기체는 비소하린의 점막 표면을 식민지화 할 수 있으며, 여기서 호스트 방어를 극복하고 호스트의 다른 조직에 침입할 수 있습니다. 일반적으로 낮은 호흡기에 감염의 설립은 폐렴귀착됩니다. 대안적으로, 박테리아는 높은 사망률2와연관되는 박테혈증을 일으키는 혈류로 전파할 수 있고, 또는 그렇지 않으면 폐렴구균 수막염의 발달로 직접 이끌어 낼 수 있다. 비인두 식민지의 운동 및 면역 반응을 이해하는 것은 S. 폐렴 감염 모델의 중요한 측면입니다.
비강 내 식민지화의 마우스 모델은 인간모델3로부터 적응하고 비소하린4-7의 숙주 병원체 반응 연구에서 여러 연구군에 의해 사용되어 왔다. 모델의 첫 번째 부분에서, 우리는 인간 성인의 운송 이벤트와 유사한 자기 제한 세균 성 식민지를 확립하기 위해 S. 폐렴의 임상 분리를 사용합니다. 본명 상세절차는 세균성 접종의 준비를 포함하고, 그 다음에는 행정의 비강 내 경로를 통해 접종의 전달을 통해 식민지화 사건의 수립을 포함한다. 상주 대식세포는 정상 상태 동안 비소하린의 주요 세포 유형이다. 전형적으로, 감염되지 않은 마우스에 존재하는 몇몇 림프구가8,그러나 점막 식민지는 면역 반응 및 호스트 면역 세포의 후속 모집귀착될 낮은- 고급 염증 (세균성 종 및 긴장의 독성에 따라 다름)으로 이끌어 낼 것입니다. 이러한 세포는 나레를 통해 기관 내용물의 용암에 의해 격리될 수 있으며, 감염의 운동학을 더 잘 이해하기 위해 식민지 박테리아의 밀도와 상관관계가 있다.

그림 1은 프로토콜의 주요 단계를 요약한 개요 회로도를 나타냅니다. 도 2-3은 본 원에 기재된 프로토콜에 내재된 미생물 방법론의 시각화를 제공한다. 도 4는 내비강폐를 수행하기 위해 마우스의 적절한 위치를 나타내고, 도 5는 S. 폐렴 균주 P1547로 식민지화된 마우스의 무게의 전형적 변화를 묘사한다. 도 6-7은 이러한 두 기술의 보조 시각화를 위해 공정의 비강 용암 부분의 특정 단계를 나타낸다. 도 8-11은 비강 용암 다음 마우스의 비소하린으로부터 수집된 샘플에 대한 분석의 대표적인 결과로 구성된다. 구체적으로, 도 8은 비소하린의 세균부하의 대표적인 결과이며, S. 폐렴균제 P1121, P1547 또는 P1542로 식민지화된 마우스로부터 얻어진 비강 용암의 배양을 통해 결정된다...

연쇄상 구균 폐렴을 이용한 뮤린 비소하린의 식민지화및 신봉또는 모집된 세포의 후속 추출이 설명된다. 이 기술은 나아레를 통해 유체의 비소하린과 수집을 플러시하는 것을 포함하며, 시투에서mRNA 발현의 차동 세포 정량화 및 분석을 포함한 다양한 판독에 적응할 수 있다.

