연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

이 절차는 폐렴을 앓고 있는 murn nasopharynx의 집락화와 그에 따른 집락화 박테리아 및 부착 세포 또는 모집된 세포를 추출하는 것을 포함합니다. 이것은 먼저 S 폐렴의 박테리아 접종물을 준비함으로써 달성됩니다. 관심의 변형.

그런 다음 살아있는 박테리아를 억제 장치에 있는 동안 마취된 마우스에 비강 내로 투여합니다.원하는 길이의 집락화 후 마우스는 안락사되고 노출된 기관을 캐뉼러하고 NASA를 통해 내용물을 씻어냄으로써 비강 세척을 수행합니다. 비강 세척액에 존재하는 박테리아 수는 미생물 학적 기술을 사용하여 정량화 할 수 있습니다. 또는 면역 반응은 모집된 세포를 표현형화하기 위한 유세포 분석 기술 또는 정량적 PCR 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

시작하기 전에 발현된 관심 mRNA의 수준을 측정하려면 절차의 비강 내 집락화 부분을 위한 마우스 억제기와 비강 세척을 위한 캐뉼레이트 바늘을 준비해야 합니다. 마우스 억제기는 50 밀리리터 팔콘 튜브의 테이퍼 팁을 잘라서 간단히 준비 할 수 있습니다. 조리개를 만들었으면 가위를 사용하여 날카로운 끝을 닦으십시오.

캐뉼러 바늘을 준비하려면 내경이 0.38mm인 다음 PE 20 폴리에틸렌 튜브가 필요합니다. 밀 주사기 1개에는 26개의 바늘과 8게이지 베벨 바늘 3개, 날카롭고 가는 홍채 한 쌍, 가위, 집게 한 쌍이 있습니다. 가는 가위로 PE 20 튜브를 약 2.5cm 또는 1인치 길이의 조각으로 자르고 각 끝의 끝이 비스듬한지 확인합니다.

집게를 사용하여 이 조각 중 하나를 바늘 끝에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 튜브 측면에 구멍이 뚫리는 것을 방지하기 위해 캐뉼러 바늘은 필요할 때까지 70% 에탄올에 보관하고 사용 직전에 PBS로 세척할 수 있습니다. S pmo를 가진 마우스의 비강 내 집락화의 경우, 10 마이크로 리터로 전달되는 mil 당 9 개의 집락 형성 단위에 10의 농도를 사용하는 것이 좋습니다.

7 CFU에 10의 최종 복용량을 얻으려면 사용 직전까지 접종물을 얼음 위에 보관하고 각 집락 사이에 교반해야 합니다. 접종 외에도 P 10 또는 P 20 피펫 멸균 피펫 팁과 마우스 구속 장치가 필요합니다. 개별 마우스의 꼬리를 분리하고 미리 준비한 마우스 억제 장치에 넣어 억제합니다.

마우스를 구속구로 유도하는 데 문제가 있는 경우 동물이 위로 기어 올라갈 수 있도록 마우스 앞과 위에 마우스를 배치하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 마우스가 구속장치 내부에 들어가면 몸의 바닥을 잡고 부드럽게 위로 밀어 올려 코가 구속구의 가늘어진 끝에서 나오도록 합니다. P 10 또는 P 20 피펫을 사용하여 준비된 배양액 10마이크로리터를 증착하여 각 마우스에 접종하고 둘 사이에 균등하게 분배합니다. 나레스.

필요한 시간을 할애하여 접종 펄스를 서서히 주사하여 접종물이 코로 떨어지도록 합니다. 쥐는 코에서 일부 접종물을 재채기할 수 있으며, 이는 예상된 일입니다. 이 절차를 위해 쥐를 마취하여 박테리아가 비인두에 국한된 상태로 유지되고 하기도로 퍼지지 않도록 해야 합니다.

이 시연의 목적을 위해 PBS를 접종하고 있지만, 살아있는 박테리아를 대상으로 작업할 때마다 연구소에서 승인한 지침에 따라 절차를 수행해야 합니다. 예를 들어, 대부분의 기관은 생물 안전 레벨 2 후드에서 식민지 화가 수행되도록 요구할 것입니다. 종말점 모니터링 방법의 일부로 체중 지표를 사용하는 경우, 집락화 직후 MA는 12-24시간마다 쥐를 모니터링하여 무기력, 주름진 털 및 체중 감소를 포함한 임상 증상을 확인합니다.

생쥐가 군집화되면 원하는 기간 동안 보관하십시오. 이 기간이 끝나면 생쥐는 안락사되고 경추 탈구가 잠재적으로 기관을 손상시킬 수 있으므로 코 세척이 수행됩니다. 이러한 안락사 방법은 피해야 합니다.

비강 세척을 수행하기 전에 다음을 준비하십시오. 이전에 준비된 캐뉼러 바늘, 70% 수성 에탄올, 한 쌍의 집게, 한 쌍의 날카로운 미세한 홍채 가위, 인산염, 완충 식염수, RNA 용해 완충액 및 1개의 밀 아이너 튜브. 시작할 준비가 되면 동물을 등에 평평하게 눕히고 70% 수성 에탄올을 사용하여 털 앞면, 특히 목 부분을 살균합니다.

에탄올이 콧구멍에 접근하지 않도록 주의합니다. 동물의 목 정중선을 따라 세로로 한 번 잘라서 기관을 상상할 수 있는 구멍을 만들 수 있습니다. 양쪽 피부를 조심스럽게 벗겨내면 아래에 있는 목 조직이 드러납니다.

