연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

이 절차는 쥐의 비인두에 streptococcus pneumonia를 정착시키고, 이후 정착된 박테리아와 부착 또는 모집된 세포를 추출하는 과정을 포함합니다. 이는 먼저 관심 있는 S pneumonia 균주의 박테리아 접종액을 준비함으로써 수행됩니다.

이후 마취된 생쥐를 보정 기구에 고정한 상태에서 살아있는 박테리아를 비강 내로 투여합니다. 원하는 기간 동안 정착시킨 후, 생쥐를 안락사시키고 노출된 기관에 캐뉼라를 삽입하여 비강 내 물질을 세척함으로써 비강 세척액을 수집합니다. 비강 세척액에 존재하는 박테리아 수는 미생물학적 기법을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 또는, 유입된 세포의 표현형을 분석하기 위한 유세포 분석법이나 정량적 PCR 기법을 사용하여 면역 반응을 분석할 수 있습니다.

시작 전, 관심 있는 mRNA의 발현 수준을 측정하려면 절차의 비강 내 정착 단계에 필요한 마우스 보정기와 비강 세척용 캐뉼라 바늘을 준비해야 합니다. 50 mL 팰콘 튜브의 테이퍼형 팁 부분을 잘라내어 마우스 보정기를 간단히 만들 수 있습니다. 개구부를 만든 후에는 가위를 사용하여 날카로운 끝부분을 매끄럽게 다듬으십시오.

캐뉼라 바늘을 준비하려면 내경이 0.38 mm인 PE 20 폴리에틸렌 튜브가 필요합니다. 26 및 3/8 gauge 베벨 바늘이 장착된 1 mL 시린지, 정밀한 홍채 가위 한 쌍, 그리고 포셉 한 쌍을 준비하십시오. 정밀 가위로 PE 20 튜브를 약 2.5 cm 또는 1인치 길이로 자르되, 각 끝단이 베벨 팁 형태가 되도록 하십시오.

포셉을 사용하여 이 조각 중 하나를 바늘 끝으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 튜브 쪽을 찌르지 않도록 주의하며, 캐뉼라 바늘은 필요할 때까지 70% ethanol에 보관하고 사용 직전에 PBS로 세척하여 사용할 수 있습니다. S pmo를 이용한 마우스 비강 내 군집화의 경우, 10 µL의 부피로 10⁹ CFU/mL 농도로 투여하는 것을 권장합니다.

10⁷ CFU의 최종 투여량을 위해, 접종액을 사용 직전까지 얼음 위에 보관하고 각 접종 사이에 반드시 흔들어 섞어주십시오. 접종액 외에도 멸균된 팁이 장착된 P 10 또는 P 20 피펫과 마우스 보정기가 필요합니다. 개별 마우스의 꼬리를 잡아 이전에 준비한 마우스 보정 장치에 넣어 고정하십시오.

마우스를 보정기에 넣는 데 어려움이 있다면, 보정기를 마우스 앞쪽 상단에 배치하여 동물이 위로 기어 올라갈 수 있게 하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 마우스가 보정기 내부에 들어가면, 코가 보정기의 좁아지는 끝부분 밖으로 나올 수 있도록 몸의 하단을 살짝 위로 밀어 올려 고정하십시오. P 10 또는 P 20 피펫을 사용하여 준비된 배양액 10 µL를 양쪽 콧구멍에 균등하게 나누어 주입하십시오.

접종물을 서서히 펄스 형태로 주입하여 콧속으로 떨어뜨리며, 마우스가 접종물을 흡입할 수 있도록 충분한 시간을 둡니다. 마우스가 접종물의 일부를 코 밖으로 재채기하여 배출할 수 있으며, 이는 예상되는 현상입니다. 박테리아가 비인두에 국한되고 하기도로 퍼지지 않도록 하기 위해, 이 절차 동안 마우스를 반드시 마취시켜야 합니다.

본 시연에서는 PBS를 접종하지만, 살아있는 박테리아를 다룰 때는 항상 기관에서 승인한 가이드라인에 따라 절차를 수행하십시오. 예를 들어, 대부분의 기관에서는 생물안전 2등급(BSL-2) 후드 내에서 군집 형성을 진행하도록 요구합니다. 종점 모니터링 방법의 일환으로 체중 지표를 사용하는 경우, 군집 형성 직후 MA를 측정하고 12~24시간마다 마우스의 무기력증, 털 거칠어짐, 체중 감소를 포함한 임상 증상을 모니터링하십시오.

마우스의 정착이 완료되면 원하는 기간 동안 유지합니다. 해당 기간이 종료되면 마우스를 안락사시키고 비강 세척을 수행하는데, 경추 탈구는 기관을 손상시킬 가능성이 있으므로 이러한 안락사 방법은 피해야 합니다.

비강 세척을 수행하기 전, 다음 준비물을 갖추었는지 확인하십시오. 미리 준비된 캐뉼라 바늘, 70% aqueous ethanol, 포셉 한 쌍, 정밀 이리스 가위 한 쌍, 인산완충생리식염수(PBS), RNA lysis buffer, 그리고 1 mL 에펜도르프 튜브입니다. 준비가 완료되면 동물을 똑바로 눕히고, 70% aqueous ethanol을 사용하여 목 부위를 중심으로 앞부분의 털을 소독합니다.

에탄올이 비강에 들어가지 않도록 주의합니다. 동물의 목 정중선을 따라 세로로 한 번 절개하여 기관을 확인할 수 있도록 개구부를 만듭니다. 피부를 양옆으로 조심스럽게 젖혀 아래의 목 조직이 드러나게 합니다.