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

이 절차는 쥐의 비인두에 streptococcus pneumonia를 정착시키고, 이후 정착된 박테리아와 부착 또는 모집된 세포를 추출하는 과정을 포함합니다. 이는 먼저 관심 있는 S pneumonia 균주의 박테리아 접종액을 준비함으로써 수행됩니다.이후 마취된 생쥐를 보정 기구에 고정한 상태에서 살아있는 박테리아를 비강 내로 투여합니다. 원하는 기간 동안 정착시킨 후, 생쥐를 안락사시키고 노출된 기관에 캐뉼라를 삽입하여 비강 내 물질을 세척함으로써 비강 세척액을 수집합니다. 비강 세척액에 존재하는 박테리아 수는 미생물학적 기법을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 또는, 유입된 세포의 표현형을 분석하기 위한 유세포 분석법이나 정량적 PCR 기법을 사용하여 면역 반응을 분석할 수 있습니다.시작 전, 관심 있는 mRNA의 발현 수준을 측정하려면 절차의 비강 내 정착 단계에 필요한 마우스 보정기와 비강 세척용 캐뉼라 바늘을 준비해야 합니다. 50 mL 팰콘 튜브의 테이퍼형 팁 부분을 잘라내어 마우스 보정기를 간단히 만들 수 있습니다. 개구부를 만든 후에는 가위를 사용하여 날카로운 끝부분을 매끄럽게 다듬으십시오.캐뉼라 바늘을 준비하려면 내경이 0.38 mm인 PE 20 폴리에틸렌 튜브가 필요합니다. 26 및 3/8 gauge 베벨 바늘이 장착된 1 mL 시린지, 정밀한 홍채 가위 한 쌍, 그리고 포셉 한 쌍을 준비하십시오. 정밀 가위로 PE 20 튜브를 약 2.5 cm 또는 1인치 길이로 자르되, 각 끝단이 베벨 팁 형태가 되도록 하십시오.포셉을 사용하여 이 조각 중 하나를 바늘 끝으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 튜브 쪽을 찌르지 않도록 주의하며, 캐뉼라 바늘은 필요할 때까지 70% ethanol에 보관하고 사용 직전에 PBS로 세척하여 사용할 수 있습니다. S pmo를 이용한 마우스 비강 내 군집화의 경우, 10 µL의 부피로 10⁹ CFU/mL 농도로 투여하는 것을 권장합니다.10⁷ CFU의 최종 투여량을 위해, 접종액을 사용 직전까지 얼음 위에 보관하고 각 접종 사이에 반드시 흔들어 섞어주십시오. 접종액 외에도 멸균된 팁이 장착된 P 10 또는 P 20 피펫과 마우스 보정기가 필요합니다. 개별 마우스의 꼬리를 잡아 이전에 준비한 마우스 보정 장치에 넣어 고정하십시오.마우스를 보정기에 넣는 데 어려움이 있다면, 보정기를 마우스 앞쪽 상단에 배치하여 동물이 위로 기어 올라갈 수 있게 하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 마우스가 보정기 내부에 들어가면, 코가 보정기의 좁아지는 끝부분 밖으로 나올 수 있도록 몸의 하단을 살짝 위로 밀어 올려 고정하십시오. P 10 또는 P 20 피펫을 사용하여 준비된 배양액 10 µL를 양쪽 콧구멍에 균등하게 나누어 주입하십시오.접종물을 서서히 펄스 형태로 주입하여 콧속으로 떨어뜨리며, 마우스가 접종물을 흡입할 수 있도록 충분한 시간을 둡니다. 마우스가 접종물의 일부를 코 밖으로 재채기하여 배출할 수 있으며, 이는 예상되는 현상입니다. 박테리아가 비인두에 국한되고 하기도로 퍼지지 않도록 하기 위해, 이 절차 동안 마우스를 반드시 마취시켜야 합니다.본 시연에서는 PBS를 접종하지만, 살아있는 박테리아를 다룰 때는 항상 기관에서 승인한 가이드라인에 따라 절차를 수행하십시오. 예를 들어, 대부분의 기관에서는 생물안전 2등급(BSL-2) 후드 내에서 군집 형성을 진행하도록 요구합니다. 종점 모니터링 방법의 일환으로 체중 지표를 사용하는 경우, 군집 형성 직후 MA를 측정하고 12~24시간마다 마우스의 무기력증, 털 거칠어짐, 체중 감소를 포함한 임상 증상을 모니터링하십시오.마우스의 정착이 완료되면 원하는 기간 동안 유지합니다. 해당 기간이 종료되면 마우스를 안락사시키고 비강 세척을 수행하는데, 경추 탈구는 기관을 손상시킬 가능성이 있으므로 이러한 안락사 방법은 피해야 합니다.비강 세척을 수행하기 전, 다음 준비물을 갖추었는지 확인하십시오. 미리 준비된 캐뉼라 바늘, 70% aqueous ethanol, 포셉 한 쌍, 정밀 이리스 가위 한 쌍, 인산완충생리식염수(PBS), RNA lysis buffer, 그리고 1 mL 에펜도르프 튜브입니다. 준비가 완료되면 동물을 똑바로 눕히고, 70% aqueous ethanol을 사용하여 목 부위를 중심으로 앞부분의 털을 소독합니다.에탄올이 비강에 들어가지 않도록 주의합니다. 동물의 목 정중선을 따라 세로로 한 번 절개하여 기관을 확인할 수 있도록 개구부를 만듭니다. 