이 시점에서 기관이 양쪽의 세로 근육으로 둘러싸여 보여야 합니다. 기관 자체를 명확하게 볼 수 있도록 조심스럽게 자르고 주변 혈관 구조를 절단하지 않도록 주의하십시오. 실수로 혈관 구조를 절단하고 진행하기 전에 해당 부위에 혈액이 존재하는 경우.

출혈이 멈추도록 한 다음 멸균 PBS를 분배하고 멸균 거즈를 사용하여 과도한 수분을 부드럽게 흡수하여 해당 부위를 여러 번 청소합니다. 기관이 제대로 노출되면 기관의 절반 정도를 가로 반달 절단합니다. 멸균 PBS를 캐뉼러 주사기에 떨어뜨립니다.

캐뉼라를 코 쪽의 기관에 삽입하고 쉽게 삽입할 수 있도록 경사진 가장자리가 아래를 향하도록 합니다. 캐뉼라가 제자리에 놓이면 180도로 회전하고 가벼운 저항이 느껴질 때까지 부드럽게 위쪽으로 프로브합니다. 샘플 채취를 위해 지정된 EEND DPH 튜브를 마우스의 코 바로 아래에 놓습니다.

최소한의 PBS 세척액을 분배하여 캐뉼라의 올바른 배치를 테스트합니다. 그 후, 캐뉼라가 올바르게 배치되면 마우스의 NAS 주위에 액체 방울이 형성되어야 합니다. 테스트 PBS가 동물의 입에서 직접 나오면 캐뉼라를 뒤로 당기고 아주 약간의 저항이 느껴질 때까지 부드럽게 앞으로 탐색하여 다시 위치를 변경합니다.

캐뉼라가 비강 입천장을 지나 구강으로 이동하므로 이 저항을 너무 멀리 밀지 않도록 주의하십시오. 캐뉼라가 올바른 위치에 있는지 확인한 후 200마이크로리터의 PBS를 빠르게 분주하여 최대한의 세포를 치환하고 수집하는 데 도움이 됩니다. 내용물은 마우스의 콧구멍을 통해 수집 튜브로 흘러 나와야 합니다.

샘플을 즉시 얼음 위에 놓습니다. 이러한 샘플은 이후에 박테리아 부하와 세포 동원에 대해 분석할 수 있습니다. RNA 분석을 위한 샘플을 수집하려면 500마이크로리터의 RNA 용해 완충액이 들어 있는 별도의 캐뉼레이트 니들을 사용하여 2차 비강 세척을 수행합니다.

RNA 용해 완충액은 상피를 벗겨내고 주변 조직을 파괴합니다. 따라서 폐와 같은 기관과의 접촉을 피하도록 주의를 기울여야 합니다. 비인두 세균 부하를 정량화하기 위해 이러한 조직의 유지를 원하는 경우 다음이 필요합니다.

Epicor 튜브, 삼부작 콩 난자를 포함하는 미생물 플레이트에는 5%의 양의 혈액이 보충됩니다. Vortex Mixer, PBS 멸균 피펫 팁 및 P 20 및 P 200 피펫. 먼저 BSL 2 후드에서 작업하고 각 미림 비강 세척 샘플에 대한 연속 희석 시리즈를 준비합니다.

일반적으로 비인두의 S 폐렴 농도는 4 CFU에 대해 0에서 10 사이로 예상할 수 있습니다. 따라서 3 회 10 배 연속 희석을 수행하고, 10 마이크로 리터의 깔끔한 비강 세척 샘플을 첫 번째 튜브에 10의 농도로 첨가하여 밀당 1 CFU를 뺀 다음, 각 희석 사이에 3 개의 샘플을 과도하게 완전히 소용돌이치게 희석 할 때까지 계속 하향 춥니 다. 이 비디오는 시연용으로만 제공됩니다.

dilu 사이의 피펫 팁 교체를 포함한 적절한 실험실 기술은 항상 sharpie를 사용하여 논리적 플레이트로 다시 나누고 사분면에 해당 희석액을 도금하여 레이블을 지정해야 합니다. 한천 플레이트에 각 희석액의 10마이크로리터 샘플을 세 방울 떨어뜨립니다. 뚜껑을 덮지 않은 상태에서 15-30분 동안 건조시킨 다음 플레이트를 덮고 폐렴구균 성장을 위한 최적의 조건(일반적으로 섭씨 37도 및 5%CO2)의 박테리아 인큐베이터에 거꾸로 놓습니다.

이 플레이트를 24-48시간 동안 배양하십시오. 이 기간이 지나면 플레이트를 제거하고 플레이트에 형성된 콜로니의 평균을 계산하여 콜로니징 박테리아의 수를 결정합니다. 각 희석에 대해 애니모 군체는 독특한 베이지색, 알파 용혈 구역으로 식별할 수 있으며, 이는 한천에 있는 혈액 보충제의 박테리아 소화에 의해 생성된 각 군집 주변의 작은 후광입니다.

그리고 마지막으로, 각 군체의 중심에있는 작은 움푹 들어간 곳에 의해 적혈구 (erythrocyte)의 모습을 보입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 비인두 es pmo를 설정하는 방법, 마우스의 집락화를 설정하는 방법, 비강 세척을 사용하여 집락 후 마우스의 비인두에서 박테리아와 세포를 분리하는 방법 및 미생물 기술을 사용하여 해당 박테리아 부하를 정량화하는 방법에 대해 확실히 이해하게 될 것입니다. 이 비디오에 설명된 방법을 통해 비강 내 집락화 모델을 사용하여 연구가 부족한 이 영역의 맥락에서 병원체에 대한 숙주 반응을 연구할 수 있기를 바랍니다.