이 단계에서 기관은 양측의 종근에 둘러싸여 보일 것입니다. 주변 혈관을 절단하지 않도록 주의하면서, 기관 자체를 명확하게 볼 수 있도록 이 근육들을 조심스럽게 절단하십시오. 실수로 혈관을 절단하여 진행 전 해당 부위에 혈액이 고여 있는 경우,

출혈이 멈출 때까지 기다린 후, 멸균 PBS를 분사하고 멸균 거즈를 사용하여 과잉 수분을 부드럽게 흡수함으로써 해당 부위를 여러 번 세척합니다. 기관이 적절하게 노출되면, 기관의 중간 지점에 횡방향의 반월형 절개를 가합니다. 캐뉼라 주사기에 멸균 PBS를 넣습니다.

삽입이 용이하도록 베벨(beveled edge) 끝이 아래를 향하게 하여 캐뉼라를 비강 방향의 기관으로 삽입합니다. 캐뉼라가 배치되면 180도 회전시킨 후, 가벼운 저항이 느껴질 때까지 부드럽게 위쪽으로 탐색합니다. 시료 수집용으로 지정된 EEND DPH 튜브를 마우스의 코 바로 아래에 배치합니다.

최소량의 PBS 세척액을 투여하여 캐뉼라가 정확하게 배치되었는지 확인합니다. 캐뉼라가 올바르게 배치되었다면, 마우스의 NAS 주변에 액체 방울이 형성되어야 합니다. 만약 테스트용 PBS가 동물의 입 밖으로 직접 흘러나온다면, 캐뉼라를 뒤로 뺀 다음 아주 약간의 저항이 느껴질 때까지 천천히 전방으로 탐색하며 다시 위치를 잡으십시오.

캐뉼라를 이 저항 지점 너머로 너무 깊게 밀어 넣지 않도록 주의하십시오. 그렇게 하면 비강 입천장을 지나 구강으로 진입하게 됩니다. 캐뉼라가 정확하게 위치했음을 확인한 후, 200 µL의 PBS를 빠르게 분주하여 최대한 많은 세포를 배출시키고 수집하십시오. 내용물은 마우스의 콧구멍을 통해 수집 튜브 안으로 흘러나와야 합니다.

샘플을 즉시 얼음에 둡니다. 이 샘플들은 이후 세균 부하 및 세포 모집 여부를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. RNA 분석용 샘플을 수집하려면, 500 µL의 RNA 용해 버퍼가 담긴 별도의 캐뉼라 바늘을 사용하여 2차 비강 세척을 수행하십시오.

RNA 용해 버퍼는 상피 세포를 박리시키고 주변 조직을 파괴하므로, 폐와 같은 장기에 접촉되지 않도록 주의해야 합니다. 비인두의 세균 부하량을 정량하기 위해 이러한 조직의 보존이 필요한 경우에는 다음의 과정이 필요합니다.

triptych soy egg가 포함된 미생물 배지 플레이트와 Epicor 튜브에 5% sheep's blood를 보충합니다. vortex mixer, PBS, 멸균 파이펫 팁, P 20 및 P 200 파이펫을 준비합니다. 먼저 BSL 2 후드 내에서 각 mirin 비강 세척액 샘플에 대한 단계 희석 시리즈를 준비합니다.

일반적으로 비인두 내 S pneumoniae의 농도는 0에서 10⁴ CFU 사이일 것으로 예상됩니다. 따라서 10배 단계 희석을 3회 수행하며, 첫 번째 튜브에 원액 상태의 비강 세척 시료 10 µL를 첨가하여 10⁻¹ CFU/mL 농도로 만들고, 세 개의 시료가 충분히 희석될 때까지 낮은 농도로 계속 희석합니다. 각 희석 단계 사이에는 충분히 볼텍싱하십시오. 이 영상은 시연 목적으로만 제작되었음을 참고하시기 바랍니다.

희석 단계마다 피펫 팁을 교체하는 것을 포함하여 적절한 실험실 기법을 항상 준수해야 합니다. 네임펜을 사용하여 논리 플레이트의 뒷면을 4등분하고, 각 구역에 도말할 해당 희석 배수를 표시합니다. 각 희석액의 10 µL 샘플 세 방울을 한천 배지에 도말합니다. 덮개를 열어둔 상태로 15분에서 30분 동안 건조시킨 후, 플레이트의 덮개를 닫고 폐렴구균 성장에 최적화된 조건(통상적으로 37 °C 및 5% CO2)의 세균 배양기에 뒤집어서 보관합니다.

이 플레이트들을 24~48시간 동안 배양합니다. 이 시간이 지난 후, 플레이트를 꺼내 플레이트에 형성된 콜로니 수의 평균을 구하여 정착 박테리아의 수를 결정합니다. 각 희석 단계에서, 박테리아가 한천배지의 혈액 보충제를 분해하여 각 콜로니 주변에 작은 후광 형태로 나타나는 알파 용혈 구역과 특유의 베이지색을 통해 animo 콜로니를 식별할 수 있습니다.

마지막으로, 각 콜로니 중심부에 작은 함몰 부위가 있어 적혈구와 같은 모양을 띱니다. 이 영상을 시청함으로써, 마우스의 비인두에 세균 정착을 유도하는 방법, 정착 후 비강 세척을 통해 마우스의 비인두에서 박테리아와 세포를 분리하는 방법, 그리고 미생물학적 기법을 사용하여 해당 박테리아 부하량을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이 영상에서 설명한 방법들이 연구가 미진한 이 부위에서 병원균에 대한 숙주 반응을 연구하기 위해 비강 내 정착 모델을 사용하는 데 도움이 되기를 바랍니다.