피부를 양옆으로 조심스럽게 젖혀 아래의 목 조직이 드러나게 합니다.이 단계에서 기관은 양측의 종근에 둘러싸여 보일 것입니다. 주변 혈관을 절단하지 않도록 주의하면서, 기관 자체를 명확하게 볼 수 있도록 이 근육들을 조심스럽게 절단하십시오. 실수로 혈관을 절단하여 진행 전 해당 부위에 혈액이 고여 있는 경우,출혈이 멈출 때까지 기다린 후, 멸균 PBS를 분사하고 멸균 거즈를 사용하여 과잉 수분을 부드럽게 흡수함으로써 해당 부위를 여러 번 세척합니다. 기관이 적절하게 노출되면, 기관의 중간 지점에 횡방향의 반월형 절개를 가합니다. 캐뉼라 주사기에 멸균 PBS를 넣습니다.삽입이 용이하도록 베벨(beveled edge) 끝이 아래를 향하게 하여 캐뉼라를 비강 방향의 기관으로 삽입합니다. 캐뉼라가 배치되면 180도 회전시킨 후, 가벼운 저항이 느껴질 때까지 부드럽게 위쪽으로 탐색합니다. 시료 수집용으로 지정된 EEND DPH 튜브를 마우스의 코 바로 아래에 배치합니다.최소량의 PBS 세척액을 투여하여 캐뉼라가 정확하게 배치되었는지 확인합니다. 캐뉼라가 올바르게 배치되었다면, 마우스의 NAS 주변에 액체 방울이 형성되어야 합니다. 만약 테스트용 PBS가 동물의 입 밖으로 직접 흘러나온다면, 캐뉼라를 뒤로 뺀 다음 아주 약간의 저항이 느껴질 때까지 천천히 전방으로 탐색하며 다시 위치를 잡으십시오.캐뉼라를 이 저항 지점 너머로 너무 깊게 밀어 넣지 않도록 주의하십시오. 그렇게 하면 비강 입천장을 지나 구강으로 진입하게 됩니다. 캐뉼라가 정확하게 위치했음을 확인한 후, 200 µL의 PBS를 빠르게 분주하여 최대한 많은 세포를 배출시키고 수집하십시오. 내용물은 마우스의 콧구멍을 통해 수집 튜브 안으로 흘러나와야 합니다.샘플을 즉시 얼음에 둡니다. 이 샘플들은 이후 세균 부하 및 세포 모집 여부를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. RNA 분석용 샘플을 수집하려면, 500 µL의 RNA 용해 버퍼가 담긴 별도의 캐뉼라 바늘을 사용하여 2차 비강 세척을 수행하십시오.RNA 용해 버퍼는 상피 세포를 박리시키고 주변 조직을 파괴하므로, 폐와 같은 장기에 접촉되지 않도록 주의해야 합니다. 비인두의 세균 부하량을 정량하기 위해 이러한 조직의 보존이 필요한 경우에는 다음의 과정이 필요합니다.triptych soy egg가 포함된 미생물 배지 플레이트와 Epicor 튜브에 5% sheep's blood를 보충합니다. vortex mixer, PBS, 멸균 파이펫 팁, P 20 및 P 200 파이펫을 준비합니다. 먼저 BSL 2 후드 내에서 각 mirin 비강 세척액 샘플에 대한 단계 희석 시리즈를 준비합니다.일반적으로 비인두 내 S pneumoniae의 농도는 0에서 10⁴ CFU 사이일 것으로 예상됩니다. 따라서 10배 단계 희석을 3회 수행하며, 첫 번째 튜브에 원액 상태의 비강 세척 시료 10 µL를 첨가하여 10⁻¹ CFU/mL 농도로 만들고, 세 개의 시료가 충분히 희석될 때까지 낮은 농도로 계속 희석합니다. 각 희석 단계 사이에는 충분히 볼텍싱하십시오. 이 영상은 시연 목적으로만 제작되었음을 참고하시기 바랍니다.희석 단계마다 피펫 팁을 교체하는 것을 포함하여 적절한 실험실 기법을 항상 준수해야 합니다. 네임펜을 사용하여 논리 플레이트의 뒷면을 4등분하고, 각 구역에 도말할 해당 희석 배수를 표시합니다. 각 희석액의 10 µL 샘플 세 방울을 한천 배지에 도말합니다. 덮개를 열어둔 상태로 15분에서 30분 동안 건조시킨 후, 플레이트의 덮개를 닫고 폐렴구균 성장에 최적화된 조건(통상적으로 37 °C 및 5% CO2)의 세균 배양기에 뒤집어서 보관합니다.이 플레이트들을 24~48시간 동안 배양합니다. 이 시간이 지난 후, 플레이트를 꺼내 플레이트에 형성된 콜로니 수의 평균을 구하여 정착 박테리아의 수를 결정합니다. 각 희석 단계에서, 박테리아가 한천배지의 혈액 보충제를 분해하여 각 콜로니 주변에 작은 후광 형태로 나타나는 알파 용혈 구역과 특유의 베이지색을 통해 animo 콜로니를 식별할 수 있습니다.마지막으로, 각 콜로니 중심부에 작은 함몰 부위가 있어 적혈구와 같은 모양을 띱니다. 이 영상을 시청함으로써, 마우스의 비인두에 세균 정착을 유도하는 방법, 정착 후 비강 세척을 통해 마우스의 비인두에서 박테리아와 세포를 분리하는 방법, 그리고 미생물학적 기법을 사용하여 해당 박테리아 부하량을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이 영상에서 설명한 방법들이 연구가 미진한 이 부위에서 병원균에 대한 숙주 반응을 연구하기 위해 비강 내 정착 모델을 사용하는 데 도움이 되기를 바랍니다.

characterization-inflammatory-responses-during-intranasal

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 삽관 및 폐엽에 박테리아 현탁액 설치를 통해 면역 능력이 있는 설치류 모델에서 폐 감염이 확립되는 것을 보여줍니다. 이 모델은 면역 능력이 있는 동물에서 항균 효능 연구를 가능하게 합니다.

면역 역량이 있는 설치류 모델에서 폐렴 연쇄상구균의 기관지 내 주입

실험 인간 폐렴 운송은 운송 자연 모델과 백신 개발에 사용할 수있는 잠재적 인 모델을 제공합니다. 이 기술은 가치가 아직 복잡하고 인간에 병원균을 도입하여 임상 위험을 가지고 있습니다. 우리는 자세한 프로토콜을 개발했습니다.

실험 인간 폐렴의 운송

폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균​​혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

연쇄상구균 폐렴은 심장에 별개의 비화농성 현미경 병변을 형성합니다. 요약된 것은 심장 미세 병변 형성의 쥐 모델에 대한 프로토콜입니다. 현미경을 사용한 미세 병변 시각화, 초기 미세 병변과 후기 미세 병변 구별, 회복기 동물의 심장에서 심장 리모델링을 감지하는 방법에 대한 지침이 제공됩니다.

시각화<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 심장 Microlesions 및 후속 심장 리모델링 내

숙주-병원체 상호 작용에 대한 체외 연구는 특정 면역 반응의 특성을 규명할 수 있지만 복잡한 반응의 영향을 관찰하려면 생체 내 모델이 필요합니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 노출 후 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 매개 폐 감염을 사용하여 인공호흡기 관련 폐렴 병원성과 관련된 미생물 상호 작용에 대한 쥐 모델을 확립했습니다.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

우리는 쥐의 하기도에 헤모필루스 인플루엔자를 기관 내 접종하는 절차를 보여줍니다. 이것은 마우스 모델에서 기도 염증을 조절하는 신호 경로를 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다.

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이 원고는 생쥐에서 폐렴의 전염성 모델을 확립하고 손상 해결의 각각의 특성과 함께 박테리아 성장 및 기관 내 점안 방법을 설명합니다. 고차원 유세포 분석을 사용하여 면역 환경을 평가하는 새로운 접근 방식도 설명합니다.

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이 논문은 바이러스 감염 동안 폐렴구균이 무증상 집락 상태에서 질병을 유발하는 병원체로 전환하기 위한 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 질병 진행의 여러 단계 동안 다양한 숙주에서 다미생물 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 Streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다.

학습하세요 생쥐 비강에 Streptococcus pneumoniae를 식민지화하고 면역 세포를 추출하는 방법을. 이 기술은 호흡기 감염 연구와 박테리아-면역 상호작용 분석에 활용됩니다.

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